Le cheval est souvent victime de plaies traumatiques, dont la guérison est fréquemment problématique, et ce, principalement quand la plaie survient sur le membre. Il est courant de voir chez le cheval le développement d’un tissu de granulation exubérant ou « bouton de chair », qui mène à une cicatrisation excessive due à la surproduction de tissu fibreux. Ce tissu cicatriciel, non épithélialisé, est caractérisé par une occlusion au niveau de la microcirculation due à l’hypertrophie des cellules endothéliales, qui laisse supposer la présence d’hypoxie tissulaire. Une hypoxie relative a effectivement été mesurée par spectroscopie dans le proche infrarouge au niveau des plaies appendiculaires prédisposées au développement de tissu de granulation exubérant, par rapport aux plaies corporelles. De plus, une étude thermographique a révélé un patron spatial similaire de la perfusion. Au niveau moléculaire, la littérature rapporte que le facteur de transcription «hypoxia inducible factor» (HIF) est à l’origine de plusieurs changements dans les niveaux d’expression de divers gènes régulés par l’hypoxie. L’objectif du présent projet de recherche était de définir la contribution de l’hypoxie à la guérison cutanée chez le cheval. Le premier volet (in vivo) du projet visait à mesurer l’expression protéique temporelle du HIF1A dans des échantillons tissulaires en provenance de plaies cutanées guérissant normalement et d’autres développant une cicatrisation excessive, selon divers sites anatomiques (tronc, membre). Les résultats obtenus suggèrent que la mesure de HIF1A, dans les échantillons pluricellulaires de cette étude, reflète l’épithélialisation de la plaie plutôt que les niveaux d’oxygène tissulaire. En effet, le HIF1A semble réguler l’homéostasie et la prolifération des kératinocytes. Le second volet (in vitro), consistait en la mise en culture de fibroblastes dermiques équins provenant du tronc ou du membre, en condition de normoxie ou d’hypoxie (à 1% d’O2 ou à l’aide d’un mimétique, le CoCl2) afin d’en étudier le comportement (capacités de prolifération et de synthèse protéique). Les résultats obtenus soutiennent une contribution de l’hypoxie à la cicatrisation extensive chez le cheval puisque l’hypoxie favorise la prolifération des fibroblastes en plus d’encourager la synthèse de collagène de type 1 et de diminuer la synthèse de la métalloprotéinase de type 2. Les changements observés semblent dépendre de facteurs extrinsèques (environnementaux) car les fibroblastes dermiques se comportent de façon similaire indépendamment de la provenance anatomique. En somme, les deux volets de l’étude ont permis d’élucider une part des mécanismes sous-jacents à la formation du tissu de granulation exubérant lors de guérison cutanée chez le cheval. La poursuite des recherches dans ce domaine mènera à une meilleure compréhension de la pathologie et ainsi, permettra de développer des méthodes de traitement spécifiques à la condition. / The horse is often victim of traumatic wounds for which healing can be problematic, mainly when the wound occurs on the limb. The development of exuberant granulation tissue, also known clinically as “proud flesh”, leads to extensive scarring characterized by overproduction of fibrous tissue and the absence of an epithelial cover. This scar tissue suffers from occlusion of the microcirculation within the residual granulation tissue, due to endothelial cell hypertrophy, suggesting tissue hypoxia. The presence of relative hypoxia in limb wounds of horses was recently confirmed using near infrared spectroscopy. Additionally, thermography showed decreased perfusion in limb wounds. Abundant literature incriminates "hypoxia inducible factor” (HIF) in the regulation of expression of a number of genes in response to hypoxia. The overall objective of this research project was to define the contribution of hypoxia to problematic wound healing in horses. The first phase of the project (in vivo) aimed to measure the temporal expression of HIF1A protein in tissue samples taken from skin wounds healing normally and others developing exuberant granulation tissue and subsequent extensive scarring, according to various anatomical sites (trunk, limb). Results suggest that the expression of HIF1A within the pluricellular tissue samples of this study reflects wound epithelialization rather than tissue oxygen levels. Indeed, HIF1A appears to regulate the homeostasis and proliferation of skin keratinocytes. The second phase of the project (in vitro) consisted in the culture of equine dermal fibroblasts from the body or the limb, under conditions of normoxia or hypoxia (1% O2 or using a mimetic, CoCl2) in an effort to study their behavior (proliferation and protein synthesis). Results corroborate the contribution of hypoxia to over-scarring in the horse since hypoxia promotes both the proliferation of dermal fibroblasts and the synthesis of collagen type 1 while decreasing the synthesis of matrix metalloproteinase 2. Extrinsic factors (environmental) appear to govern the behavior of equine dermal fibroblasts since these cells behave similarly regardless of their anatomic origin (body or limb). In summary, the two phases of the study contributed to the elucidation of a portion of the mechanisms underlying the development of exuberant granulation tissue during wound healing in horses. Further research in this area will provide a better understanding of the pathology and thus aid in the design and development of targeted therapies.

La sclérose systémique est une maladie autoimmune dont l’une des complications majeures est la fibrose. La DNA topoisomérase I (topo) est l’un des principaux autoantigènes associés à cette maladie. Toutefois, aucun lien n’a encore pu être établi entre la présence des anti-topo et le développement de la fibrose. Les travaux antérieurs du laboratoire d’accueil ont montré une interaction directe de la topo avec la surface des fibroblastes et la matrice extracellulaire. Nous avons voulu caractériser ces interactions du point de vue moléculaire. La topo a donc été exprimée sous forme de 5 fragments, déterminés à partir de ses principaux domaines structuraux et de ses épitopes majeurs, chez E. coli. Les fragments purifiés ont été analysés pour leur interaction avec l’héparine, représentant les héparane sulfates de la surface des fibroblastes, et avec des protéines purifiées de la matrice extracellulaire. Nous avons montré que le fragment topo-N est le principal responsable de l’interaction avec l’héparine, ce qui suggère donc l’implication potentielle de ce domaine dans l’interaction de la topo avec la surface des fibroblastes. Le fragment topo-DIDII est responsable de l’interaction avec la plupart des protéines de la matrice extracellulaire étudiées, alors que le fragment topo-H15 n’interagit qu’avec la vitronectine. Aucune interaction des fragments topo-DIII et topo-C n’a été décelée. Ces résultats pourront maintenant servir à mieux comprendre le rôle potentiel de la topo et des autoanticorps circulants anti-topo dans la fibrose présente chez les personnes atteintes de sclérose systémique en contribuant à l’identification de la cible de la topo sur les fibroblastes. / Systemic sclerosis is an autoimmune disease in which one of the major complications is fibrosis. DNA topoisomerase I (topo) is a major autoantigen associated with this disease. However, no link has yet been established between the presence of anti-topo and the development of fibrosis. Previous work of the host laboratory showed a direct interaction of the topo with the surface of fibroblasts and extracellular matrix. We wanted to characterize these interactions at the molecular level. Topo was expressed in 5 fragments, determined from its main structural domains and its major epitopes, in E. coli. The purified fragments were analyzed for their interaction with heparin, representing heparan sulfates on the surface of fibroblasts, and with purified proteins of the extracellular matrix. We have shown that the topo-N fragment is responsible for interaction with heparin, suggesting hence, potential involvement of this domain in the interaction of topo with the surface of fibroblasts. The topo-DIDII fragment is responsible for the interaction with most proteins of the extracellular matrix studied, whereas the topo-H15 fragment only binds to vitronectin. No interaction of fragments topo-DIII and topo-C was found. These results can now be used to better understand the potential role of topo and circulating anti-topo autoantibodies in the fibrosis present in patients with systemic sclerosis in helping to identify the target of topo on fibroblasts.

Le cheval est souvent victime de plaies traumatiques, dont la guérison est fréquemment problématique, et ce, principalement quand la plaie survient sur le membre. Il est courant de voir chez le cheval le développement d’un tissu de granulation exubérant ou « bouton de chair », qui mène à une cicatrisation excessive due à la surproduction de tissu fibreux. Ce tissu cicatriciel, non épithélialisé, est caractérisé par une occlusion au niveau de la microcirculation due à l’hypertrophie des cellules endothéliales, qui laisse supposer la présence d’hypoxie tissulaire. Une hypoxie relative a effectivement été mesurée par spectroscopie dans le proche infrarouge au niveau des plaies appendiculaires prédisposées au développement de tissu de granulation exubérant, par rapport aux plaies corporelles. De plus, une étude thermographique a révélé un patron spatial similaire de la perfusion. Au niveau moléculaire, la littérature rapporte que le facteur de transcription «hypoxia inducible factor» (HIF) est à l’origine de plusieurs changements dans les niveaux d’expression de divers gènes régulés par l’hypoxie. L’objectif du présent projet de recherche était de définir la contribution de l’hypoxie à la guérison cutanée chez le cheval. Le premier volet (in vivo) du projet visait à mesurer l’expression protéique temporelle du HIF1A dans des échantillons tissulaires en provenance de plaies cutanées guérissant normalement et d’autres développant une cicatrisation excessive, selon divers sites anatomiques (tronc, membre). Les résultats obtenus suggèrent que la mesure de HIF1A, dans les échantillons pluricellulaires de cette étude, reflète l’épithélialisation de la plaie plutôt que les niveaux d’oxygène tissulaire. En effet, le HIF1A semble réguler l’homéostasie et la prolifération des kératinocytes. Le second volet (in vitro), consistait en la mise en culture de fibroblastes dermiques équins provenant du tronc ou du membre, en condition de normoxie ou d’hypoxie (à 1% d’O2 ou à l’aide d’un mimétique, le CoCl2) afin d’en étudier le comportement (capacités de prolifération et de synthèse protéique). Les résultats obtenus soutiennent une contribution de l’hypoxie à la cicatrisation extensive chez le cheval puisque l’hypoxie favorise la prolifération des fibroblastes en plus d’encourager la synthèse de collagène de type 1 et de diminuer la synthèse de la métalloprotéinase de type 2. Les changements observés semblent dépendre de facteurs extrinsèques (environnementaux) car les fibroblastes dermiques se comportent de façon similaire indépendamment de la provenance anatomique. En somme, les deux volets de l’étude ont permis d’élucider une part des mécanismes sous-jacents à la formation du tissu de granulation exubérant lors de guérison cutanée chez le cheval. La poursuite des recherches dans ce domaine mènera à une meilleure compréhension de la pathologie et ainsi, permettra de développer des méthodes de traitement spécifiques à la condition. / The horse is often victim of traumatic wounds for which healing can be problematic, mainly when the wound occurs on the limb. The development of exuberant granulation tissue, also known clinically as “proud flesh”, leads to extensive scarring characterized by overproduction of fibrous tissue and the absence of an epithelial cover. This scar tissue suffers from occlusion of the microcirculation within the residual granulation tissue, due to endothelial cell hypertrophy, suggesting tissue hypoxia. The presence of relative hypoxia in limb wounds of horses was recently confirmed using near infrared spectroscopy. Additionally, thermography showed decreased perfusion in limb wounds. Abundant literature incriminates "hypoxia inducible factor” (HIF) in the regulation of expression of a number of genes in response to hypoxia. The overall objective of this research project was to define the contribution of hypoxia to problematic wound healing in horses. The first phase of the project (in vivo) aimed to measure the temporal expression of HIF1A protein in tissue samples taken from skin wounds healing normally and others developing exuberant granulation tissue and subsequent extensive scarring, according to various anatomical sites (trunk, limb). Results suggest that the expression of HIF1A within the pluricellular tissue samples of this study reflects wound epithelialization rather than tissue oxygen levels. Indeed, HIF1A appears to regulate the homeostasis and proliferation of skin keratinocytes. The second phase of the project (in vitro) consisted in the culture of equine dermal fibroblasts from the body or the limb, under conditions of normoxia or hypoxia (1% O2 or using a mimetic, CoCl2) in an effort to study their behavior (proliferation and protein synthesis). Results corroborate the contribution of hypoxia to over-scarring in the horse since hypoxia promotes both the proliferation of dermal fibroblasts and the synthesis of collagen type 1 while decreasing the synthesis of matrix metalloproteinase 2. Extrinsic factors (environmental) appear to govern the behavior of equine dermal fibroblasts since these cells behave similarly regardless of their anatomic origin (body or limb). In summary, the two phases of the study contributed to the elucidation of a portion of the mechanisms underlying the development of exuberant granulation tissue during wound healing in horses. Further research in this area will provide a better understanding of the pathology and thus aid in the design and development of targeted therapies.

Les bones morphogenetic protein (Bmp) sont des morphogènes qui jouent des rôles sur la prolifération et la différenciation cellulaire. La perte de signalisation dans cette voie est associée à la polypose juvénile familiale et à un risque accru de cancer gastrique. Elle est aussi associée avec l’inflammation et la guérison des tissus. Il est montré qu’au niveau de l’estomac, les ligands et les récepteurs de la signalisation des Bmp sont exprimés dans les compartiments épithéliaux et mésenchymateux. Les différents modèles animaux développés ont confirmé l’importance de cette signalisation dans la carcinogenèse gastrique. Cependant, ces modèles causent une perte de signalisation dans l’ensemble de la muqueuse gastrique et ne réussissent pas à montrer un mécanisme. Parallèlement, notre laboratoire a montré qu’une perte de signalisation de la voie des Bmp, exclusivement dans le compartiment épithélial, ne développe pas les phénotypes associés à la progression du cancer gastrique. Ce résultat suggère que les cellules mésenchymateuses pourraient être la clé de l’importance de la signalisation des Bmp dans l’estomac. Afin de mettre en lumière le rôle de la signalisation des Bmp dans le compartiment mésenchymateux, des souris qui perdent de façon spécifique le récepteur de type 1a des Bmp dans ce compartiment ont été généré (Bmpr1aMES). Il semble que la perte de signalisation des Bmp induit au niveau du mésenchyme une modification du comportement et une activation des fibroblastes en myofibroblastes. Cette modification produit également un microenvironnement (matrices, facteurs de croissance, cytokines, interleukines) propice au développement du cancer et induire des modifications importantes de l’épithélium et un appel de cellules immunitaires. Cet environnement semble être suffisant pour réduire de façon importante le nombre de cellules endocriniennes et de cellules pariétales dans l’épithélium gastrique. Il semble que la perte mésenchymateuse de signalisation des Bmp au niveau gastrique entraîne le développement d’une métaplasie au niveau de l’estomac des souris, une hyperplasie atypique qui évolue jusqu'à une dysplasie accompagnée d’une desmoplasie importante. Mes travaux ont également démontré que, dans ce contexte, une mutation oncogénique, comme la perte de Trp53, pourrait devenir maligne. En conclusion, au sein du mésenchyme, la signalisation des Bmp est importante pour le maintien de celui-ci dans un état sain. Il est probable qu’elle joue un rôle important dans le retour à l’état normal suivant les gastrites. Sa perte rend l’estomac des souris fragile au développement d’adénomes. / Abstract : Bone morphogenetic proteins (Bmp) play roles in the proliferation and differentiation. It is also associated with inflammation and tissue repair. Disruption of signaling in this pathway is associated with familial juvenile polyposis and an increase risk of gastric cancer. It has been shown that in the stomach, Bmp signaling is bidirectional. Meaning that ligands and receptors are expressed in both the epithelial and stromal compartments. Gastric abrogation animal models of the Bmp signaling pathway have confirmed the importance of this signaling in gastric carcinogenesis. However these models cause a loss of signaling in both compartments of the gastric mucosa, and the mechanism of action for this has yet been undefined. Previous work by a student in our laboratory provided a model of loss of the Bmp signaling pathway exclusively in the epithelial compartment. This model does not develop phenotypes associated with the progression of gastric cancer, suggesting, that the stromal compartment is the key in tumorigenesis by Bmp signaling in the stomach. To further test this hypothesis, we generated mice with a stromal compartment-specific loss of type1a BMP receptor (Bmpr1aMES). It appears that this deletion in the stroma induced behavior alteration with activation of fibroblasts into myofibroblasts. This change also produces a microenvironment (matrix, growth factors, cytokines, and interleukins) that is conducive to the development of cancer and induces significant modifications of the epithelium as well as a recruitment of immune cells. This microenvironment seems to be sufficient to significantly reduce the number of endocrine cells and parietal cells in the gastric epithelium. It seems that the loss of stromal Bmp signaling in the mice’s stomachs causes development of metaplasia; atypical hyperplasia that progresses to dysplasia accompanied by a significant desmoplasia. My work also shows that in this environment an oncogenic mutation such as the loss of Trp53 may become malignant. In conclusion, in the stromal compartment, Bmp signaling is important for maintaining a healthy state. It is probably involved in the return to the normal state following gastritis, and its loss makes the mouse stomach susceptible to adenoma development.

La gencive correspond à un modèle de régénération naturelle grâce notamment à sa capacité de cicatrisation « ad integrum ». Ce phénomène est permis par sa composition en fibroblastes gingivaux. Ces cellules, composante cellulaire principale du tissu conjonctif gingival, sont au cœur de la régulation des réponses inflammatoires et de la cicatrisation. Ce tissu contient, comme d’autres tissus mésenchymateux, des cellules souches ; qui expliquent en partie ces capacités de régénération. De plus, comme le tissu gingival est abondant et facilement accessible, l’utilisation de ces cellules souches pourraient être d’un intérêt prometteur en thérapie cellulaire ou pour de la modélisation in vitro. Au cours de cette thèse, nous avons pu montrer que les Cellules Souches dérivées de la Gencive Humaine (CSGH) possèdent des propriétés communes avec les cellules souches adultes dérivées des crêtes neurales. Ces cellules peuvent être qualifiées de « souche » par leur capacité d’auto-renouvèlement, d’adhésion au plastique et de multipotence. Premièrement, nous avons montré que la méthode ainsi que les produits de culture utilisés pour l’isolation des fibroblastes gingivaux in vitro à partir de biopsies de gencive avait une influence sur les cellules obtenues. Dans un second temps, une analyse clonale in vitro de populations de fibroblastes gingivaux a permis de montrer que les fibroblastes gingivaux sont composés de sous-populations qui expriment des marqueurs spécifiques des cellules souches et des crêtes neurales. Outre leur origine embryologique, l’étude de leur multipotence a aussi été caractérisée après expansion et en fonction des additifs utilisés. Pour finir, deux exemples d’utilisation de ces cellules comme modèle d’étude de la biocompatibilité de biomatériaux in vitro ont été développés; imitant la muqueuse buccale ainsi que les réactions dentaires (réparatrices et réactionnaire). / Gingiva is a natural regeneration model thanks to its "ad integrum" healing capability. Gingival fibroblasts are the main actors of this property. These cells, the main cellular component of the gingival connective tissue, regulate the inflammatory responses and healing process. This tissue contains, like many others, mesenchymal stem cells; which also partly explain these regenerative abilities. Moreover, as the gingiva is abundant and easily accessible, the use of these stem cells may interest cell therapy or in vitro model tissues responses. In this work, we demonstrated that Stem Cells Derived from Human Gingiva (SCHG) have common properties with neural crest adult stem cells. These cells can be called "stem cells" for their ability to self-renew, adhere to plastic and to differentiate. First, we have shown that the method and the culture products used for isolation of gingival fibroblasts from gingival biopsy had an influence on the obtained cells. Secondly, an analysis of in vitro clonal populations of gingival fibroblasts has shown that gingival fibroblasts are composed of subpopulations that express specific markers of stem cells and neural crests. In addition to their embryological origin, the study of their multipotency was also characterized after expansion and depending on the used additives. Finally, two examples of using these cells and dental pulp stem cells as a model to study the in vitro biocompatibility of biomaterials have been developed, mimicking oral mucosa or dentin reactions (reparative or reactional).

Introduction.Le fibroblaste gingival (FG) est la cellule majoritaire de la gencive. Cette dernière fait face constamment aux agressions physico-chimiques, infectieuses et thermiques. L'une des caractéristiques de la gencive est sa réparation quasi-parfaite suite à une lésion ponctuelle. Ce n'est pas le cas pour d'autres tissus comme la paroi aortique. L'anévrisme aortique (AA) est un affaiblissement de la paroi aortique provoqué par une sécrétion exhaustive de métalloprotéases (MMPs) et en particulier de MMP-9. Il en résulte une dilatation de l'artère. Dans un modèle d'anévrisme de lapin, Durand et al (2012) avait montré que le FG pouvait ralentir, voire réparer un anévrisme. Dans notre étude, nous avons mis en place un modèle de coculture FG/AA d'origine humaine.Chez l'homme, la localisation de la pathologie peut être au niveau abdominal (Anévrisme Aortique Abdominale : AAA) ou thoracique (Anévrisme Aortique Thoracique : AAT). Etant donné que leur étiologie sont différentes, nous avons souhaité savoir s'il existait des différences selon les lésions. Cela nous permettrait en effet de mieux appréhender la prise en charge. Nous avons réalisé une étude comparative histo et physiopathologique entre les AAA et AAT. L'une des différences soulevée, est la présence d'un facteur infectieux au niveau des AAA. C'est un élément à prendre en compte pour une thérapie cellulaire et ainsi nous avons mis en culture des FG en présence de LPS, une endotoxine bactérienne.De plus pour approfondir notre travail sur l'utilisation du FG dans la thérapie cellulaire, nous avons initié une étude sur la plasticité de la sous-population souche des FG en étudiant, notamment leur orientation en cellules vasculaires (cellules endothéliales).Résultats/discussionLe FG, grâce à sa secrétion de TIMP-1, contribue à l'inhibition de la MMP-9 anévrismale. La sécrétion de MMP-9 est plus importante dans les lésions avec athérome (AAA) que celles sans athérome (AAT dans notre étude). Ceci est en corrélation avec la dégradation qui est plus importante dans les AAA que dans les AAT. La MMP-9 est une protéine sécrétée entre autre par les cellules inflammatoires. Une inflammation est présente dans les AAA et pas dans les lésions thoraciques. Ceci pourrait expliquer la différence de sécrétion de MMP-9 et donc de dégradation. Concernant l'origine de cette inflammation, nous avons recherché une cause infectieuse. Porphyromonas gingivalis (Pg) qui est une bactérie importante dans le développement de la parodontite (maladie inflammatoire des tissus de soutien de la dent) a été détectée dans les AAA. Une relation pathologique existerait entre la parodontite et l'AAA mais l'étude devrait être plus poussée pour connaître le mécanisme physiopathologique de ce phénomène. Toutefois, en ce qui concerne la thérapie cellulaire, le LPS qui est une endotoxine du Pg, n'affecte pas la capacité du FG à secréter du TIMP-1.En plus de la possibilité du FG à neutraliser la MMP-9 anévrismale, nous avons souhaité savoir si le FG avait des compétences de différentiation en cellule vasculaire. Un début d'exploration de la plasticité cellulaire de la souche multipotente de FG en cellule endothéliale, donnent des résultats préliminaires encourageants.Conclusion. Le FG pourrait être une cellule prometteuse pour une thérapie cellulaire de l'anévrisme aortique mais des explorations plus poussées sont encore nécessaires pour une telle application. / IntroductionGingival fibroblast (GF) is the main cell in gingiva which is constantly facing infectious, thermal and physico-chemical attacks. When a lesion occurs, the repair of gingiva is almost perfect. It is not the case for other tissues as the aortic wall. The aortic aneurysm (AA) is a pathologic expansion of aorta due to a weakening of the wall with an exhaustive secretion of metalloproteinases (MMPs) and particularly of MMP-9. In an aneurysm rabbit model, Durand and al (2012) have showed that GF could slow down or repair the aneurysm. In our study, we have established a co-culture model of human GF and human AA.For human, the location of the aortic disease may be at abdominal level (Abdominal Aortic Aneurysm: AAA) and thoracic level (Thoracic Aortic Aneurysm: TAA). Since the aetiologies are different, we wondered if histo and physiopathologic differences would existe between the both. It is impotant to know that for better supporting the disease. One of the difference between AAA and TAA is the presence of an infectious factor in AAA. This is an element to consider for cell therapy, so we studied the behavior of GF in presence of an endotoxin, the LPS.In addition, to further our work on the use of GF in cell therapy, we have initiated a study of the plasticity of the GF multipotente subpopulation including the differentiation into vascular cells (endothelial cell in particular).Results/DiscussionThanks to its TIMP-1 secretion, GF could contribute to the inhibition of MMP-9 activity in aneurysm. The secretion of MMP-9 in AA with atheroma (AAA) is highter than in TAA (without atheroma in our study). It is correlated to the degradation of AAA which is more important than the degradation of TAA. Inflammatory cells may secrete MMP-9. Inflammation is present in AAA and not in TAA. This, could explain the highter secretion of MMP-9 in abdominal lesion and also the degradation which is more important in AAA than in TAA. As for the origin of this inflammation, we researched an infectious factor. We isolated Porphyromonas gingivalis (Pg) in AAA, which might trigger or aggravate inflammation. This is an important bacterium in the development of periodontitis (inflammatory disease of the tissues supporting the tooth). A pathological relationship may exist between periodontitis and the AAA. The study should be further to know the pathophysiology of AAA related to Pg. But as regards the cell therapy, LPS, which is an endotoxin of Pg would not affect the secretion of TIMP-1 by the GF.In addition to its abilities to inhibate MMP-9 in aneurysm, we wondered if GF would be able to differentiate into vascular cell. An early exploration of GF multipotent subpopulation plasticity reveals a possible opportunity to go further in a the cell therapy.Conclusion.GF might be a promising cell for treating aortic aneurysm but further explorations are still necessary for its application.

Il a été suggéré que l’autophagie pouvait participer au processus fibrotique en favorisant la différenciation du fibroblaste en myofibroblaste. La sénescence cellulaire a aussi été montrée comme impliquée dans la réparation tissulaire et la fibrose. Des liens ont été établis entre autophagie et sénescence. Cette étude a pour but d’investiguer les liens possibles entre autophagie, sénescence et différenciation myofibroblastique afin de mieux comprendre les mécanismes moléculaires régulant la réparation tissulaire et la fibrose. Les fibroblastes carencés en sérum pendant quatre jours montrent des ratios LC3B-II/-I élevés et des niveaux de SQSTM1/p62 diminués. L’augmentation de l’autophagie est accompagnée d’une augmentation de l’expression des marqueurs de différenciation myofibroblastique ACTA2/αSMA et collagènes de type 1 et 3 et de la formation de fibres de stress. Les fibroblastes autophagiques expriment les marqueurs de sénescence CDKN1A (p21) et p16INK4a (p16) et montrent une augmentation de l’activité beta-galactosidase associée à la sénescence. L’inhibition de l’autophagie à l’aide de différents inhibiteurs de phosphoinositide 3-kinase de classe I et de phosphatidylinositol 3-kinase de classe III (PtdIns3K) ou par inhibition génique à l’aide d’ARN interférant ATG7 bloquent l’expression des marqueurs de différenciation et de sénescence. L’expression et la sécrétion de CTGF (connective tissue growth factor) sont augmentées chez les fibroblastes autophagiques. L’inhibition de l’expression du CTGF par interférence génique prévient la différenciation myofibroblastique, démontrant l’importance de ce facteur pro-fibrotique pour la différenciation induite par l’autophagie. La phosphorylation de la kinase RPS6KB1/p70S6K, cible du complexe MTORC1, est abolie dans les fibroblastes autophagiques. La phosphorylation d’AKT à la Ser473, une cible du complexe MTORC2, diminue lors de la carence en sérum des fibroblastes mais est suivie d’une rephosphorylation après 2 jours. Ce résultat suggère la réactivation de MTORC2 lors d’une autophagie prolongée. Ceci a été vérifié par inhibition de l’autophagie dans les fibroblastes carencés en sérum. Les inhibiteurs de PtdIns3K et le siRNA ATG7 bloquent la rephosphorylation d’AKT. L’inhibition de la réactivation de MTORC2, et donc de la rephosphorylation d’AKT, est aussi obtenue par exposition des fibroblastes à la rapamycine, le Torin 1 ou par inhibition génique de RICTOR. Ces traitements inhibent l’augmentation de l’expression du CTGF ainsi que des marqueurs de différenciation et de sénescence, démontrant le rôle central joué par MTORC2 dans ces processus. Le stress oxydant peut induire la sénescence et la carence en sérum est connue pour augmenter la quantité de ROS (reactive oxygen species) dans les cellules. Afin d’investiguer le rôle des ROS dans la différenciation et la sénescence induites par l’autophagie, nous avons incubés les fibroblastes carencés en sérum en présence de N-acetyl-L-cysteine (NAC). Le NAC diminue la production de ROS, diminue les marqueurs d’autophagie, de sénescence et de différenciation myofibroblastique. Le NAC inhibe aussi la phosphorylation d’AKT Ser473. L’ensemble de ces résultats identifient les ROS en association avec une autophagie prolongée comme des nouveaux activateurs du complexe MTORC2. MTORC2 est central pour l’activation subséquente de la sénescence et de la différenciation myofibroblastique. / Recent evidence suggests that autophagy may favor fibrosis through enhanced differentiation of fibroblasts in myofibroblasts. Cellular senescence is also involved in tissue repair and fibrosis. Autophagy has been linked with senescence. This study focuses on understanding the molecular mechanisms linking autophagy, senescence and myofibroblast differentiation and the roles they could play in wound healing and fibrosis. Fibroblasts, serum starved for up to 4 days, showed increased LC3B-II/-I ratios and decreased SQSTM1/p62 levels. Autophagy was associated with acquisition of markers of myofibroblast differentiation including increased protein levels of ACTA2/αSMA (actin, α 2, smooth muscle, aorta), enhanced gene and protein levels of COL1A1 (collagen, type I, α 1) and COL3A1, and the formation of stress fibers. Autophagic fibroblasts showed expression of the senescence markers CDKN1A (p21) and p16INK4a (p16) and also exhibit increase in Senescence Associated-beta-galactosidase activity. Inhibiting autophagy with different class I phosphoinositide 3-kinase and class III phosphatidylinositol 3-kinase (PtdIns3K) inhibitors or through ATG7 silencing prevented myofibroblast differentiation and senescence markers expression. Autophagic fibroblasts showed increased expression and secretion of CTGF (connective tissue growth factor), and CTGF silencing prevented myofibroblast differentiation. Phosphorylation of the MTORC1 target RPS6KB1/p70S6K kinase was abolished in starved fibroblasts. Phosphorylation of AKT at Ser473, a MTORC2 target, was reduced after initiation of starvation but was followed by spontaneous rephosphorylation after 2 d of starvation, suggesting the reactivation of MTORC2 with sustained autophagy. Importantly, inhibition of autophagy with PtdIns3K inhibitors or ATG7 silencing blocked AKT rephosphorylation. Inhibiting MTORC2 activation with long-term exposure to rapamycin, Torin 1 or by silencing RICTOR, a central component of the MTORC2 complex, abolished AKT rephosphorylation. RICTOR silencing, Torin 1 and rapamycin treatments prevented CTGF and ACTA2 upregulation and induction of senescence markers demonstrating the central role of MTORC2 activation in CTGF and senescence induction for myofibroblast differentiation. Since oxidative stress is a known inducer of senescence, we investigated the role of reactive oxygen species (ROS) in autophagy-induced myofibroblast differentiation and senescence markers induction. Exposing fibroblasts to N-acetyl-L-cysteine (NAC) decreased production of ROS during serum starvation, inhibited autophagy and significantly decreased the expression of senescence and myofibroblast differentiation markers. NAC also inhibited the phosphorylation of AKT Ser473, establishing the importance of ROS in fuelling MTORC2 activation. Collectively, these results identify ROS production in association with sustained autophagy as novel inducers of MTORC2 signaling which in turn concomitantly activate senescence and myofibroblast differentiation.

L’apoptose des cellules endothéliales (CE) représente un évènement initial dans le développement de plusieurs pathologies fibrotiques telles que le rejet chronique d’allogreffe et la sclérose systémique. Nous avons démontré que les médiateurs issus des CE apoptotiques entraîne la différenciation myofibroblastique et la résistance à l’apoptose, deux mécanismes centraux à la fibrogénèse. L’activation de PI3K (phospatidylinositol-3 kinase) caractérise ces deux mécanismes. Un fragment C-terminal du perlécan (LG3) produit par les CE apoptotiques inhibe l’apoptose des fibroblastes. Les objectifs de ce travail étaient de : 1. définir les récepteurs et la signalisation impliqués dans la réponse anti-apoptotique et 2. caractériser les médiateurs fibrogéniques responsables de la différenciation myofibroblastique. En ce qui a trait à la réponse anti-apoptotique, l’inhibition des intégrines 21 ou des kinases de la famille Src (SFK) chez les fibroblastes prévient la résistance à l’apoptose et la phosphorylation d’Akt normalement induites par le milieu conditionné par des CE apoptotiques (SSC) ou le LG3. Ces résultats suggèrent que le LG3 produit par les CE apoptotiques initie un état de résistance à l’apoptose chez les fibroblastes par des voies α2β1integrines/SFK/PI3K dépendantes. Le LG3 n’induit cependant pas la différenciation myofibroblastique. Nous avons donc caractérisé le milieu SSC de façon à identifier les médiateurs responsables de la différenciation myofibroblastique. Les milieux conditionnés par des CE apoptotiques et non-apoptotiques (respectivement SSC et SSC-ZVAD) ont été analysés comparativement par chromatographie liquide bi-dimensionnelle, immunobuvardage et spectrométrie de masse. Le connective tissue growth factor (CTGF) est le seul facteur fibrogénique connu augmenté dans le milieu SSC. L’inhibition de la caspase-3 chez les CE prévient la relâche de CTGF. Au niveau du fibroblaste, l’inhibition de SFK ou de Pyk2 (proline-rich tyrosine kinase-2) prévient la différenciation myofibroblastique induite par le SSC ou le CTGF in vitro. L’anticorps neutralisant contre le TGF- (Transforming growth factor beta) n’est pas en mesure de bloquer la différenciation myofibroblastique induite par le SSC ou le CTGF. Des injections quotidiennes sous-cutanées de SSC chez la souris C3H pour 3 semaines entraîne une augmentation de l’épaisseur de la peau et des niveaux protéiques d’SMA, de vimentine et de collagène I. Cette réponse fibrogénique est réduite chez les souris qui ont reçu le SSC-ZVAD ou le SSC immunodéplété de son CTGF. Ces résultats apportent de nouvelles issues mécanistiques au niveau de la réponse fibrogénique activée par la mort des CE. L’activation des caspases chez les CE apoptotiques entraîne la production de LG3 et de CTGF qui, à leur tour, activent des voies de signalisation pro-fibrotiques SFK/PI3K dépendantes chez les fibroblastes, et ce indépendamment du TGF-. / Apoptosis of endothelial cells (EC) is an early event in various fibrotic diseases including chronic allograft vasculopathy and systemic sclerosis. We showed previously that mediators released by apoptotic EC activate myofibroblast differentiation and resistance to apoptosis, two mechanisms pivotal to fibrogenesis. PI3K (phospatidylinositol-3 kinase) activation was found to be central to these two mechanisms. A C-terminal fragment of perlecan (LG3) produced by apoptotic EC was found to inhibit apoptosis of fibroblasts. The aims of the present project were : 1. to define the receptors and pathways implicated in this anti-apoptotic response and 2. to characterize the fibrogenic mediators implicated in myofibroblast differentiation. Concerning the anti-apoptotic response, the inhibition of 21 integrin activity in fibroblasts exposed to either medium conditioned by apoptotic EC (SSC) or LG3 prevented resistance to apoptosis and was associated with decreased levels of Akt phosphorylation. Neutralizing Src family kinases (SFK) activity in fibroblasts produced the same effects. These results suggest that LG3 produced by apoptotic EC initiate a state of resistance to apoptosis in fibroblasts via an α2β1integrin/SFK/PI3K dependent pathway. LG3 did not induce myofibroblast differentiation. We went on to identify which mediators present in SSC are implicated in myofibroblast differentiation. Media conditioned by apoptotic and non-apoptotic EC (respectively SSC and SSC-ZVAD) were analyzed comparatively by 2-dimension liquid chromatography, western blotting and mass spectrometry. Connective tissue growth factor (CTGF) was the only known fibrogenic factor increased in SSC. Caspase-3 silencing of EC demonstrated that CTGF is released by apoptotic EC downstream of caspase-3 activation. In fibroblasts, blocking the activation of SFK or silencing the proline-rich tyrosine kinase 2 (Pyk2) blocked myofibroblast differentiation triggered by either SSC or recombinant CTGF in vitro. Exposure to a pan-transforming growth factor (TGF-β) neutralizing antibody failed to attenuate myofibroblast differentiation in fibroblasts exposed to either SSC or CTGF. Subcutaneous injection of mouse SSC to C3H mice daily for three weeks led to increased skin thickness, increased protein levels of αSMA, vimentin and collagen I. This fibrogenic response was blunted in mice injected with either SSC-ZVAD or SSC immunodepleted of CTGF. These results bring new mechanistic insights into the fibrogenic pathways activated by EC death. Caspase activation in apoptotic EC triggers the production of LG3 and CTGF which in turn activate SFK/PI3K dependant pathways in fibroblasts thus activating a TGF-β-independent fibrogenic response.

La moxonidine, un médicament antihypertenseur sympatholytique de type imidazolinique, agit au niveau de la médulla du tronc cérébral pour diminuer la pression artérielle, suite à l’activation sélective du récepteur aux imidazolines I1 (récepteur I1, aussi nommé nischarine). Traitement avec de la moxonidine prévient le développement de l’hypertrophie du ventricule gauche chez des rats hypertendus (SHR), associé à une diminution de la synthèse et une élévation transitoire de la fragmentation d’ADN, des effets antiprolifératifs et apoptotiques. Ces effets se présentent probablement chez les fibroblastes, car l’apoptose des cardiomyocytes pourrait détériorer la fonction cardiaque. Ces effets apparaissent aussi avec des doses non hypotensives de moxonidine, suggérant l’existence d’effets cardiaques directes. Le récepteur I1 se trouvé aussi dans les tissus cardiaques; son activation ex vivo par la moxonidine stimule la libération de l’ANP, ce qui montre que les récepteurs I1 cardiaques sont fonctionnels malgré l’absence de stimulation centrale. Sur la base de ces informations, en plus du i) rôle des peptides natriurétiques comme inhibiteurs de l’apoptose cardiaque et ii) des études qui lient le récepteur I1 avec la maintenance de la matrix extracellulaire, on propose que, à part les effets sympatholytiques centrales, les récepteurs I1 cardiaques peuvent contrôler la croissance-mort cellulaire. L’activation du récepteur I1 peut retarder la progression des cardiopathies vers la défaillance cardiaque, en inhibant des signaux mal adaptatifs de prolifération et apoptose. Des études ont été effectuées pour : 1. Explorer les effets in vivo sur la structure et la fonction cardiaque suite au traitement avec moxonidine chez le SHR et le hamster cardiomyopathique. 2. Définir les voies de signalisation impliquées dans les changements secondaires au traitement avec moxonidine, spécifiquement sur les marqueurs inflammatoires et les voies de signalisation régulant la croissance et la survie cellulaire (MAPK et Akt). 3. Explorer les effets in vitro de la surexpression et l’activation du récepteur I1 sur la survie cellulaire dans des cellules HEK293. 4. Rechercher la localisation, régulation et implication dans la croissance-mort cellulaire du récepteur I1 in vitro (cardiomyocytes et fibroblastes), en réponse aux stimuli associés au remodelage cardiaque : norépinephrine, cytokines (IL-1β, TNF-α) et oxydants (H2O2). Nos études démontrent que la moxonidine, en doses hypotensives et non-hypotensives, améliore la structure et la performance cardiaque chez le SHR par des mécanismes impliquant l’inhibition des cytokines et des voies de signalisation p38 MAPK et Akt. Chez le hamster cardiomyopathique, la moxonidine améliore la fonction cardiaque, module la réponse inflammatoire/anti-inflammatoire et atténue la mort cellulaire et la fibrose cardiaque. Les cellules HEK293 surexprimant la nischarine survivent et prolifèrent plus en réponse à la moxonidine; cet effet est associé à l’inhibition des voies ERK, JNK et p38 MAPK. La surexpression de la nischarine protège aussi de la mort cellulaire induite par le TNF-α, l’IL-1β et le H2O2. En outre, le récepteur I1 s’exprime dans les cardiomyocytes et fibroblastes, son activation inhibe la mort des cardiomyocytes et la prolifération des fibroblastes induite par la norépinephrine, par des effets différentiels sur les MAPK et l’Akt. Dans des conditions inflammatoires, la moxonidine/récepteur aux imidazolines I1 protège les cardiomyocytes et facilite l’élimination des myofibroblastes par des effets contraires sur JNK, p38 MAPK et iNOS. Ces études démontrent le potentiel du récepteur I1/nischarine comme cible anti-hypertrophique et anti-fibrose à niveau cardiaque. L’identification des mécanismes cardioprotecteurs de la nischarine peut amener au développement des traitements basés sur la surexpression de la nischarine chez des patients avec hypertrophie ventriculaire. Finalement, même si l’effet antihypertenseur des agonistes du récepteur I1 centraux est salutaire, le développement de nouveaux agonistes cardiosélectifs du récepteur I1 pourrait donner des bénéfices additionnels chez des patients non hypertendus. / Moxonidine, an antihypertensive sympatholytic imidazoline compound, reduces blood pressure by selective activation of non-adrenergic imidazoline I1-receptors (also known as nischarin) in brainstem medulla. Moxonidine prevents left ventricular hypertrophy development in hypertensive rats, associated with reduced cardiac DNA synthesis and early transient increase in DNA fragmentation. It is likely that the anti-proliferative and apoptotic effects occur in fibroblasts, as cardiomyocyte apoptosis may deteriorate cardiac function. The effects also occurred to sub-hypotensive doses, suggesting a blood-pressure-independent mechanism and pointing to a local cardiac action. Imidazoline I1-receptors have been identified in cardiac tissues, and their ex vivo activation by moxonidine stimulates ANP release, demonstrating that cardiac imidazoline I1-receptors are functional without the contribution of the central nervous system. Based on the above studies and on i) the role of natriuretic peptides in inhibition of myocardial cell apoptosis and ii) studies linking imidazoline I1-receptors to the maintenance of the extracellular matrix and PC12 cell survival, we propose that apart from centrally-mediated sympatholytic function, imidazoline I1-receptors in the heart may control cell growth and death. Activation of imidazoline receptors may delay the progression of cardiac pathologies into heart failure by inhibition of maladaptive proliferative signalling and downstream apoptotic pathways. In order to test this hypothesis studies were performed to: 1. Explore the in vivo effects of moxonidine on cardiac structure and function in SHR and cardiomyopathic hamsters. 2. Define the pathways involved in the observed changes following moxonidine treatment, specifically, on inflammatory markers and pathways involved in LVH and cardiac cell survival/death (MAPK and Akt). 3. Explore in vitro the effect of imidazoline I1-receptor activation by moxonidine, on cell survival by over-expressing nischarin in HEK293 cells, to circumvent the lack of specific imidazoline I1-receptor agonists and antagonists. 4. Investigate in vitro, imidazoline I1-receptor localization (cardiomyocytes and fibroblasts), regulation and implication in cell growth/death in response to cardiac remodelling-associated stimuli: norepinephrine, cytokines (IL-1β, TNF-α), and oxidants (H2O2). The studies reveal that hypotensive and sub-hypotensive concentrations of moxonidine improve cardiac structure and performance in SHR by mechanisms that involve inhibition of cytokines, p38MAPK, and Akt signalling pathways. In cardiomyopathic hamsters moxonidine improves cardiac performance, in association with differential inflammatory/anti-inflammatory responses that culminate in attenuated cardiomyocyte death and fibrosis and altered collagen type expression. HEK293 cells, transfected with nischarin cDNA, show increased viability/proliferation in response to moxonidine. The overall survival response is associated with moxonidine’s inhibition of ERK, JNK, and p38MAPK. Nischarin also opposes the reduced cell viability in response to oxidative stimuli (TNF-α, IL-1β and H2O2), with differential responses to moxonidine. Furthermore, the imidazoline I1-receptor is expressed in cardiac fibroblasts and myocytes and its activation inhibits norepinephrine-induced cardiomyocyte death and fibroblast proliferation, through differential effects on MAPKs and Akt. Moxonidine/imidazoline I1-receptor protects cardiomyocytes and facilitates elimination of myofibroblasts in inflammatory conditions, through opposite effects on JNK, p38MAPK and iNOS activity. These studies emphasize the potential importance of imidazoline I1-receptor/nischarin as an anti-hypertrophic and anti-fibrotic target. Identification of the cardio-protective mechanisms of cardiac nischarin could result in specifically-tailored cell/gene-driven nischarin treatments, which could be important for patients with heart disease. Also, while the antihypertensive action of centrally acting compounds is appreciated, new cardiac-selective I1-receptor agonists may confer additional benefit.

Les ligaments jouent un rôle important dans le mouvement et la stabilité des articulations. Les accidents et la fatigue chronique sont les principales raisons des ruptures de ligaments qui n’ont généralement pas de capacité de guérison, ce qui conduit à de graves dysfonctionnements du ligament et des articulations. La construction des ligaments en bioingénierie donne un nouvel espoir thérapeutique. Pour construire un tel tissu, les cellules sont très importantes dans la mise en oeuvre de la construction d’un biotissu ayant de bonnes propriétés tant biologiques que mécaniques. Quelle source cellulaire et quel microenvironnement doivent être utilisés pour la reconstruction des ligaments ? L’objectif de ce travail était d’étudier la différenciation des cellules souches mésenchymateuses médullaires (CSMM) en fibroblaste. Pour ce faire, d’une part, nous avons co-cultivé des CSMM du rat sans contact avec des fibroblastes ligamentaires, et d’autre part, nous avons stimulé mécaniquement les CSMM. Un suivi des ARNm et des protéines associées caractéristiques des ligaments (collagènes I et III et ténascine-C) a été analysés. Nos résultats expérimentaux ont montré que la culture des CSMM dans un microenvironnement fibroblastique de ligaments ou l’étirement favorisent les synthèses de collagènes I et III et de ténascine-C dans les proportions proches des ligaments. L’ensemble de cette étude suggère qu’il est envisageable d’utiliser les CSMM comme source cellulaire, pour une application clinique, en ingénierie tissulaire du ligaments / Ligaments play an important role in the movement and stability of joints. Accidents and chronic fatigues are the main reasons for ligament lesion which usually is difficult for self healing and leads to serious dysfunction of ligaments and joints. The construction of bioengineering ligaments gives a new way to overcome this problem. Cells are very important in the construction of a biotissue with appropriate biological as well as mechanical properties. Which cellular source and microenvironment should be used for the reconstruction of ligaments? The objective of this work is to study the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cell (BMSC) into fibroblast. We co-cultured indirectly rat BMSC with ligament fibroblasts or stimulated them by mechanical stretching. After that, the expressions of characteristics mRNA and protein of ligaments (collagen I, III and tenascin-C) have been analyzed. Our experimental results showed that the culture of BMSC in a microenvironment of ligament fibroblast or under stretching favored the syntheses of collagen I, III and tenascin-C in the proportions close to ligaments. In summary, these studies suggest it is feasible to use BMSC as cellular source for a clinical application in tissue engineering of ligaments