Mes premiers travaux de recherche, me permettant de soutenir une thèse de doctorat en décembre 1999, ont été effectués au sein du laboratoire du professeur Bernard GRANDCHAMP (unité 409 de l'INSERM) sous la direction du docteur Marie-Christine LECOMTE. Mon travail s'est intégré dans l'étude fonctionnelle et structurale de certains domaines des spectrines érythroïdes et non érythroïdes, principalement le site de tétramérisation et le domaine SH3. Concernant la tétramérisation de la spectrine érythroïde j'ai identifié les régions minimales nécessaires et suffisantes pour former le tétramère puis j'ai mis en évidence une relation entre certaines mutations de la spectrine associées à des anomalies membranaires du globule rouge et la sévérité du défaut de formation du tétramère. J'ai ensuite identifié plusieurs ligands du domaine SH3 de la spectrine non érythroïde. L'un d'entre eux m'a permis de définir une régulation de la protéolyse ciblée de cette spectrine faisant intervenir un mécanisme de phosphorylation/déphosphorylation. Ma formation initiale fut donc celle d'un biochimiste que j'ai étendue peu à peu vers la biologie moléculaire et la biologie cellulaire.<br />Puis, souhaitant acquérir les connaissances nécessaires au développement de modèles murins, j'ai décidé d'effectuer mon stage post-doctoral à l'Institut COCHIN (unité 567 de l'INSERM) dans une équipe co-dirigée par le docteur Sophie VAULONT et le professeur Axel KAHN. Je me suis ainsi familiarisé avec la souris comme « outil » de recherche (gestion d'un élevage, établissement de nouvelles lignées, génotypage, phénotypage). Je travaillais initialement sur le métabolisme du glucose mais j'ai complètement réorienté ma thématique de recherche au bout d'un an pour finalement identifier et caractériser une hormone, l'hepcidine, contrôlant l'homéostasie du fer.<br />J'ai été nommé chargé de recherche de grade 2 dans l'unité 409 de l'INSERM en octobre 2002 pour y développer une souche de souris exprimant une spectrine non érythroïde résistante à des mécanismes de protéolyse ciblée. Il s'agit donc toujours d'appréhender certaines fonctions des spectrines mais dans un contexte in vivo. En janvier 2005 j'ai intégré l'unité 665 de l'INSERM dirigée par Yves COLIN afin de poursuivre ce projet. Aujourd'hui, je suis chargé de recherche de grade 1.<br />Le chapitre scientifique de ce mémoire est divisé en deux parties distinctes : la première traite de mon travail sur la spectrine tandis que la seconde porte sur l'hepcidine. Chaque partie est composée d'une introduction au sujet suivie d'un résumé des travaux que j'ai effectués et/ou dirigés.

Ce travail a consisté à étudier des complexes de Fer (II) et plus particulièrement à décrire le phénoméne de piégeage d'états de spin excités par la lumière. La taille des molécules présentant cette propriété étant d'une centaine d'atomes, la théorie de la fonctionnelle de la densité (DFT) à été la méthode de choix. Au travers de cette étude, les limites d'application de la DFT aux complexes de Fer (II) ont été évaluées en les comparant à des calculs ab initio puis à des données expérimentales. Il a été mis en évidence que le terme d'échange des fonctionnelles l'échange-corrélation influence le plus la capacité à décrire Delta E_{HL} et Delta r_{HL}. La fonctionnelle OLYP de type GGA a permis d'obtenir la meilleure description de ces complexes. Les énergies à décrire étant de l'ordre de la précision chimique (kcal/mol), les fonctionnelles d'échange doivent être encore améliorées pour obtenir des résultats plus fiables.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Le fer est un cofacteur enzymatique indispensable à la survie de tous les eucaryotes. La biodisponibilité du fer est à ce point critique que des mécanismes homéostatiques sont enclenchés afin d'en réduire la consommation en période de carence. Cette stratégie a pour but d'économiser le fer et de le conserver pour des processus cellulaires fer-dépendants essentiels à la survie cellulaire. Chez la majorité des eucaryotes, la nature de ces mécanismes est toujours inconnue. Mes travaux de doctorat ont donc porté sur l'élucidation du mécanisme par lequel la levure modèle Schizosaccharomyces pombe parvient à limiter l'utilisation de son fer lorsque celui-ci se raréfie. Lors de mes travaux, j'ai identifié trois gènes codant pour des composantes fer-dépendantes chez S. pombe qui subissent une répression lors d'une carence en fer : pcl1[indice supérieur +], sdh4[indice supérieur +] et isa1[indice supérieur +]. Il a été déterminé que des éléments en cis de type CCAAT sont au centre de leur expression différentielle. Des évidences génétiques et biochimiques ont montré qu'un hétérocomplexe protéique formé des sous-unités Php2/3/4/5 est impliqué dans la régulation fer-dépendante de la transcription de pcl1[indice supérieur +], sdh4[indice supérieur +] et isa1[indice supérieur +]. Plus précisément, c'est la sous-unité Php4 qui est responsable de la répression de leur expression en carence de fer. Il s'avère aussi que la transcription du gène codant pour Php4 (php4[indice supérieur +]) est elle-même régulée par le statut en fer. Il a d'ailleurs été démontré que le facteur de transcription de type GATA Fep1 réprime l'expression de php4[indice supérieur +] en présence de fer, et ce, en s'associant à son promoteur de manière fer-dépendante. Une étude à large spectre à l'aide de micropuces à ADN a révélé que, lors d'une carence en fer, Php4 réprime la transcription d'un régulon composé de 86 gènes, dont la majorité codent pour des protéines fer-dépendantes ou des composantes impliquées dans l'homéostasie du fer. Parmi ceux-ci se trouve le gène codant pour le répresseur Fep1 (fep1[indice supérieur +]). Cette découverte a mis au jour une boucle de régulation réciproque entre les facteurs de transcription Fep1 et Php4. La capacité de Php4 à réprimer directement la transcription a été confirmée par des essais de type simple-hybride. Ces essais ont également démontré que la fonction de Php4 est inactivée post-traductionnellement en présence d'ions de fer. Php4 est donc un régulateur transcriptionnel capable de jauger les niveaux de fer intracellulaires. L'étude de la régulation de la fonction de Php4 par le fer a permis de découvrir que le répresseur Php4 se localise au noyau lors d'une déficience en fer, tandis qu'il est exporté vers le cytosol par l'exportine Crm1 en présence de fer. Cet exportation nucléaire fer-dépendante implique la glutarédoxine Grx4. L'action inhibitrice de Grx4 sur la fonction de Php4 ne se limite pas à la régulation de sa localisation cellulaire. J'ai pu démontrer qu'en présence de fer, l'activité transcriptionnelle de Php4 est directement inhibée au noyau par Grx4. Cette régulation de Php4 par Grx4 s'avère directe étant donné l'association de ces deux protéines in vivo chez S. pombe. En conclusion, j'ai découvert que le répresseur Php4 est un élément central de la régulation de l'utilisation du fer chez la levure fissipare S. pombe . La découverte du rôle de Grx4 dans la régulation post-traductionnelle de Php4 pave la voie à l'élucidation d'un sentier signalétique par lequel une cellule eucaryote communique son statut en fer à ses régulateurs homéostatiques. La biodisponibilité du fer étant un facteur de virulence majeur chez les levures pathogènes, l'acquisition de nouvelles connaissances quant à la régulation de l'homéostasie du fer chez les mycètes devient cruciale pour le développement de nouveaux agents antifongiques.

L'objectif de mes travaux de doctorat était d'approfondir les connaissances sur le mode d'action du répresseur transcriptionnel Fep1 et de découvrir les mécanismes posttraductionnels par lesquels son activité serait régulée. Mes travaux ont été entrepris dans un contexte génétique php4[delta], où la régulation Php4-dépendante a été abolie. Ceci a permis d'exprimer Fep1 constitutivement et par conséquent d'étudier les effets directs du fer sur la protéine en la découplant de sa régulation transcriptionnelle par Php4. Dans le but de mieux caractériser la fonction de liaison à l'ADN de Fep1 dans un contexte in vivo, j'ai procédé par une approche d'immunoprécipitation de la chromatine (ChIP). Grace à une protéine de fusion TAP-Fep1, j'ai démontré que Fep1 s'associe à la chromatine de manière fer-dépendante. En utilisant différentes versions mutantes de la protéine TAP-Fep1, j'ai démontré que la région N-terminale de Fep1 est requise pour la liaison à la chromatine, cette région couvrant les 241 premiers acides aminés. Le rôle de la région C-terminale serait d'assurer la répression transcriptionnelle des gènes cibles étant donné qu'elle s'associe avec les corépresseurs Tup. Au niveau de la région N-terminale de Fep1, plusieurs motifs sont nécessaires pour une liaison optimale de Fep1 à la chromatine, notamment, deux doigts de zinc (ZF1 et ZF2) et une région riche en résidus cystéines (CRD). Lorsque la région 1-241 est fusionnée au domaine VP16 de transactivation, cette nouvelle protéine agit comme un activateur fer-dépendant, ce qui suggère que le domaine de liaison à la chromatine de Fep1 agit de façon modulaire et ce, indépendamment de la région C-terminale de la protéine. Afin d'élucider le mécanisme post-traductionnel impliqué dans l'inactivation de Fep1 en situation de carence de fer, j'ai procédé par une approche génétique. Grâce à une délétion du gène qui code pour la monothiolglutarédoxine Grx4, j'ai pu démontrer son rôle dans l'inactivation de Fep1 en réponse à la carence en fer. En effet, dans une souche grx4A, Fep1 agit comme un répresseur transcriptionnel constitutif. J'ai pu démontrer que la présence de Grx4 est nécessaire pour assurer le relargage de Fep1 de la chromatine en réponse à la carence en fer. La monothiolglutarédoxine, Grx4, est caractérisée par la présence de deux domaines fonctionnels: un domaine en N-terminal appelé thiorédoxine (TRX) et un domaine C-terminal appelé glutarédoxine (GRX). L'étude d'interaction de Fep1 avec Grx4 a révélé que le domaine TRX interagit avec la région C-terminale de Fep1 et ce, de manière constitutive. Par contre, le domaine GRX de Grx4 s'associe avec la région N-terminale de Fep1 et ce, d'une manière fer-dépendante. De plus, dans une souche grx4[delta], le domaine GRX s'est révélé être nécessaire à la fonction d'inhibition de Fep1 en réponse à la carence en fer. Le régulateur Fep1 possède plusieurs homologues fonctionnels potentiels chez les levures filamenteuses pathogènes, notamment Sfu1 chez Candida albicans. Grâce à l'expression de la protéine Sfu1 dans une souche fep1[delta], nous avons révélé le haut degré de conservation entre ces deux facteurs de transcription. En effet, l'expression hétérologue de Sfu1 dans S. pombe restaure tous les phénotypes observés suite à l'inactivation du gène fep1[indice supérieur +]. En conclusion, durant mes travaux de doctorat, j'ai caractérisé des déterminants moléculaires qui dictent la fonction du répresseur transcriptionnel Fep1. Ainsi, j'ai déterminé des régions nécessaires de Fep1 qui assurent sa liaison à la chromatine. J'ai aussi identifié un nouveau mécanisme de régulation post-traductionnelle de Fep1 faisant intervenir la monothiolglutarédoxine Grx4. De plus, j'ai démontré le potentiel qu'offre la compréhension des mécanismes de régulation de l'homéostasie du fer chez la levure à fission, puisque ce modèle peut être transposé jusqu'à un certain degré aux autres levures pathogènes, notamment, C. albicans. Enfin, étant donné l'importance de l'assimilation du fer pour le pouvoir infectieux de plusieurs levures pathogènes, il devient évident que les modes de régulation de l'acquisition du fer doivent être élucidés afin de contrer les levures pathogènes"--Résumé abrégé par UMI

Les variations de l'environnement peuvent influer sur le métabolisme de la plante, notamment à travers la formation des espèces oxygénées réactives (EOR) nocives à forte concentration. Des systèmes enzymatiques vont dégrader ces EOR mais aussi réparer les molécules oxydées par ces réactifs. Ils sont composés notamment de peroxydases (glutathion peroxydases utilisant les thiorédoxines comme réducteur, et les peroxyrédoxines utilisant les glutarédoxines et les thiorédoxines pour leur régénération) dont l'activité s'appuie sur des échanges dithiol-disulfure. Ces systèmes présentent une complexité liée à l'existence de familles multigéniques. Des hybrides Prx-Grx actifs ont été produits de façon recombinante, donnant des indications sur les interactions entre Prx et Grx. Les études enzymatiques réalisées sur les Prx IIF et IIE ont montré qu'elles sont capables de réduire de nombreux substrats autres que le peroxyde d'hydrogène avec des efficacités variables. De plus, leurs localisations tissulaires sont différentes ainsi que leurs réactions en réponse à divers stress oxydant. Outre leur fonction de réducteurs, les glutarédoxines pourraient participer aussi à la signalisation par le mécanisme de glutathionylation, impliqué dans la protection de cystéines critiques par fixation d'une molécule de glutathion. Un rôle nouveau est apparu, elles aident à la formation et l'intégration des centres fer-soufre et participent donc à la maturation des protéines fer-soufre. Les Grxs chloroplastiques S14 et S16 intègrent de façon naturelle un centre fer-soufre et complémentent des mutants de levure déficients en Grx5, une glutarédoxine CGFS nécessaire pour l'assemblage des centres fer-soufre. Enfin, la GrxS14 est capable de transférer efficacement son centre à une molécule acceptrice. Ces résultats nous permettent de mieux comprendre la redondance des ces familles : ces systèmes modulent différents processus physiologiques, dont certains encore inconnus, en réponse au stress oxydant / Environment variations can modify plant metabolism in particular by production of reactive oxygen species (ROS) which are harmfull at high level. Enzymatic systems are to degrade these ROS but also repair oxidized molecules. They are composed by peroxidases (thioredoxins-reduced glutathione peroxidases and thioredoxin or glutaredoxin-reduced peroxiredoxins) using dithiol exchange for their activity. These systems present a complexity according to their multigenic family origin. Recombinant Prx-Grx hybrids have been produced giving clue to interactions between Prx and Grx. Enzymatic studies showed Prx IIF and IIE can reduced a wide range of substrates other than hydrogen peroxide, with variable activity. Furthermore they are not found identically in plant tissue and react to oxidative stress in different ways. Besides reducing properties Grx could participate in cell signalling by glutathionylation, mechanism which protects cystein by fixating a molecule of GSH. A new role appeared recently, they help production of iron-sulfur cluster and play a role in iron-sulfur proteins maturation. Plastidials S14 and S16 Grxs can naturally bind an iron-sulfur cluster and complement Grx5 (CGFS Grx known entering in iron-sulfur proteins maturation) deficient mutants yeast. Finally GrxS14 is able to transfer efficiently his cluster to accepting molecule. These results allow us understanding better these multigenic families regulating several physiological processes, some still unknown, in oxidative stress

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Le séléniure de fer, FeSe, est un matériau prometteur qui attire beaucoup d'attention depuis qu'il a décroché le record de la température critique la plus élevée chez les supraconducteurs à base fer. L'absence d'une phase magnétique à proximité de sa phase supraconductrice cause un questionnement sur la nature du mécanisme d'appariement des électrons dans ce supraconducteur. La symétrie avec laquelle ce mécanisme opère peut être déterminée en identifiant la structure et la symétrie du gap supraconducteur du FeSe. Plusieurs études du gap ont été menées, mais elles n'ont pas permis d'arriver à un consensus. Certaines mesures détectent des noeuds dans le gap supraconducteur tandis que d'autres rapportent un gap non nodal. L'incapacité à réconcilier les données existantes est en partie due au manque de mesures effectuées sur des monocristaux propres étant capables de résoudre des excitations à très basse énergie. Ce mémoire présente une étude du gap supraconducteur du FeSe utilisant la mesure de la conductivité thermique dans la limite où la température tend vers zéro comme sonde. Dans ce régime de température, il a été possible d'examiner les excitations à très faible énergie de l'état supraconducteur à l'aide d'un champ magnétique finement ajusté. De cette manière, un portrait très détaillé de la dispersion en énergie des quasiparticules a été dressé. Nous ne détectons pas de quasiparticules à énergie nulle et excluons donc la présence de noeuds sur le gap supraconducteur. Nous observons un comportement de supraconducteur à deux bandes, suggérant que les deux poches de la surface de Fermi ont des gaps différents dont les amplitudes diffèrent par un facteur 10. De plus, la grandeur du plus petit de ces deux gaps varie lorsque le niveau de désordre du matériau change, ce qui suggère que le petit gap est anisotrope. Cette dernière observation permet de réconcilier les études antérieures puisqu'une anisotropie du gap peut engendrer des noeuds accidentels sur le gap si le niveau de désordre du matériau est suffisament bas. Quelques études très récentes, parues en même temps que les résultats présentés ici, corroborent le scénario proposé et sont présentées à la fin du mémoire.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Dans ce travail de thèse, nous avons étudié le transport du fer dans la plante, en nous focalisant sur la dernière étape de circulation : le remplissage de la graine. Il nous a paru important de comprendre 1- comment le fer arrive à la graine, 2- la manière dont il est délivré à l'embryon en développement, 3- sous quelles formes et 4- où et comment il est stocké dans l'embryon. Nous avons choisi de nous appuyer sur deux espèces modèles: Pisum sativum pour les approches de biochimie et Arabidopsis thaliana pour les approches de génétique. Le pois a été choisi car ses graines sont de grande taille et ont la particularité d'accumuler un albumen liquide qui sert de soutien nutritionnel pour l'embryon. Le point de départ de ce projet est l'étude de la spéciation du fer, c'est-à-dire l'identification des ligands du fer, dans cet albumen. Sur la base de la connaissance des complexes de fer circulant jusqu'à la graine, nous avons proposé de nouvelles fonctions physiologiques. La grande taille des cellules de pois a permis d'étudier la localisation du fer et sa spéciation in situ, à l'échelle subcellulaire. Chez Arabidopsis, nous avons étudié le rôle de deux gènes candidats, potentiellement impliqués dans le transport du fer vers la graine. / In this work, we studied iron transport in plants and we focused on the last circulation step: the seed filling. It seemt important to understand 1- how iron is arriving to the seeds, 2- the way it is delivered to developping embryos, 3- in which form and 4- where and how it is stored in embryos.To adress these questions, we used two model species: Pisum sativum for biochemical approaches and Arabidopsis thaliana for genetic approaches. Pea was choosen because of the large size of its seeds, and their characteristic to accumulate a liquid endosperm that feed embryos.The project started with the study of iron speciation, meaning the identification of iron ligands, in this endosperm. On the basis of the knowledge of the iron complexes arriving to seeds, we highlighted new physiological functions. The large size of pea cells also allowed us to study iron localization and in situ speciation, at subcellular level. In Arabidopis, we studied the role of two candidate genes putatively involved in iron transport to seeds.