HINTERGRUND: Die Adipositas ist eines der bedeutendsten Gesundheitsprobleme des 21. Jahrhunderts und steht in engem Zusammenhang mit einer erhöhten Gesamtmortalität und -morbidität, die häufig durch kardiometabolische Folgeerkrankungen verursacht werden (Blüher, 2019; Branca et al., 2007; Flegal et al., 2013; Kitahara et al., 2014; World Health Organization, 2005). Aus dieser Problematik ergibt sich ein erhebliches Interesse an robusten Prädiktoren zur Risikostratifzierung und klinischen Verlaufsbeobachtung Adipositas-assoziierter Stoffwechseleffekte. Die Quantifizierung und Verteilungsanalyse des viszeralen und subkutanen Fettdepots gelten dabei als äußerst vielversprechend. In vorangegangenen Studien wurden vorrangig repräsentative Einzelschichtmessungen betrachtet, was jedoch zu uneinheitlichen Ergebnissen führte (Abate et al., 1997; Gronemeyer et al., 2000; Idoate et al., 2011; Irlbeck et al., 2010, 2018; Kuk et al., 2010; Schweitzer et al., 2015; Schwenzer et al., 2010; Springer et al., 2012). Zudem konzentrierten sich die meisten Studien nur auf das viszerale Fettgewebe (VAT) und die Skelettmuskulatur (SM) bei Patienten mit BMI Werten unter 30 kg/qm. Eine große Herausforderung stellt die Quantifizierung des abdominellen subkutanen Fettgewebes (ASAT) bei hochgradig adipösen Patienten mit großem abdominellem Diameter dar, da die Messfeldbreite der MRT-Geräte meist auf 50-55 cm beschränkt ist und laterale oder ventrale Anteile teilweise nicht erfasst werden können. Es besteht daher ein erheblicher Bedarf an zuverlässigen Methoden zur Quantifizierung des ASAT, insbesondere bei Patienten mit höhergradiger Adipositas. ZIELSETZUNG: Ziel dieser Studie war die Entwicklung und Bereitstellung einer zuverlässigen und klinisch praktikablen Methode zur MRT-gestützten Quantifizierung des ASAT bei adipösen Patienten. Dazu wurden folgende Arbeitsschritte definiert: [I] Identifizierung einer repräsentativen MRT-Einzelschicht, [II] Evaluierung partieller Volumina, partieller Flächen und Strecken als Surrogate bei unvollständiger Erfassung ventrolateraler Anteile, [III] Evaluierung gängiger anthropometrischer Parameter zur Prädiktion des ASAT und [IV] Bestimmung allgemeiner, geschlechtsspezifischer Konversionsfaktoren. MATERIAL/METHODEN: Die Patienten wurden innerhalb von klinischen Studien des IFB AdipositasErkrankungen der Universitätsmedizin Leipzig rekrutiert und gemäß des Studienprotokolls im MRT untersucht. Nach Datenauswertung wurden die jeweiligen Ergebnisse in eine Datenbank eingetragen. Für die vorliegende Arbeit wurden retrospektiv MRT-Datensätze von 447 adipösen Patienten betrachtet. Bei 254 dieser Patienten (57%) war das ASAT im ventrolateralen Bereich unvollständig erfasst und konnte daher nicht genau quantifiziert werden. Zum Einschluss kamen somit 193 Patienten (116 Frauen, 77 Männer). Nach semiautomatischer Segmentierung der ASAT-Grenzen zwischen Beckenboden (BB) und Zwerchfell (ZF) wurden folgende Surrogatparameter als mögliche Prädiktoren für das gesamte ASAT-Volumen untersucht: - Referenz V(ASAT ): vollständig gemessenes ASAT-Volumen aus allen segmentierten (axialen) Einzelschichten zwischen ZF und BB - Einzelschichten: geschätztes ASAT-Volumen aus der segmentierten Fläche einer Einzelschicht auf Höhe von L1/L2 bis L5/S1 [A(L1-S1)], des Bauchnabels [A(UM)], der Spinae iliacae anteriores superiores [A(SIAS)] bzw. der Femurköpfe [A(FH)] - Strecken: geschätztes ASAT-Volumen aus einer dorsalen [d(dor-lat)] bzw. ventralen [d(ven)] Streckenmessung - Partialflächen: geschätztes ASAT-Volumen aus einer partiell segmentierten Fläche, mit lateraler Begrenzung durch die Femurköpfe [PA(FH)] bzw. die Spinae iliacae anteriores superiores [PA(SIAS)] - Partialvolumina: geschätztes ASAT-Volumen aus einem lateral durch die Femurköpfe [PV(FH)] bzw. die Spinae iliacae anteriores superiores [PV(SIAS)] und axial durch BB und ZF begrenzten Teilvolumen - Anthropometrie: geschätztes ASAT-Volumen aus einem anthropometrischen Parameter [BMI, Hüftumfang (HC), Taillenumfang (WC), Waist-to-Hip Ratio (WHR), Waist-to-Height Ratio (WHtR) bzw. Hip-to-Height Ratio (HHtR)] Aus Surrogaten abgeschätzte und vollständig gemessene ASAT-Volumina wurden statistisch miteinander verglichen. Die deskriptiven Daten wurden mittels Bestimmtheitsmaß (R2), Pearson-Korrelationskoeffizient (rp) sowie Mittelwert (d) und Standardabweichung (sd) der Messwertdifferenzen dargestellt. Die einfache lineare Regressionsanalyse zwischen dem vollständig gemessenen ASAT-Volumen (Referenz) und den eingeführten Surrogatparametern ergab neben dem Bestimmtheitsmaß die jeweilige Steigung m und den y-Achsenabschnitt b, welche entsprechend der linearen Gleichung V~ASAT (p)=m*p+b als Konversionsfaktoren für die Abschätzung des ASAT-Volumen (V~ASAT) dienen. ERGEBNISSE: Die R2-Werte zwischen lumbosakralen Einzelschichtmessungen und V(ASAT ) lagen zwischen 0,60 und 0,90 für Frauen - mit bester Übereinstimmung bei A(L5/S1). Bei den Männern lag R2 zwischen 0,72 und 0,92 mit höchster Korrelation etwas kranialer [A(L4/L5)]. Eine aggregierte Betrachtung beider Geschlechter favorisierte A(L5/S1) mit R2=0,92 und sd=9,2 %. Bei Männern befand sich der zweitgrößte, bei Frauen der drittgrößte ASAT-Anteil auf Bauchnabelhöhe entsprechend gut korrelierte A(UM) bei beiden Geschlechtern mit V(ASAT). d(ven) war mit einem R2 von 0,54 gegenüber d(dor-lat) (R2=0,47) leicht überlegen, wenngleich auf mäßigem Niveau. Sehr ähnliche Ergebnisse zeigten die dorsalen Flächen PA(FH/SIAS) mit R2-Werten leicht unterhalb von 0,5 (R2=0,47). Die stärkste Übereinstimmung mit V(ASAT) wurde erwartungsgemäß für dorsale Partialvolumina beobachtet mit leichter Präferenz von PV(FH) (R2=0,78) gegenüber PV(SIAS) (R2=0,69). Der direkte Vergleich mit d(dor-lat/ven) und PA(FH/SIAS) favorisierte PV(FH) als bestes Surrogat zur Abschätzung von V(ASAT). Der BMI erreichte mit einem R2 von knapp 0,5 (R2=0,47) und einer einfachen Standardabweichung von 26,8 % äquivalente Ergebnisse wie d(dor-lat) und PA(FH/SIAS). Übergreifend betrachtet war der BMI den bildgebenden Surrogaten A(L1-S1)/A(UM/SIAS/FH) und PV(FH/SIAS) deutlich unterlegen. Der Hüftumfang korrelierte vergleichsweise stark mit V(ASAT). Der Taillenumfang zeigte für Männer mit R2=0,58 und sd=26,0 % eine akzeptable Übereinstimmung mit V(ASAT), jedoch nicht für beide Geschlechter gemeinsam betrachtet (R2 0,23). Die WHR erwies sich als unbrauchbar (R2=0,05), die WHtR erreichte darüber hinaus schlechtere Ergebnisse als die zuvor betrachteten MRT-Einzelschichten, BMI oder der Hüftumfang. Einzig die HHtR erreichte eine gute Korrelation (R2=0,53) vergleichbar mit d(ven) und marginal besser als PA(FH/SIAS) und d(dor-lat). EMPFEHLUNGEN: Bei vollständiger Darstellung des abdominellen SAT auf axialen Einzelschichten ist eine Messung auf Höhe L4/L5 bei Männern und L5/S1 bei Frauen die Methode der Wahl zur Abschätzung von V(ASAT). Gemeinsam betrachtet ist L5/S1 zu favorisieren. Bei unklarer sagittaler oder coronarer Zuordnung bestimmter Wirbelkörperhöhen eignet sich eine umbilikale Einzelschichtmessung zur ASAT-Quantifizierung, einhergehend mit einer akzeptablen Einschränkung der Genauigkeit. Im Falle einer unvollständigen Darstellung ventraler oder lateraler SAT Anteile, insbesondere bei höhergradiger Adipositas, bietet sich das dorsale Partialvolumen PV(FH) als geeignetes Surrogat zur Abschätzung von V(ASAT) an. Der wesentliche Nachteil aller anthropometrischen Parameter ist deren Unfähigkeit in der Differenzierung einzelner Fettkompartimente. Sollten MRT-gestützte Verfahren jedoch zu aufwändig erscheinen oder nicht möglich sein, so empfehlen sich die Messung des Hüftumfangs oder die Bestimmung der HHtR zur Abschätzung des V(ASAT).:Abkürzungsverzeichnis 1 Einführung 1.1 Motivation 1.2 Zielsetzung 2 Material und Methoden 2.1 Design 2.2 Patientenkollektiv 2.3 MRT-Protokoll 2.4 Prädiktoren 2.4.1 Einzelschichten 2.4.2 Strecken, Partialflächen und -volumina 2.4.3 Anthropometrische Parameter 2.5 Software zur semiautomatischen Bildsegmentierung 2.6 Statistische Auswertung 3 Ergebnisse 3.1 Konversionsfaktoren 3.2 Einzelschichten 3.2.1 Geschlechtsspezifische ASAT-Verteilung 3.2.2 Bandscheibenfach L4/L5 3.2.3 Bandscheibenfach L5/S1 3.2.4 Umbilikus 3.2.5 sd: Standardabweichung der Messwertdifferenzen 3.3 Strecken, Partialflächen und –volumina 3.3.1 ddor-lat/ven: Strecken 3.3.2 PAFH/SIAS: Partialflächen 3.3.3 PVFH/SIAS: Partialvolumina 3.3.4 sd: Standardabweichung der Messwertdifferenzen 3.4 Anthropometrische Parameter 3.4.1 BMI 3.4.2 Umfangsmessungen 3.4.3 Quotienten 3.4.4 sd: Standardabweichung der Messwertdifferenzen 4 Diskussion 4.1 Einzelschichten 4.1.1 Literaturvergleich 4.1.2 ASAT-Verteilung: Sexueller Dimorphismus 4.1.3 Lumbosakrale Einzelschichten – Exzellentes Surrogat zur Abschätzung des abdominellen SAT 4.1.4 Umbilikale Einzelschicht: Einfach lokalisierbare Alternative bei fehlender Schnittbildanalyse 4.2 Strecken, Partialflächen und -volumina 4.2.1 Literaturvergleich 4.2.2 Dorsale Partialvolumina bei ventrolateralen Bildartefakten 4.2.3 Dorsale Partialflächen erlauben keine verlässlichen Vorhersagen 4.2.4 Einfache Streckenmessungen: Klinisch praktikabel und vergleichsweise genau 4.3 Anthropometrische Parameter 4.3.1 BMI als grober Richtwert – keine Aussage zu individueller Körperzusammensetzung 4.3.2 Umfangsmessungen zeigen stärkeren Zusammenhang bezüglich subkutaner Fettgewebsverteilung 4.3.3 Quotienten: HHtR ist anderen Quotienten deutlich überlegen 4.4 Empfehlungen 4.4.1 Lumbosakrale Einzelschichtmessungen – Reliable Methode abdomineller Fettquantifizierung 4.4.2 Adipositasbildgebung: Partialvolumina und ventrale Streckenmessungen bei unvollständiger Erfassung ventrolateraler ASAT-Anteile 4.4.3 Anthropometrische Parameter – ungenau bezüglich abdomineller Fettverteilung 4.5 Methoden 4.5.1 MRT-gestützte Fettgewebsquantifizierung 4.5.2 Statistische Auswertung und Konversionsfaktoren 4.6 Ausblick 4.6.1 Akkurate Bildgebungsmethoden für Forschungszwecke bevorzugt 4.6.2 Monitoringparameter bariatrischer Studien 4.6.3 Unabhängiger prädiktiver Faktor onkologischer Grunderkrankungen 4.7 Limitationen 5 Zusammenfassung der Arbeit 6 Literaturverzeichnis 7 Abbildungs- und Tabellenverzeichnis 8 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 9 Danksagung

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Zusammenfassend erweitert die vorliegende Arbeit die bisherigen Befunde, dass Adipositas mit einer verminderten Glutathionperoxidase 3 (GPX3)-Expression im Fettgewebe in Verbindung steht, indem sie zeigt, dass ein signifikanter Gewichtsverlust nach einer bariatrischen Operation die GPX3-Expression im subkutanen Fettgewebe signifikant erhöhen kann. Darüber hinaus legen die Daten von Patienten der vorliegenden Studie mit insulinsensitiver Fettleibigkeit nahe, dass die GPX3-Expression im Fettgewebe durch andere Faktoren als die erhöhte Fettmasse reguliert wird. Die Humanstudie unterstützt Daten aus einem Ratenmodell für Adipositas, wonach die GPX3-Expression im Fettgewebe nicht signifikant zu einer veränderten zirkulierenden GPX3-Konzentration beiträgt. Die erhobenen Daten zeigen, dass eine Fehlregulation von GPX3 mit Adipositas, Fettverteilung und Ganzkörperinsulinresistenz zusammenhängt. Sie lassen jedoch keine Rückschlüsse darauf zu, ob die GPX3-Expression im Fettgewebe die FG-Funktionsstörung bei Adipositas und insulinresistenten Zuständen lediglich widerspiegeln oder dazu ursächlich beitragen.

Die Adipositasepidemie hat sich in den letzten Jahrzehnten, vor allem in westlichen Ländern, weiter ausgebreitet. Eine chronische Fettgewebeentzündung stellt eine pathophysiologische Schnittstelle von Übergewicht mit den zahlreichen adipositasassoziierten Krankheiten dar. Diese Entzündung ist zwar bereits ausführlich beschrieben, ihr genauer Auslöser allerdings ungeklärt. Das gehäufte Auftreten von crown-like structures (CLS, kronenartige Strukturen) gilt als guter Indikator für eine Fettgewebeentzündung. Diese Strukturen zu untersuchen, gestaltet sich aber, mangels Methoden zur Induktion von CLS, schwierig. In dieser Arbeit verwendeten wir eine transgene Mauslinie, die grün fluoreszierendes Protein (GFP) in Makrophagen und über die Cre-ERT2 induzierbar das rot fluoreszierende tdTomato in Adipozyten exprimiert. Zunächst nutzten wir dieses Modell, um die Induzierbarkeit über Tamoxifen (TAM)-Applikation in unserem Organkultursystem von intaktem Fettgewebe zu verifizieren. Drei Tage nach einmaliger Zugabe von TAM ins Kulturmedium exprimierten nahezu alle Adipozyten tdTomato. Die in anderen Arbeiten beschriebene, fast vollständige Induzierbarkeit bleibt also in unserem Organkulturmodell erhalten. Auffällig war allerdings, dass vereinzelt Adipozyten bereits vor der Zugabe von TAM tdTomato exprimierten. Weitere Untersuchungen enthüllten verschieden Faktoren, die die spontane Rekombination in vivo beeinflussen. Weibliche Mäuse wiesen mehr tdTomato exprimierende Adipozyten auf als männliche und homozygote deutlich mehr als heterozygote Tiere. Exprimierten in heterozygoten Männchen ca. 9 % der Adipozyten tdTomato ohne TAM-Applikation, waren es 70% in homozygoten Weibchen. Außerdem stieg der Anteil tdTomato exprimierender Adipozyten mit dem Alter der Mäuse an. Diese nicht induzierte Rekombinaseaktivität kann zu einem hohen Hintergrundsignal in Kontrollgruppen führen und vermindert die TAM-vermittelte Induzierbarkeit vor allem in homozygoten Tieren deutlich. Bei Verwendung von induzierbaren Cre-Rekombinasen ist es daher wichtig, zunächst an Kontrolltieren mit passendem Alter, Geschlecht und Genotyp auf nicht induzierte Rekombinaseaktivität zu testen. Ziel dieser Arbeit war es, das erste Modell zu entwickeln, um gezielt die Formation von CLS in intaktem Fettgewebe zu induzieren. Die Hypothese dafür war, dass die Bildung von CLS kein Artefakt der Fettgewebeentzündung ist, sondern der natürliche Abbaumechanismus von toten Adipozyten, die zu groß für klassische Phagozytose sind. Aus diesem Grund kultivierten wir Fettgewebe von dünnen Mäusen und nutzten die Laser eines Konfokalmikroskops um Adipozyten gezielt zu depletieren. Der verwendete lichtmikroskopische Ansatz erlaubte anschließend, die Makrophagenbewegung in Echtzeit zu dokumentieren. Zwölf Stunden nach induziertem Adipozytentod kam es bereits zur Migration von Makrophagen zur Stelle des Laserschadens. Ab 24 Stunden nach Adipozytentod bildeten diese Makrophagen CLS. Die Präzision des verwendeten Laserschadens erlaubt hierbei die gezielte Depletion einzelner Adipozyten ohne größeren Gewebeschaden, um die Bildung von CLS zu induzieren. Die so induzierten CLS untersuchten wir mittels post hoc Immunfluoreszenzfärbungen auf die Expression verschiedener Marker. Makrophagen in CLS exprimierten die proinflammatorischen Marker CD11c, CD86 und CD9, während die im Gewebe verteilten Makrophagen die antiinflammatorischen Marker CD301 und CD206 exprimierten. Diese Ergebnisse verifizierten wir mit Färbungen von in vivo gebildeten CLS im Fettgewebe dünner Mäuse und beobachteten hier eine vergleichbare Expression der pro- und antiinflammatorischen Marker. Des Weiteren analysierten wir die Art des durch den Laserschaden induzierten Adipozytentods genauer. Die Membran der bestrahlten Adipozyten war gut mit Annevin V anfärbbar, was auf die Externalisierung von membranständigem Phosphatidylserin schließen lässt, während die Kerne keine DAPI-Färbung aufwiesen. Die Phosphatidylserinexternalisierung bei Erhalt der Membranintegrität ist bei apoptotischem Zelltod, in der Regel aber nicht bei nekrotischem Zelltod, zu beobachten. Die induzierte CLS-Bildung scheint also eine Reaktion auf apoptotischen Adipozytentod zu sein. Ein klassisches Modell unterscheidet zwischen proinflammatorischen (M1) und antiinflammatorischen (M2) Makrophagen. Mit fortschreitender Fettgewebeentzündung steigt der Anteil der M1-Makrophagen immer weiter an. Für diesen Anstieg wurden sowohl die Rekrutierung von Blutmonozyten, als auch ein „phenotpical switch“ von residenten Makrophagen postuliert. Da Makrophagen in unseren induzierten CLS die entsprechenden M1-Marker exprimieren und residente Makrophagen außerhalb von CLS stattdessen M2-Marker, liefert unser Modell erstmals direkte Nachweise für den „phenotypical switch“ von Makrophagen in CLS. Die Rekrutierung dagegen ist in unserem ex vivo Organkulturmodell ausgeschlossen. Um sicherzustellen, dass auch CLS in vivo durch residente Makrophagen gebildeten werden, analysierten wir das Fettgewebe von Wildtypmäusen, die sich einen Blutkreislauf mit GFP exprimierenden Parabiosepartnern teilten. So konnten wir zeigen, dass die Makrophagenpopulation im Fettgewebe zwar teilweise durch Monozytenrekrutierung erhalten wird, CLS jedoch nicht verstärkt durch rekrutierte Makrophagen gebildet werden. Auch freie Fettsäuren gelten allgemein als proinflammatorisch. Weder Stimulierung mit Palmitat noch Kontakt zu bei der Kultivierung entstehenden kleineren Fetttröpfen führte in unseren Experimenten zu einer vergleichbaren Änderung des Phänotyps der Makrophagen wie nach Adipozytentod in unserem Modell. Der beobachtete „phenotypical switch“ scheint also direkt mit der Bildung von CLS zusammenzuhängen. Im Fettgewebe von Mäusen, die eine hochkalorische Diät erhielten, konnten wir eine CLS-Bildung mit einem vergleichbaren zeitlichen Ablauf und vergleichbarer Häufigkeit induzieren. Dies ist ein weiterer Hinweis dafür, dass CLS der biologische Abbauweg für tote Adipozyten sind und kein Entzündungsartefakt. Unsere Ergebnisse zeigten, dass sich CD11c gut als Marker eignet, um Makrophagen in induzierten CLS von interstitiellen Makrophagen zu unterscheiden. Dieses Ergebnis nutzten wir, um die Makrophagen zu sortieren und mittels RNA-Sequenzierung den Phänotyp der CLS- bildenden Makrophagen über die verwendeten Marker hinaus zu untersuchen. Dabei zeigte sich eine erhöhte Expression vieler weiterer M1-Markerproteine in CD11c positiven Makrophagen, während M2-Gene vermindert exprimiert wurden. Außerdem zeigten die Makrophagen in CLS eine erhöhte Expression von Genen, wie sie laut Literatur durch metabolische Aktivierung (Stimulierung mit Palmitat, Insulin und Glukose) induziert wurde, sowie eine erhöhte Expression verschiedener Gene des Lipidmetabolismus. Zusätzlich zeigten sich Veränderungen in der Expression einiger Chemokine oder ihrer Rezeptoren, was ein Hinweis auf einen gezielten Mechanismus zur Rekrutierung von Makrophagen zur CLS-Bildung sein könnte. Zusammenfassend zeigen unsere Ergebnisse, dass Adipozytentod die CLS-Bildung in gesundem Fettgewebe ohne Dysfunktion induziert. Damit einher geht der „phenotypical switch“ der Makrophagen in diesen CLS zu einem metabolisch aktivierten Phänotyp. Dieser Phänotyp ist assoziiert mit erhöhter Exozytose von lysosomalen Proteinen und beschleunigtem Lipidstoffwechsel zum Verdau des toten Adipozyten. Andere Gruppen konnten außerdem zeigen, dass metabolisch aktivierte Makrophagen verstärkt proinflammatorische Zytokine, wie TGFβ, TNFα und IL-1β, sezernieren. Der langsame Abbau von Adipozyten in CLS führt also zur Aktivierung von Signalwegen in Makrophagen, wie sie auch bei ineffektiver Phagozytose und sekundärer Nekrose anderer Zellarten zu beobachten ist. Gehemmte Phagozytose führt in anderen Geweben zu einer chronischen Entzündung, vergleichbar mit der adipositasassoziierten Entzündung in dysfunktionalem Fettgewebe. In dieser Arbeit konnten wir weiterhin zeigen, dass Alter, Genotyp und Geschlecht einen großen Einfluss auf die nicht induzierte Aktivität der untersuchten Cre-Rekombinase haben. Außerdem haben wir ein Modell etabliert, um gezielt CLS-Bildung zu induzieren. Mit Hilfe dieses Modells konnten wir zeigen, dass Adipozytentod auch im Fettgewebe von dünnen Mäusen ohne zu Grunde liegende Fettgewebeentzündung zu CLS-Bildung führt. Makrophagen in CLS weisen zudem einen anderen Phänotyp auf als im Gewebe verteilte Makrophagen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Adipozytentod im Fettgewebe dünner Mäuse lokal einen proinflammatorischen, metabolisch aktivierten Phänotyp induziert, wie er im Fettgewebe von Mäusen nach einer hochkalorischen Diät oder nach Stimulierung mit Palmitat, Insulin und Glukose beobachtet werden konnte. Diese Arbeit liefert damit Hinweise, dass vermehrter Adipozytentod und durch Fettzellhypertrophie länger bestehende CLS die treibenden Kräfte hinter der chronischen Fettgewebeentzündung sind, die verantwortlich für die diversen, mit Übergewicht vergesellschafteten Krankheiten ist.:1 Einführung 1.1 Fettgewebe 1.2 Adipositas und adipositasassoziierte Krankheiten 1.3 Die Fettgewebeentzündung 1.4 Funktionen von Makrophagen 1.5 Fettgewebemakrophagen 1.6 Crown-like structures 1.7 Efferozytose apoptotischer und nekrotischer Zellen 1.8 Das Cre-loxP-System 1.9 Zielsetzung 2 Publikationen 2.1 Unspecific DNA recombination in AdipoqCre-ERT2 – mediated knockout approaches in transgenic mice is sex-, age- and genotype-dependent 2.2 Adipocyte death triggers a pro inflammatory response and induces metabolic activation of resident macrophages 3 Zusammenfassung der Arbeit 4 Literaturverzeichnis 5 Darstellung des eigenen Beitrags des Promovierenden zu den Publikationen 5.1 Unspecific DNA recombination in AdipoqCre-ERT2 – mediated knockout approaches in transgenic mice is sex-, age- and genotype-dependent 5.2 Adipocyte death triggers a pro inflammatory response and induces metabolic activation of resident macrophages 6 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 7 Publikationen im Rahmen der Promotion 8 Danksagung

Mesenchymale Stromazellen (MSCs) werden beim Pferd bereits mit vielversprechenden Ergebnissen zur Behandlung von muskuloskelettalen Erkrankungen, insbesondere von Sehnenerkrankungen, eingesetzt. In bisherigen klinischen Studien lag das Hauptaugenmerk auf der Behandlung von Erkrankungen der Oberflächlichen Beugesehne bei Rennpferden, die jedoch in Deutschland nur einen verhältnismäßig kleinen Anteil des Patientenaufkommens darstellen. Die zu erwartenden Ergebnisse nach MSC-Behandlung von Fesselträgererkrankungen sind dagegen noch nicht bekannt. Darüber hinaus sind die grundlegenden Kenntnisse zur Biologie equiner MSCs noch unzureichend, was Verständnis und Optimierung des bestehenden Therapiekonzeptes erschwert. Häufig wird die Verwendung alternativer Gewebequellen für MSCs diskutiert, wobei jedoch nur wenige vergleichende Daten zu den jeweiligen zellulären Eigenschaften vorliegen. Ziel dieser Arbeit war es daher, zum einen mehr Kenntnisse über die zu erwartenden klinischen Ergebnisse nach MSC-Behandlung von Sehnenerkrankungen zu erlangen, einschließlich Erkrankungen des Fesselträgers, zum anderen den Wissensstand hinsichtlich der in-vitro-Charakterisierung equiner MSCs zu erweitern, wobei ein Vergleich klinisch relevanter Charakteristika zwischen MSCs aus verschiedenen Gewebequellen angestrebt wurde. In die klinische Studie wurden 98 Pferde, die aufgrund von Sehnen- und Banderkrankungen mit MSCs behandelt worden waren, einbezogen. Von 58 dieser Tiere konnten Langzeitergebnisse nach einem Beobachtungszeitraum von mindestens einem Jahr erhoben werden. Diese wurden hinsichtlich des Behandlungserfolges sowie möglicher Einflussfaktoren ausgewertet, wobei die Behandlung als erfolgreich bewertet wurde, wenn die Patienten nach dem Beobachtungszeitraum voll trainiert oder im Sport eingesetzt werden konnten und dabei kein Rezidiv aufgetreten war. Die Behandlung mit MSCs wurde bei 84,5 % der Pferde als erfolgreich eingestuft, wobei Erkrankungen der Oberflächlichen Beugesehne mit 84,2 % und Erkrankungen des Fesselträgers mit 83,3 % gleichermaßen gute Ergebnisse zeigten. Tendenziell beeinflussten Nutzungsdisziplin, Erkrankungsstadium und Patientenalter das klinische Ergebnis ebenso wie bei konventioneller Behandlung. Insgesamt war nach MSC-Behandlung das Auftreten von Rezidiven deutlich seltener zu beobachten als in der Literatur für die konventionelle Behandlung beschrieben wird. Für die in-vitro-Studie zur vergleichenden Charakterisierung equiner MSCs aus verschiedenen Quellen wurden Knochenmark, Fett- und Sehnengewebe sowie Nabelschnurblut und -gewebe gewonnen. Aus diesen Proben wurden jeweils die plastikadhärenten MSCs isoliert und hinsichtlich Zellausbeute, Proliferations- und Migrationseigenschaften, tripotentem Differenzierungspotential sowie der Expression der Sehnenmarker Kollagen 1A2 und Skleraxis vergleichend untersucht. Die Ausbeute an MSCs war bei allen soliden Geweben (Fett-, Sehnen-, und Nabelschnurgewebe) hochsignifikant höher (p < 0,001). Ebenso proliferierten MSCs aus Fett- und Sehnengewebe signifi-kant schneller als MSCs aus Knochenmark oder Nabelschnurblut (p < 0,01). Von letzteren wurden darüber hinaus etwa drei viertel aller Zellkulturen vor der achten Passage seneszent. Das höchste Migrationspotential zeigten wiederum MSCs aus Sehnen- und Fettgewebe, wobei hier MSCs aus Nabelschnurgewebe das ungünstigste Ergebnis erzielten (p < 0,01). Die adipogene Differenzierung gelang bei MSCs aus allen Quellen vergleichbar gut. Bei der osteogenen Differenzierung erreichten MSCs aus Knochenmark das beste Ergebnis, während MSCs aus Nabelschnurblut und –gewebe nur schwach osteogen differenzierten (Tag 21: p < 0,01; Tag 35: p < 0,05). Im Gegensatz dazu erreichten MSCs aus Nabelschnurblut bei der chondrogenen Differenzierung die meisten Scorepunkte, MSCs aus Knochenmark dagegen die wenigsten (p < 0,05). Kollagen 1A2 wurde von MSCs aus Fettgewebe am höchsten exprimiert, Skleraxis von MSCs aus Nabelschnurblut. MSCs aus Sehnengewebe exprimierten beide Sehnenmarker auf fast ebenso hohem Level. MSCs aus Knochenmark dagegen zeigten hier jeweils die niedrigste Expression (p < 0,05 für Kollagen 1A2). Basierend auf den Ergebnissen der klinischen Studie ist die MSC-Therapie nach wie vor als vielversprechende Behandlungsoption für Sehnenerkrankungen anzusehen und ist auch für die Behandlung von Fesselträgererkrankungen geeignet. Zukünftige, kontrollierte klinische Studien müssen jedoch die Wirksamkeit der MSC-Therapie noch weitergehend bestätigen. Die in-vitro-Studie zeigte signifikante Unterschiede zwischen equinen MSCs aus verschiedenen Quellen auf, die bei der Auswahl einer Gewebequelle für die MSC-Isolierung für klinische Anwendungen berücksichtigt werden sollten. MSCs aus Fettgewebe erscheinen aufgrund ihrer sehr guten Proliferations- und zuverlässigen Differenzierungseigenschaften als eine gute Alternative zu MSCs aus Knochenmark für autologe Therapien. MSCs aus Sehnengewebe sind den hier vorliegenden Ergebnissen zufolge besonders gut für die Behandlung von Sehnenerkrankungen geeignet; vor einer routinemäßigen Anwendung dieser MSCs sollten jedoch ihre Eigenschaften weiterführend untersucht werden. / In horses, mesenchymal stromal cells (MSCs) are used for the treatment of musculoskeletal diseases, especially tendon injuries, with promising results. Previous clinical studies mainly focused on the treatment of superficial digital flexor tendon injuries in racehorses, which, however, represent only a relatively small percentage of the overall equine case load in Germany. Average outcome to be expected following MSC treatment of suspensory ligament injuries was not yet determined. Moreover, basic knowledge on equine MSC biology is still deficient, hampering the understanding and thus the optimisation of the existing treatment regime. The use of alternative MSC sources is frequently discussed, yet to date, only few data comparing the cellular properties of equine MSCs from different sources have been published. The aim of this study was, on the one hand, to gain more knowledge concerning the expected outcome after MSC treatment of tendon injuries, including injuries to the suspensory ligament. On the other hand, it was aimed at expanding the knowledge on equine MSC characterisation in vitro, thereby focusing on the comparison of clinically relevant properties of MSCs derived from different sources. In the clinical study, 98 horses were included, all of which had received MSC treatment for tendon or ligament injuries. In 58 of these horses, long term results after a follow-up period of at least one year could be collected. These data were analysed with respect to treatment outcome and potential influencing factors. Treatment was considered successful when horses were back to full training or competition after the follow-up period, without having suffered a re-injury. The overall success rate was 84.5 %. Success rates in horses suffering from superficial digital flexor tendon injuries and in horses suffering from suspensory ligament injuries were comparably good (84.2 % and 83.3 %, respectively). Similar to conventional therapies, the sports discipline in which the horses performed, age and disease stage tended to influence the outcome. Overall, re-injury rates after MSC treatment were considerably lower than those described in the literature following conventional treatment. For the comparative characterisation of MSCs from different sources in vitro, samples of bone marrow, adipose and tendon tissue, as well as umbilical cord blood and –tissue were collected. Plastic-adherent MSCs were isolated out of these samples and comparatively characterised focusing on cell yields, proliferation and migration properties, trilineage differentiation potential and the expression of the tendon markers collagen 1A2 and scleraxis. MSC yields were significantly higher in all solid tissues (adipose, tendon and umbilical cord tissue) (p < 0.001). Further, MSCs from adipose and tendon tissue proliferated significantly faster than MSCs from bone marrow or umbilical cord blood (p < 0.01). Moreover, approximately three quarters of the samples derived from the latter sources underwent senescence before reaching passage eight. The highest migration potential was found in MSCs derived from tendon and adipose tissue again, while MSCs from umbilical cord tissue showed the least (p < 0.01). The adipogenic differentiation potential was comparably good in MSCs from all different sources. The osteogenic differentiation was most distinct in MSCs from bone marrow, while MSCs from umbilical cord blood and tissue showed only weak evidence of differentiation (day 21: p < 0.01; day 35: p < 0.05). In contrast, following chondrogenic differentiation, MSCs from umbilical cord blood scored highest and MSCs from bone marrow scored lowest (p < 0.05). Collagen 1A2 was most highly expressed in MSCs from adipose tissue, highest scleraxis expression levels were found in MSCs from umbilical cord blood. MSCs from tendon tissue, however, expressed both markers at almost evenly high levels. Contrastingly, lowest expression levels of both markers were found in MSCs derived from bone marrow (p < 0.05 for collagen 1A2). Based on the results of the clinical study, MSC therapy can still be considered a very promising treatment option for tendon diseases and is also a suitable treatment for suspensory ligament injuries. In the future, controlled clinical studies will have to further confirm the efficacy of this treatment regime. The in-vitro-study showed significant differences between equine MSCs derived from different sources, which should be considered when choosing a MSC source for clinical applications. For autologous therapies, MSCs derived from adipose tissue appear to be a good alternative to MSCs derived from bone marrow, due to their remarkable proliferation and reliable differentiation capacities. Furthermore, according to this study, MSCs derived from tendon tissue are especially suitable for treating tendon injuries. Prior to routine clinical applicability of these MSCs, however, their properties should be further investigated.

Recent studies suggested the persistence of brown adipocytes in adult humans, as opposed to being exclusively present in infancy. In this study, we investigated the presence of brown-like adipocytes in adipose tissue (AT) samples of children and adolescents aged 0 to 18 years and evaluated the association with age, location, and obesity. For this, we analysed AT samples from 131 children and 23 adults by histological, immunohistochemical and expression analyses. We detected brown-like and UCP1 positive adipocytes in 10.3% of 87 lean children (aged 0.3 to 10.7 years) and in one overweight infant, whereas we did not find brown adipocytes in obese children or adults. In our samples, the brown-like adipocytes were interspersed within white AT of perirenal, visceral and also subcutaneous depots. Samples with brown-like adipocytes showed an increased expression of UCP1 (>200fold), PRDM16 (2.8fold), PGC1α and CIDEA while other brown/beige selective markers, such as PAT2, P2RX5, ZIC1, LHX8, TMEM26, HOXC9 and TBX1 were not significantly different between UCP1 positive and negative samples. We identified a positive correlation between UCP1 and PRDM16 within UCP1 positive samples, but not with any other brown/beige marker. In addition, we observed significantly increased PRDM16 and PAT2 expression in subcutaneous and visceral AT samples with high UCP1 expression in adults. Our data indicate that brown-like adipocytes are present well beyond infancy in subcutaneous depots of non-obese children. The presence was not restricted to typical perirenal locations, but they were also interspersed within WAT of visceral and subcutaneous depots.

Colitis ulcerosa (CU) und Morbus Crohn (MC) zählen zur Gruppe der chronischen Darmerkrankungen (CED). Im Gegensatz zu CU lässt sich bei MC eine transmurale Entzündung und eine Ummantelung des entzündeten Dünndarms mit mesenterialen Fettgewebe, dem sogenannten “creeping fat”, feststellen. In dieser Arbeit wurden zwei verschiedene Mechanismen der Immunregulation in der Pathogenese von CED untersucht: 1) Der SOCE-Signalweg (store-operated Ca2+ entry) stellt eine wichtige Signalkaskade dar, die die Aktivierung von T-Zellen steuert. Wir haben die Auswirkung einer pharmakologischen Blockade von SOCE auf die Funktion von Immunzellen untersucht, die aus der intestinalen Mukosa therapierefraktärer CED-Patienten isoliert wurden. Anschließend konnten wir die Sicherheit einer systemischen Verabreichung von SOCE-Inhibitoren in vivo im einem murinen IBD-Modell bestätigen und zeigen, dass die Blockade von SOCE eine therapeutische Option für die Behandlung von CED darstellen könnte. 2) Darüber hinaus untersuchten wir, ob das Fehlen von Fettgewebe eine entzündungsfördernde oder -hemmende Rolle bei der Entstehung von CED spielt. Daher wurde die Zusammensetzung des mukosalen Immunsystems sowie die Funktion der intestinalen Epithelbarriere in einem Mausmodell mit Adipozytenatrophie sowohl im steady-state als auch nach induzierter Kolitis verglichen. Wir konnten zeigen, dass eine Fettgewebsatrophie vor dem Ausbruch einer Kolitis schützt, und führte zu einer erhöhten Resistenz der intestinalen Barriere. Schließlich verglichen wir die Merkmale des lipoatrophischen Mausmodells mit denen eines seltenen Patienten mit erworbener Lipodystrophie und MC und kamen zu dem Schluss, dass die chirurgische Resektion von mesenterialen Fettgewebes für Patienten mit einem MC, bei denen eine intestinale Resektionen durchgeführt wird, sinnvoll sein könnte. / Inflammatory bowel disease (IBD) is a group of chronic intestinal autoimmune disorders, including ulcerative colitis (UC) and Crohn's disease (CD). In contrast to UC, CD is characterized by transmural inflammation and mesenteric adipose tissue wrapping the inflamed small intestine, known as "creeping fat." Despite all currently available drug therapies, treating IBD remains a major challenge, underlying the necessity of identifying new therapeutic targets. In this work, two different mechanisms of immune regulation in the pathogenesis of IBD were investigated: First, because the store-operated Ca2+ entry (SOCE) signaling pathway is a crucial Ca2+ signaling cascade for T cell activation, we investigated the effect of pharmacological SOCE-blockade on intestinal immune cells isolated from therapy refractory IBD patients. Subsequently, we confirmed the efficacy and safety of systemic administration of SOCE inhibitors in vivo in an IBD murine model, demonstrating that the blockade of SOCE may represent a therapeutic option for treating IBD. Second, we investigated whether adipose tissue plays a pro- or anti-inflammatory role in the development of IBD. Therefore, we characterized the mucosal immune system and intestinal epithelial barrier in a murine model affected by adipocyte atrophy both at steady-state and after induction of colitis. We demonstrated that lipodystrophy protected against the onset of colitis and increased intestinal barrier resistance. Finally, we compared the lipoatrophic mouse model with a rare patient with acquired generalized lipodystrophy and CD, concluding that adipokines might play a pro-inflammatory role in IBD. Therefore, we suggest that surgical resection of mesenteric adipose tissue in CD patients might be a beneficial intervention in patients undergoing bowel resection.

Background: The beneficial impact of mesenchymal stem cells (MSC) on both acute and chronic liver diseases has been confirmed, although the molecular mechanisms behind it remain elusive. We aim to identify factors secreted by undifferentiated and hepatocytic differentiated MSC in vitro in order to delineate liver repair pathways potentially targeted by MSC. Methods: Secreted factors were determined by protein arrays and related pathways identified by biomathematical analyses. Results: MSC from adipose tissue and bone marrow expressed a similar pattern of surface markers. After hepatocytic differentiation, CD54 (intercellular adhesion molecule 1, ICAM-1) increased and CD166 (activated leukocyte cell adhesion molecule, ALCAM) decreased. MSC secreted different factors before and after differentiation. These comprised cytokines involved in innate immunity and growth factors regulating liver regeneration. Pathway analysis revealed cytokine-cytokine receptor interactions, chemokine signalling pathways, the complement and coagulation cascades as well as the Januskinase-signal transducers and activators of transcription (JAK-STAT) and nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor (NOD-like receptor) signalling pathways as relevant networks. Relationships to transforming growth factor beta(TGF-beta) and hypoxia-inducible factor 1-alpha (HIF1-alpha) signalling seemed also relevant. Conclusion: MSC secreted proteins, which differed depending on cell source and degree of differentiation. The factors might address inflammatory and growth factor pathways as well as chemo-attraction and innate immunity. Since these are prone to dysregulation in most liver diseases, MSC release hepatotropic factors, potentially supporting liver regeneration.

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