Orientador: Francisco Maugeri Filho / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-04T01:06:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Atala_DanielIbraimPires_D.pdf: 6342547 bytes, checksum: 1a6eb0862bc84e3b0495d542783eb95f (MD5) Previous issue date: 2004 / Doutorado / Doutor em Engenharia de Alimentos

A ciclodextrina glicosiltransferase [E.C. 2.4.1.19; CGTase] é uma enzima industrialmente importante, usada para produzir ciclodextrinas. Neste trabalho foi utilizado o planejamento experimental e a metodologia de superfície de resposta a fim de identificar as melhores condições para a produção de CGTase pela bactéria alcalófila Bacillus circulans. As melhores condições de temperatura e pH, para a produção de CGTase foram, respectivamente, 36 ºC e 9,7. Em seguida, utilizando estes parâmetros otimizados, a produção de CGTase foi avaliada em cultivos submersos, batelada e batelada alimentada, e em cultivo semi-sólido (CSS), usando um resíduo fibroso de soja (SIFR) como substrato. Nos cultivos em batelada, a atividade máxima de CGTase obtida foi de 1155 U.mL-1, em aerobiose. A produção de CGTase foi bastante influenciada pelo fluxo de ar e pela agitação, sendo que uma alta produtividade enzimática (155 U.(mLh)-1) foi obtida em condições de aeração moderada (400 rpm para a velocidade de agitação e 1,7 vvm para o fluxo de ar). Com estes parâmetros otimizados, a produtividade de CGTase obtida em cultivo em batelada alimentada foi de 137 U.(mLh)-1, com uma taxa de alimentação de 0,17 g.(Lh)-1. O crescimento celular e a síntese de CGTase, usando o resíduo fibroso de soja como substrato apresentou um rendimento de 32.776 U.g(SIFR) -1. As diferentes abordagens utilizadas neste trabalho poderão ser aplicadas para a produção de outras enzimas amilolíticas e também para a produção de CGTase com outros substratos. / Cyclodextrin glycosyltransferase [E.C. 2.4.1.19; CGTase] is an industrially important enzyme, which is used to produce cyclodextrins. In this study we report the use of experimental factorial design and response surface methodology to find the best conditions for CGTase production by alkaliphilic Bacillus circulans. The optimized calculated values for the tested variables were pH 9.7 and temperature 36oC. The CGTase production was further studied with the optimized process parameters on submerged cultivations (SC), batch or fedbatch, and solid-state cultivations (SSC) using soybean industrial fibrous residue (SIFR). The maximum CGTase activity obtained on batch cultivation was 1,155 U.mL-1 under aerobic conditions. The CGTase production was strongly affected by air flow rate and agitation speed, showing high enzyme productivity (155 U.mL-1h-1) under moderate conditions of aeration (400 rpm for speed agitation and 1.7 vvm for air flow rate). With these optimized process parameters, CGTase productivity obtained on fed-batch cultivations was 137 U.mL-1h-1, with feeding rate at 0.17 g.L-1h-1. Cell growth and CGTase synthesis in SSC using soybean industrial fibrous residue as substrate was excellent, with CGTase yield of 32,776 U.g(SIFR) -1. The different approaches used in this study may also find applications for the production of other starch-converting enzymes and also for other CGTase-producing substrates.

A ciclodextrina glicosiltransferase [E.C. 2.4.1.19; CGTase] é uma enzima industrialmente importante, usada para produzir ciclodextrinas. Neste trabalho foi utilizado o planejamento experimental e a metodologia de superfície de resposta a fim de identificar as melhores condições para a produção de CGTase pela bactéria alcalófila Bacillus circulans. As melhores condições de temperatura e pH, para a produção de CGTase foram, respectivamente, 36 ºC e 9,7. Em seguida, utilizando estes parâmetros otimizados, a produção de CGTase foi avaliada em cultivos submersos, batelada e batelada alimentada, e em cultivo semi-sólido (CSS), usando um resíduo fibroso de soja (SIFR) como substrato. Nos cultivos em batelada, a atividade máxima de CGTase obtida foi de 1155 U.mL-1, em aerobiose. A produção de CGTase foi bastante influenciada pelo fluxo de ar e pela agitação, sendo que uma alta produtividade enzimática (155 U.(mLh)-1) foi obtida em condições de aeração moderada (400 rpm para a velocidade de agitação e 1,7 vvm para o fluxo de ar). Com estes parâmetros otimizados, a produtividade de CGTase obtida em cultivo em batelada alimentada foi de 137 U.(mLh)-1, com uma taxa de alimentação de 0,17 g.(Lh)-1. O crescimento celular e a síntese de CGTase, usando o resíduo fibroso de soja como substrato apresentou um rendimento de 32.776 U.g(SIFR) -1. As diferentes abordagens utilizadas neste trabalho poderão ser aplicadas para a produção de outras enzimas amilolíticas e também para a produção de CGTase com outros substratos. / Cyclodextrin glycosyltransferase [E.C. 2.4.1.19; CGTase] is an industrially important enzyme, which is used to produce cyclodextrins. In this study we report the use of experimental factorial design and response surface methodology to find the best conditions for CGTase production by alkaliphilic Bacillus circulans. The optimized calculated values for the tested variables were pH 9.7 and temperature 36oC. The CGTase production was further studied with the optimized process parameters on submerged cultivations (SC), batch or fedbatch, and solid-state cultivations (SSC) using soybean industrial fibrous residue (SIFR). The maximum CGTase activity obtained on batch cultivation was 1,155 U.mL-1 under aerobic conditions. The CGTase production was strongly affected by air flow rate and agitation speed, showing high enzyme productivity (155 U.mL-1h-1) under moderate conditions of aeration (400 rpm for speed agitation and 1.7 vvm for air flow rate). With these optimized process parameters, CGTase productivity obtained on fed-batch cultivations was 137 U.mL-1h-1, with feeding rate at 0.17 g.L-1h-1. Cell growth and CGTase synthesis in SSC using soybean industrial fibrous residue as substrate was excellent, with CGTase yield of 32,776 U.g(SIFR) -1. The different approaches used in this study may also find applications for the production of other starch-converting enzymes and also for other CGTase-producing substrates.

A ciclodextrina glicosiltransferase [E.C. 2.4.1.19; CGTase] é uma enzima industrialmente importante, usada para produzir ciclodextrinas. Neste trabalho foi utilizado o planejamento experimental e a metodologia de superfície de resposta a fim de identificar as melhores condições para a produção de CGTase pela bactéria alcalófila Bacillus circulans. As melhores condições de temperatura e pH, para a produção de CGTase foram, respectivamente, 36 ºC e 9,7. Em seguida, utilizando estes parâmetros otimizados, a produção de CGTase foi avaliada em cultivos submersos, batelada e batelada alimentada, e em cultivo semi-sólido (CSS), usando um resíduo fibroso de soja (SIFR) como substrato. Nos cultivos em batelada, a atividade máxima de CGTase obtida foi de 1155 U.mL-1, em aerobiose. A produção de CGTase foi bastante influenciada pelo fluxo de ar e pela agitação, sendo que uma alta produtividade enzimática (155 U.(mLh)-1) foi obtida em condições de aeração moderada (400 rpm para a velocidade de agitação e 1,7 vvm para o fluxo de ar). Com estes parâmetros otimizados, a produtividade de CGTase obtida em cultivo em batelada alimentada foi de 137 U.(mLh)-1, com uma taxa de alimentação de 0,17 g.(Lh)-1. O crescimento celular e a síntese de CGTase, usando o resíduo fibroso de soja como substrato apresentou um rendimento de 32.776 U.g(SIFR) -1. As diferentes abordagens utilizadas neste trabalho poderão ser aplicadas para a produção de outras enzimas amilolíticas e também para a produção de CGTase com outros substratos. / Cyclodextrin glycosyltransferase [E.C. 2.4.1.19; CGTase] is an industrially important enzyme, which is used to produce cyclodextrins. In this study we report the use of experimental factorial design and response surface methodology to find the best conditions for CGTase production by alkaliphilic Bacillus circulans. The optimized calculated values for the tested variables were pH 9.7 and temperature 36oC. The CGTase production was further studied with the optimized process parameters on submerged cultivations (SC), batch or fedbatch, and solid-state cultivations (SSC) using soybean industrial fibrous residue (SIFR). The maximum CGTase activity obtained on batch cultivation was 1,155 U.mL-1 under aerobic conditions. The CGTase production was strongly affected by air flow rate and agitation speed, showing high enzyme productivity (155 U.mL-1h-1) under moderate conditions of aeration (400 rpm for speed agitation and 1.7 vvm for air flow rate). With these optimized process parameters, CGTase productivity obtained on fed-batch cultivations was 137 U.mL-1h-1, with feeding rate at 0.17 g.L-1h-1. Cell growth and CGTase synthesis in SSC using soybean industrial fibrous residue as substrate was excellent, with CGTase yield of 32,776 U.g(SIFR) -1. The different approaches used in this study may also find applications for the production of other starch-converting enzymes and also for other CGTase-producing substrates.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:20Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-11-16Bitstream added on 2014-06-13T19:14:40Z : No. of bitstreams: 1 silva_rr_me_sjrp.pdf: 961028 bytes, checksum: 0d7989443c42fd25745d208364a42a88 (MD5) / A produção de proteases de origem microbiana depende das condições de cultivo e da diversidade bioquímica de cada espécie. Estudos comparativos entre fermentação em estado sólido (FES) e fermentação submersa (FSm) usando farelo de trigo e meio sintético, respectivamente, foram realizados para a determinação dos parâmetros de produção de proteases pelo fungo Aspergillus fumigatus Fresenius. A melhor produção de protease foi em FES no período de 96 horas utilizando farelo de trigo, temperatura de 30 ºC e 1x106 esporos/5g de substrato com 1.517 U/mL. Em FSm o pico de produção foi em pH 6,0, a 30ºC, 5x105 esporos/mL de meio no período de 72 e 96 horas em meio contendo 0,5 e 0,25% de caseína, respectivamente, ambos com 40 U/mL. Conforme a produtividade dos processos fermentativos, o extrato enzimático da FES foi utilizado para estudos de purificação e caracterização bioquímica. Neste estudo, a protease purificada apresentou atividade ótima em pH 7,5 e 50ºC, sendo inibida por Fenil-metil-sulfonil-fluoreto (PMSF) e mais intensamente por antipaína (1,6 µM). Sobre efeito de íons, foi observado modulação da atividade proteolítica, principalmente com inibição por AlCl3, cuja atividade proteolítica residual foi de 18% após incubação com este íon. Na presença de Ditiotreitol (DTT) e uréia houve diminuição da atividade proteolítica, apresentando atividades residuais de 63% em 200 mM de DTT e 10% com 5 M de uréia. Comparativamente, na concentração de 0,1% de cada surfactante estudado, notou-se redução da atividade proteolítica, sendo 97% em presença de Brometo de cetil-trimetil amônio (CTAB), 79% para 4 - (1,1,3,3 - Tetrametilbutil) fenil- polietileno glicol (Triton X-100), 55% com Polyoxyethylenesorbitan monolaurato (Tween-20) e completa redução da atividade (0%) em... / The microbial protease production depends on growing conditions and the biochemical diversity of each species. Comparative studies between solid-state fermentation (SSF) and submerged fermentation (SmF) using wheat bran and synthetic medium, respectively, were performed to determine the optimum parameters for protease production by the fungus Aspergillus fumigatus Fresenius. The best protease production was in SSF within 96 hours using wheat bran, temperature 30°C and 1x106 spores/5g of substrate, with 1,517 U/mL. In SmF peak production was at pH 6.0 at 30°C, 5x105 spores/mL of media within 72 and 96 hours in medium containing 0.5 and 0.25% casein, respectively, with 40 U/mL. According to the productivity of the fermentative processes, enzymatic extract was used from SSF to study purification and biochemical characterization. In this study, purified protease showed optimum activity at pH 7.5 and 50°C, and inhibited by Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) and more intensely for antipain (1,6 µM). Concerning to the effect of ions, we observed modulation of the proteolytic activity, especially with inhibition by AlCl3, which residual activity was of 18 % after incubation with this ion. In the presence of Dithiothreitol (DTT) and ureia, we observed progressive decrease in proteolytic activity, presenting residual activities of 63% with 200 mM DTT, and 10% with 5 M ureia. Comparatively, in the concentration of 0.1% of each surfactant studied, there was a reduction in the proteolytic activity in 97% in presence of Cetyl trimethylammonium bromide (CTAB), 79% with 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol (Triton X-100), 55% with Polyoxyethylenesorbitan monolaurate (Tween-20) and a complete inactivation in the presence of Sodium dodecyl sulfate... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:56:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2364.pdf: 1102875 bytes, checksum: b267e8f11265cae314ce120c5c408adf (MD5) Previous issue date: 2008-10-30 / The yield ethanol (hP) is one of the most important parameters to be evaluated in the industrial process of alcohol fermentation. Because most plants neither present a reasonable level of automation, nor perform frequent analytical measures during the batch, the hP is currently calculated by methodology based on by-products formed in the process. Such calculation is questioned as to its accuracy because it almost always presents high values of hP. Still, with regard to the process of alcohol fermentation, the kinetic modeling of the fermentation process has been studied extensively. However, the proposed models have not properly represented the industrial process in which the fermenter initially containing the inoculum ( preculture ) is fed with a flow of wort (feeding culture medium) until its filling, following the fermentation, in batch, until the substrate exhaustion. The aim of the present study is propose a new methodology for calculating the yield ethanol (hP) based on material balances. The hP results obtained in the pilot plant (80.5 to 87.9%) and industrial plant (84.2 and 92.1%) presented by the new method tracks near values. However, values of hP obtained by the present methodology were lower than those obtained by the traditional by-products method, currently used by almost all sugar and alcohol mills. Still, a kinetic model was proposed to describe the conventional process of fermentation considering the existence of two cellular performances during the process, with regard to the consumption of substrate and to the production of ethanol. The model properly described the performance of the concentration of cells (CX), substrate (CS) and ethanol (CP) over all cultures, showing that the assumptions considered when preparing the model were concerned about the reality of the phenomenon observed. Finally, estimated values of kinetic parameters of the proposed model showed little variation in different cultures as well as values within a range of literature. / O rendimento em etanol (hP) é um dos parâmetros mais importantes a ser avaliado no processo industrial de fermentação alcoólica. Devido ao fato da maioria das usinas não apresentar um nível de automação razoável, nem realizar medidas analíticas freqüentes durante as bateladas, o hP é atualmente calculado por metodologia baseada nos subprodutos formados no processo, cálculo questionado quanto a sua precisão, pois gera quase sempre altos valores de hP. Ainda, no que diz respeito ao processo de fermentação alcoólica, a modelagem cinética do processo fermentativo tem sido estudada extensivamente. No entanto, os modelos propostos não têm representado adequadamente o processo industrial no qual a dorna inicialmente contendo o inóculo ( pé de cuba ) é alimentada com uma vazão de mosto até seu enchimento, seguindo a fermentação, em batelada, até o término do substrato. O presente trabalho teve como objetivo principal a proposta de uma nova metodologia de cálculo do rendimento em etanol (hP) com base nos princípios de balanço material. Os resultados de hP obtidos na planta piloto (80,5 a 87,9%) e na industrial (84,2 e 92,1%) pela nova metodologia apresentaram faixas próximas de valores. No entanto, estes valores obtidos de hP foram inferiores àqueles obtidos pela metodologia tradicional por subprodutos, utilizada atualmente pela quase totalidade das usinas de açúcar e álcool. Ainda, foi proposto um modelo cinético para descrever o processo convencional de fermentação alcoólica considerando a existência de dois comportamentos celulares ao longo do processo, no que diz respeito ao consumo de substrato e à produção de etanol. O modelo descreveu adequadamente os comportamentos das concentrações de células (CX), substrato (CS) e de etanol (CP) ao longo de todos os cultivos, mostrando que as hipóteses consideradas na elaboração do modelo foram pertinentes quanto à realidade do fenômeno observado. Por fim, os coeficientes cinéticos estimados do modelo proposto apresentaram uma pequena variação nos diferentes cultivos, bem como valores dentro de uma faixa de literatura.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / This work presents as objective to study the simultaneous influence of pH, temperature and sulphite concentration on situations comprising stress situations for the yeast on the alcoholic fermentation by the use of a central composite design (CCD). The yeast Saccharomyces cerevisiae Y-940 was used and the experiments were carried out in a temperature and agitation controlled mixture reactor with a useful volume of 2L. The conditions defined on the CCD were: temperature ranging from 21.5 to 48.5ºC, pH ranging from 1.5 to 5.5 and sulphite concentration ranging from 0 to 345mg/L. The fermentations were accompanied throughout time by sucrose, ethanol, glycerol and cells concentrations and, by the end of 12 hours, cell viability and trehalose concentration were determined as well. From the obtained data, cell viability, the final amount of intracellular trehalose, ethanol yield and productivity and glycerol yield were analyzed as responses. The variables values that maximized the cell viability were temperature ranging from 21.5 to 31ºC, pH ranging from 3.2 to 4.2 and sulphite concentration from 0 to 45mg/L. For the final amount of trehalose, the temperature interval that maximized the response ranged from 23.5 to 38ºC, the pH ranging from 3.5 to 4.6 and the sulphite concentration ranging from 0 to 90mg/L. To achieve the maximum ethanol yield (g/g), the temperature ranged from 32.5 to 39ºC, the pH ranged from 3.5 to 4.3 and the sulphite concentration from 0 to 90 mg/L. The ethanol maximum productivity (g/L.h) was attained in a temperature of 33.5ºC, in a pH of 3.9 and in absence of sulphite. The conditions for a maximum glycerol yield were: 48.5ºC, pH of 5.5 and a sulphite concentration of 345 mg/L. With the objective of investigating the sulphite effect on fermentation with a greater level of detail, additional experiments were conducted by adopting conditions that allowed to evaluate the isolated effect of sulphite on fermentations, allowing to reach the conclusion that greater sulphite concentrations generates a high glycerol yield and lowers ethanol productivity and cell viability. The fermentation kinetic at the point defined as optimal by analyzing the CCD responses was well adjusted to the model proposed by Ghose and Thiagy. The found μmax parameter was 0,15h-1, Ks of 3,31g/L, Ki of 135,87g/L and a Pm of 84,23g/L. / O presente trabalho teve como objetivo estudar a influência conjunta do pH, temperatura e concentração de sulfito em condições que englobaram situações de estresse para levedura na fermentação alcoólica, utilizando um planejamento composto central (PCC). Foi utilizada a levedura Saccharomyces cerevisiae Y-940, sendo os ensaios conduzidos em um reator de mistura com volume útil de 2L, com controles de temperatura e agitação. As condições definidas pelo PCC foram: temperatura na faixa de 21,5 a 48,5°C; pH de 1,5 a 5,5 e a concentração de sulfito de 0 a 345 mg/L. As fermentações foram acompanhadas ao longo do tempo pelas medidas de concentrações de sacarose, etanol, glicerol e células e, ao final de 12h, foram determinadas, também, a viabilidade celular e a concentração de trealose, sendo analisadas como respostas a viabilidade celular, a quantidade final de trealose intracelular, o rendimento e produtividade de etanol e rendimento em glicerol. As faixas das variáveis que maximizaram a viabilidade celular foi temperatura de 21,5 a 31ºC, de pH de 3,2 a 4,3, e concentração de sulfito de 0 a 45 mg/L. Para a quantidade final de trealose, o intervalo da temperatura que maximizou a resposta foi de 23,5 a 38ºC, o pH, de 3,5 a 4,6 e a concentração de sulfito, de 0 até 90mg/L. Para atingir o máximo rendimento em etanol (g/g) a faixa de temperatura foi de 32,5 a 39°C, o pH de 3,5 a 4,3 e a concentração de sulfito de 0 a 90mg/L. A máxima produtividade de etanol (g/L.h) foi obtida nas condições de temperatura de 33,5ºC, pH de 3,9 e na ausência de sulfito. As condições para o máximo rendimento de glicerol foram: temperatura de 48,5°C, pH 5,5 e concentração de sulfito 345mg/L. Com o objetivo de se investigar mais detalhadamente o efeito do sulfito na fermentação foram realizados experimentos complementares, adotando-se condições que permitiram avaliar o efeito isolado do sulfito na fermentação e concluiu-se que maiores concentrações de sulfito no meio geram maior rendimento em glicerol e menores produtividade de etanol e viabilidade celular. A cinética da fermentação no ponto definido como ótimo pelas análises das repostas do PCC se ajustou bem ao modelo proposto por Ghose e Thiagy. O parâmetro μmax encontrado foi de 0,15h-1, Ks de 3,31g/L, Ki de 135,87g/L e o Pm de 84,23g/L. / Mestre em Engenharia Química

Made available in DSpace on 2015-04-20T12:31:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Raimundo Felipe da Cruz Filho.pdf: 1412659 bytes, checksum: aba20cdd1aa35484f5932ead0d0bc3e7 (MD5) Previous issue date: 2013-04-18 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The fibrinolytic proteases degrade fibrin clots and therefore play an important role in the pharmaceutical industry as chemotherapeutic agents in the treatment of cardiovascular diseases. These biocatalysts were gradually discovered from plants, insects, earthworms, snakes and microorganisms (bacteria and fungi). Cardiovascular disease has been one of the leading causes of death in the world. A major cause of heart disease is the accumulation of fibrin in the arteries, causing thrombosis. According to the World Health Organization (WHO), about 17.5 million people will die of cardiovascular disease this year, and in 2030, this amount will be 23.6 million. Given the great potential of microbial biodiversity and the growing regional Amazon applicability of enzymes in the production of drugs, this research was conducted with the objective to (1) evaluate the growth of Bacillus stearothermophilus, (2) establish growth parameters associated with production of fibrinolytic proteases in submerged fermentation and (3) assess the effect of the extractive fermentation in the separation of these enzymes. In this study techniques of extractive fermentation and solid-state fermentation were employed. By submerged fermentation the following parameters were determined: Profile of growth of Bacillus stearothermophilus and the production of protease using 100 mL of the liquid medium [(g / L) 2 g KH2PO4, (NH4)2SO4 1 g, MgSO4 7H2O 0,1 g Na2HPO4 2H2O 0,9 g, yeast extract 1 g, distilled water 1000 ml] pH 7.2 supplemented with 0.5% gelatin in an 500 mL Erlenmeyer flask. The growth of the bacteria was determined at 610 nm, once every 2 hours for 36 hours. To determine the best conditions for the production of proteases were evaluated the influence of pH, stirring and temperature, age of inoculum and substrate concentration, the influence of natural sources of carbon (tapioca, arraruta and crueira), nitrogen sources and aeration. In the recovered extract was also performed a toxicity bioassay in Artemia salina and degradation tests in vitro of the blood clot by the fibrin plate method and the artificial clot degradation in tube. In addition, the partition coefficient (K), the purification factor (PF) and recovering the enzyme were determined. The solid-state fermentation was performed using as substrate 10g of manteiguinha bean [Vigna unguiculata (L.) Walp] with 60% humidity, pH 5.0 in a 250 ml Erlenmeyer flask. In extractive fermentation the best conditions were pH 5.0, 180 rpm and 25 °C in systems using PEG 1000 (g/mol-1) to 20% (w/w) and phosphate salts 15% (w/w) with K 1.05; FP 1.00; 152.54 Y. 34 mm halo in fibrin plate and partial degradation of the clot in tube. In the solid-state fermentation, the production of protease was 8.87 (U/mL), 23 mm of translucent halo in fibrin plate with total degradation of the blood clot in 24 hours. In this study, protease produced from Bacillus stearothermophilus by extractive fermentation and semi-solid fermentation was evaluated, showing in the optimum cultivation conditions that this microorganism presents physiology for industrial application in the production of the fibrinolytic protease / As proteases fibrinolíticas degradam coágulos de fibrina, por isso têm um importante papel na indústria farmacêutica como agentes quimioterapêuticos no tratamento de doenças cardiovasculares. Estes biocatalisadores foram descobertos gradualmente a partir de plantas, insetos, anelídeos, serpentes e micro-organismos (bactérias e fungos). Doenças cardiovasculares tem sido a principal causa de morte no mundo. Uma das principais causas de doenças cardíacas é o acúmulo de fibrina nas artérias, acarretando trombose. De acordo com Organização Mundial da Saúde (OMS), cerca de 17,5 milhões de pessoas morrerão este ano de doenças cardiovasculares, e em 2030, esse montante será de 23,6 milhões. Tendo em vista o grande potencial da biodiversidade microbiana regional Amazônica e a crescente aplicabilidade de enzimas na produção de medicamentos, esta pesquisa foi realizada com o objetivo de (1) avaliar o crescimento de Bacillus stearothermophilus, (2) estabelecer os parâmetros de crescimento associado a produção de proteases fibrinolíticas por fermentação submersa e (3) verifica o efeito da fermentação extrativa na separação dessas enzimas. Neste estudo foram empregados técnicas de fermentação extrativa e fermentação semi-sólida. Por fermentação submersa foram determinados os seguintes parâmetros: Perfil do crescimento de Bacillus stearothermophilus e a produção de protease utilizando 100mL do meio líquido [(g/L) KH2PO4 2g; (NH4)2SO4 1g; MgSO4 7H2O 0,1 g; Na2HPO4 2H2O 0,9 g; Extrato de Levedura 1 g; água destilada 1000mL] pH 7,2 suplementado com gelatina 0,5%, em frasco de Erlenmeyer de 500mL. O crescimento da bactéria foi determinado a 610nm, de 2 em 2 horas, durante 36 horas. Na Determinação das melhores condições para produção de proteases foram avaliados a influência do pH; agitação, temperatura, a idade do inóculo, da concentração do substrato, a influência das fontes de naturais de carbono (tapiocas, araruta e crueira), fontes de nitrogênio e aeração. No extrato recuperado foi realizado também bioensaio de toxicidade em Artemia salina e testes de degradação in vitro do coágulo sanguíneo pelos métodos da placa de fibrina e degradação do coagulo artificial em tubo. Foi determinado também o coeficiente de partição (K), o fator de purificação (FP) e a recuperação da enzima. A fermentação semi-sólida foi realizada utilizando como substrato 10g feijão manteiginha [Vigna unguiculata (L.) Walp], com 60% umidade, pH 5,0 em frasco Erlenmeyers de 250 mL. Na fermentação extrativa as melhores condições foram: pH 5,0; 180 rpm e 25 ºC, no sistemas utilizaram PEG 1000 (g/mol-1) a 20% (p/p) e sais fosfato a 15% (p/p) com K de 1,05; FP de 1,00; Y de 152,54. Halo de 34 mm na placa de fibrina e degradação parcial do coagulo em tubo. Na fermentação semi-sólida a produção de protease foi de 8,87 (U/mL), halo translucido de 23 mm em placa de fibrina com degradação total do coagulo de sangue em 24h. No presente estudo, protease de Bacillus stearothermophilus produzido em fermentação extrativa e fermentação semi-sólida foi avaliada, demonstrando nas condições ótimas de cultivo que este micro-organismo apresenta fisiologia para aplicações industriais na produção de protease fibrinolítica

Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-07-14T17:23:12Z No. of bitstreams: 1 texto completto.pdf: 210234 bytes, checksum: 464b1f5b0e3804e8d782b45d54081c76 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-14T17:23:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completto.pdf: 210234 bytes, checksum: 464b1f5b0e3804e8d782b45d54081c76 (MD5) Previous issue date: 2004-04-14 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Foram realizados cinco estudos para avaliar o efeito de antibióticos ionóforos (monensina e lasalocida), própolis e óleo de soja sobre a perda de potássio intracelular de populações de bactérias do rúmen e verificar a ação destes em pH 5,5 e 7,0, simulando dietas a base de grãos ou de forragens, sobre a produção de amônia, de proteína bacteriana e de gases total. Nos dois primeiros estudos, líquido ruminal de bovinos sob pastagem foi usado na incubação in vitro em diferentes meios artificiais com valores de pH 5,5 e 7,0, para se avaliar a ação de níveis crescentes de monensina na resistência à perda de potássio intracelular de bactérias mistas ruminais e verificar o efeito de monensina e lasalocida na produção de amônia e de proteína microbiana em pH 5,5 e 7,0. O meio utilizado para determinar a perda de potássio interfere nos valores absolutos de potássio. A concentração de monensina necessária para causar a metade da perda máxima de potássio foi de 2,77 μM em pH 5,5 e 0,056 μM em pH 7,0, mostrando que as bactérias incubadas em meios com pH 5,5 foram mais resistentes à monensina que aquelas incubadas em meios com pH 7,0. Os ionóforos e a acidez do meio reduziram a produção de amônia, sem haver interação sobre os mesmos. Não houve diferença entre os ionóforos onde, independente do pH do meio, os mesmos inibiram a produção de amônia em 56%. A acidez, por sua vez, inibiu a produção de amônia em xii50,5%, independente dos ionóforos. No entanto, o efeito dos ionóforos e acidez foram aditivos, onde a inibição máxima ocorreu pelo uso de ionóforos em baixo valor de pH (75,2%). A produção de proteína microbiana foi menor quando a lasalocida estava presente no meio de cultura com baixo valor de pH. No terceiro estudo dois bois castrados mantidos em pastagem foram utilizados como doadores de líquido ruminal, sendo a população de bactérias do rúmen utilizada para avaliar a ação de níveis crescentes de monensina, lasalocida e própolis na resistência à perda de potássio intracelular em dois valores de pH. O pH do meio utilizado na incubação de 10 minutos não interferiu na perda de potássio intracelular quando se utilizou lasalocida, mas a perda máxima de potássio intracelular (K max ) foi maior em bactérias de animal consumindo dieta rica em volumoso que em concentrado (54,8 vs 32,5%). Já nas incubações com monensina houve interação entre o pH do meio e a procedência das bactérias ruminais. Em meio com pH 7,0, houve necessidade de apenas 0,072 μM de monensina para causar metade da perda máxima de potássio intracelular (K d ) em bactérias de animal consumindo dieta rica em volumoso comparado a 0,425 μM em dieta rica em concentrado. Em meios com pH 5,5 não houve diferença na concentração de monensina (0,147 vs 0,130 μM) para causar metade da perda máxima de potássio. Estes resultados mostram ser as bactérias de animais recebendo dietas ricas em volumoso mais sensíveis aos ionóforos. A própolis não interferiu no conteúdo de potássio celular, indicando modo de ação sobre as bactérias diferente dos ionóforos. Nos dois últimos estudos com vacas lactantes como unidades experimentais e doadoras de líquido ruminal, as populações de bactérias foram utilizadas para avaliar a ação de níveis crescentes de lasalocida e monensina na resistência à perda de potássio intracelular, e para produção de gases in vitro. O K max da lasalocida foi menor para as populações de bactérias obtidas do líquido de rúmen das vacas submetidas a dietas com monensina, óleo de soja e monensina mais óleo de soja (19,4 a 25,4%) quando comparado com aquele (30,1%) das vacas submetidas a dietas sem ionóforo e óleo de soja. O mesmo ocorreu para o K max da monensina, onde o menor foi de 6,5% para monensina mais óleo e o maior de 29,5% para o controle. Necessita-se de alta concentração de monensina (2,3 μM), porém baixa de lasalocida (0,218 μM) para causar a metade da perda máxima de potássio intracelular de populações de bactérias do rúmen de vacas submetidas a dietas com monensina. Não há resistência cruzada entre os dois ionóforos testados in vitro. As amostras incubadas com própolis produziram menor volume de gases (12,9 mL/100 g de MS), porém monensina e lasalocida também reduziram a mesma. Isto representa menor perda de energia para animais submetidos a dietas com propolis, monensina ou lasalocida. PALAVRAS CHAVE: amônia, ionóforos, óleo de soja, pH, potássio intracelular, produção de gases, rúmen. / Five experiments were performed to evaluate antibiotics (monensin and lasalocid), bee propolis and soybean oil effect on potassium depletion in ruminal bacteria population. In addition, it was verify the action of theses additives in pH 5.5 and 7.0, representing, high grains or roughage diets by measuring ammonia, bacterial protein and gas production. Were carried out two studies, in which the fluid from steers fed pasture was used in incubations with different artificial media in pH 5.5 and 7.0, in order to evaluate the action of increasing levels of monensin in the resistance to intracellular potassium losses by mixed ruminal bacteria and verify the effect of monensin and lasalocid on ammonia and microbial protein production at pH 5.5 and 7.0. The media culture affected the potassium absolute values. The monensin concentration needed to cause half maximal potassium depletion was 2.77 μM in pH 5.5, and 0.056 μM in pH 7.0, showing that bacteria incubated in pH 5.5 were more tolerant to monensin than those incubated in pH 7.0. The ionophores and acidity decreased ammonia production, without interaction between them. In addition, there was no difference between ionophores that, independently of the medium pH, both inhibited ammonia production by 56%. The acidity, on the other hand, inhibited ammonia xvproduction by 50.5%, independently of the ionophores. Therefore, the effect of the ionophores and acidity were additive, the maximum inhibition occurred by the presence of ionophores at low pH value (75.2%). The microbial protein production was lowest when lasalocid was present in the culture media at low pH, causing inhibition of microbial growth. On thirty experiment two steers kept in Coast-cross pasture were used as ruminal fluid donors. The ruminal bacterial population was used to evaluate the action of increasing levels of monensin, lasalocid and bee propolis on the intracellular potassium depletion in two values of pH. The pH values from media used in 10 minutes incubation did not affect potassium depletion when lasalocid was used, but maximum intracellular losses of potassium (K max ) were higher in bacteria from animal fed diet rich in forage than concentrate (54.8 vs 32.5%). There was interaction between media pH and origin of ruminal bacteria when monensin was used in vitro. In the media with pH 7.0 only 0.072 μM of monensin was needed to cause half maximal potassium depletion (K d ) in bacteria from animal fed diet rich in roughage compared to 0.425 μM in diet rich in concentrate. There wasn’t difference in media with pH 5.5 in the monensin concentration (0.147 vs 0.130 μM) to cause half maximal potassium depletion. These results show that bacteria from animal fed diet rich in roughage are more sensitive to ionophores. The bee propolis did not cause potassium depletion in ruminal bacteria population, therefore its mode of action on bacteria is different from the ionophores. On the last two studies were conducted with lactating cows as experimental units and ruminal fluid donors. The ruminal bacteria population were used to evaluate the action of increasing levels of lasalocid and monensin in the resistance of intracellular potassium depletion and gas production with monensin, lasalocid or propolis. Potassium depletion technique showed that K max of lasalocid was lower to ruminal bacteria population obtained from of cows fed diets with monensin, soybean oil and monensin plus soybean oil (19.4 to 25.4%) when compared to the cows fed untreated control diet (30.1%). The same happened for K max of monensin, in which the lowest was 6.5% to monensin plus soybean oil and the greatest was 29.5% to control. High monensin concentration (K d = 2.30 μM) was required, but low lasalocid concentration (K d = 0.218 μM) was necessary to cause half of maximum potassium depletion in ruminal bacteria population from cows fed diet with monensin. This result shows that there was no cross resistance between the evaluated ionophores. In vitro gas production showed the lowest volume when diets were incubated with propolis (12,9 mL/100 g of DM), but monensin xviand lasalocid also reduced it. This represent lower escape energy for animals fed diets with bee propolis, monensin or lasalocid. Key Words: ammonia, gas production, ionophores, pH, potassium depletion, rumen, soybean oil.

Orientador: Luis Henrique Souza Guimarães / Banca: Ariela Veloso de Paula / Banca: Hamilton Cabral / Resumo: A investigação biotecnológica, acompanhada da aplicação das enzimas, tem sido realizada em microrganismos para a produção de enzimas para fins industriais. Entre estas enzimas, as fosfatases, responsáveis por hidrolisar ésteres e anidridos de ácido fosfórico, e as fitases microbianas, que catalisam a hidrólise do fitato (mio-inositol hexaquisfosfato) em mio-inositol e fosfato inorgânico, têm sido amplamente utilizadas em diferentes setores como, por exemplo, em experimentos de biologia molecular e na alimentação animal. De acordo com o pH ótimo de reação, as fosfatases são divididas em alcalinas (EC 3.1.3.1) e ácidas (EC 3.1.3.2). As fitases são enzimas que também pertencem à classe das fosfatases, hidrolisando, no entanto, de forma específica, o ácido fítico. Em recentes trabalhos, o fungo filamentoso Rhizopus microsporus var. microsporus apresentou potencialidade na produção de fosfatases e fitases. Diante disto, este estudo visou a produção, a purificação e caracterização da fosfatase e da fitase alcalina produzidas por R. microsporus var. microsporus. No processo de otimização em Fermentação Submersa (FSbm), a maior produção enzimática foi em meio Khanna com 0,4 mM de KH2PO3 e adicionado de 0,5% de farinha de centeio por 76 h, 32ºC, pH 6,3, a 100 rpm. Em colunas cromatográficas, a fosfatase alcalina foi purificada 10 vezes e com recuperação de 13%, e a fitase alcalina foi purificada 86 vezes com recuperação de 167%. A massa molecular nativa da fosfatase e da fitase alcali... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Biotechnological research, accompanied by the application of enzymes, has been carried out in microorganisms for production of enzymes for industrial purposes. Among these enzymes, microbial phosphatases, responsible for hydrolyzing phosphoric acid esters and anhydrides, and phytases, which catalyzes the hydrolysis of phytate (myo-inositol hexaquisphosphate) in myo-inositol and inorganic phosphate, have been widely used in different sectors as, for example, in molecular biology experiments and in animal feed. According to the optimum reaction pH, phosphatases are divided into alkaline (EC 3.1.3.1) and acidic (EC 3.1.3.2). Phytases are enzymes that also belong to the class of phosphatases, however, hydrolyzing phytic acid. In recent works, the filamentous fungus Rhizopus microsporus var. microsporus presented potential for production of phosphatases and phytases. In view of this, this study aimed at the production, purification and characterization of phosphatase and alkaline phytase produced by R. microsporus var. microsporus. In the optimization of Submerged Fermentation (FSbm), the highest enzymatic production was in Khanna medium with 0.4 mM KH2PO3 and added with 0.5% rye flour for 76 h, 32ºC, pH 6.3, at 100 rpm. In chromatographic columns, alkaline phosphatase was purified 10 folds and recovered at 13%, and alkaline phytase was purified 86 folds with recovery of 167%. The native molecular mass of alkaline phosphatase and phytase produced by R. microsporus var. microsporus... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre