B. diazoefficiens CPAC 7 e B. japonicum CPAC 15 são estirpes brasileiras de Bradyrhizobium que apresentam grande relevância para o cultivo da soja, pois são capazes de fornecer nitrogênio para a produção desta leguminosa através do processo de fixação biológica de nitrogênio (FBN), uma técnica sustentável e de baixo custo. Por esse motivo, tais bactérias são de grande interesse, e seu estudo contribui na compreensão do processo complexo e orquestrado por um conjunto de genes específicos que culmina no estabelecimento da simbiose. A estirpe CPAC 7 possui maior eficiência em fixar N2 , e a CPAC 15 destaca-se pela sua competitividade. Recentemente, o genoma de cada uma foi sequenciado na tentativa de conhecer seu conteúdo gênico e identificar os fatores genéticos responsáveis pelas diferenças no desempenho simbiótico. Apesar de ter sido encontrado alguns rearranjos, os genoma mostraram-se sintênicos na sua maioria. Entretanto, o fato de haver muitas transposases ao redor dos genes, principalmente na ilha simbiótica, e devido a presença de muitos genes hipotéticos, representando uma limitação no conhecimento, nos motivou a realizar o presente estudo, onde exploramos estes dois genomas. Portanto, os objetivos deste estudo foram de definir a população de elementos de transposição (TEs) que compõe estes genomas, avaliar se os elementos completos podem estar impactando os genes de alguma forma; explorar as proteínas hipotéticas, tentando identificar novas funções que possam estar associadas com a interação soja-Bradyrhizobium e apontá-las para estudos experimentais futuros; e ainda explorar os genes exclusivos das regiões atípicas dos genomas, sendo que para isso, nós também desenvolvemos uma nova metodologia, baseada na máxima entropia (ME), que pode ser utilizada em novos estudos genômicos a partir da simples sequência nucleotídica. Todas as análises deste estudo foram realizadas in silico. Estudando os TEs, identificamos 33 novas sequências de inserção, sendo que algumas destacaram-se por terem potencial impacto nos genes associados com a simbiose destas bactérias, como nopAN, nopAG, rhcU, modC e hypB. Explorar as proteínas hipotéticas nos permitiu reduzir a porcentagem de hipotéticas dos genomas. Adicionamos novas informações à 1.204 proteínas, das quais muitas apresentaram similaridade com proteínas comprovadamente associadas com a interação planta-bactéria, em condições de simbiose e/ou patogenicidade, como proteínas envolvidas na motilidade e adesão celular, fatores de virulência, proteínas secretoras e efetoras, entre outras. Além disso, a metodologia ME, desenvolvida neste estudo com o intuito de direcionar análises genômicas para regiões atípicas, quando comparada com outras ferramentas existentes, mostrou-se superior em termos de eficiência e tempo de execução computacional. Nas regiões genômicas apontadas pela ME nos dois genomas de interesse, identificamos 269 genes exclusivos de CPAC 7 e 368 de CPAC 15, sendo que destacamos aqueles com potencial relação com as diferenças simbióticas das estirpes, como o gene fixW, noeE, rtxA e nex18. Assim, os resultados obtidos neste trabalho vêm expandir nosso conhecimento sobre os genomas destas estirpes. Destacando ainda, importantes diferenças que podem estar associadas com a habilidade simbiótica de cada bactéria. / B. diazoefficiens CPAC 7 and B. japonicum CPAC 15 are Brazilian Bradyrhizobium strains of great importance for soybean cultivation, since when in a symbiotic state they provide nitrogen for the crop through the biological nitrogen fixation process (BNF), a sustainable technique and low cost. For this reason, such bacteria represent great interest and have been widely studied, once the symbiotic establishment is a complex process and orchestrated by a specific set of genes. The CPAC 7 strain has a higher efficiency to fix N2 , while CPAC 15 stands out for its competitiveness. Recently, their genomes were sequenced in an attempt to gain knowledge about their gene content and to identify the genetic factors responsible for differences in their symbiotic performance. Despite having identified some rearrangements, the majority of genomes showed syntenic. However, the fact that there are many transposases around the genes, especially in symbiotic island, and due to the presence of many hypothetical genes, representing a limitation on knowledge, motivated us to conduct this study, which explored these two important genomes. Therefore, the objectives of this study were to define the population of transposable elements (TEs) present in these genomes and to verify whether such TEs could be impacting the genes somehow; to study the hypothetical proteins, trying to identify new features that may be associated with the soybean-Bradyrhizobium interaction and point them for future experimental studies; and to explore the exclusive genes from atypical regions of both genomes, and for that, we have also developed a new methodology, based on maximum entropy (ME), which can be used in new genomic studies. All analyzes in this study were performed in silico. Studying the TEs, we identified 33 new insertion sequences, and some stood out for having potential impact on genes associated with the symbiosis of these bacteria, such as nopAN, nopAG, rhcU, modC and hypB. As a consequence of improving the annotation of hypothetical proteins we were able to reduce the hypothetical percentage. Among these, we add new information to 1,204 proteins, many of which had similarity to proteins with involvement in the plant-bacteria interaction, in symbiosis and/or pathogenicity conditions, such as proteins involved in cell motility and adhesion, virulence factors, secretion proteins, effectors, among others. Moreover, the ME methodology developed in this study to direct genomic analysis to atypical regions, compared with other existing tools, it was superior in efficiency and execution time. In the genomic regions identified by the ME in both Bradyrhizobium genomes, we identified 269 exclusive genes of CPAC 7 and 368 of CPAC 15, we highlighted those with potential involvement with symbiotic differences of strains, as fixW, noeE, rtxA and nex18. Thus, the results obtained in this study come to expand our knowledge about the genomes of these important bacteria. Finally, differences were identified as potential targets to be associated with the symbiotic ability of each strain to be futher studied.

A estrutura das comunidades de arquéias e bactérias amônio oxidantes (AOA e AOB, respectivamente) e de bactéria fixadoras de nitrogênio de vida livre (BFNVL) foi avaliada em amostras de solo coletadas em três áreas de Mata Atlântica do Estado de São Paulo (Santa Virgínia, Picinguaba e Restinga) por meio de metodologias independentes de cultivo. Após a extração do DNA do solo, o perfil das comunidades de AOA, AOB e BFNVL foi acessado por PCR-DGGE e seus respectivos genes, amoA, 16S DNAr e nifH, quantificados por meio de qPCR. Além disso, foi realizado o pirosequenciamento do gene 16S DNAr da região V3 em arquéias e da região V4 de bactérias. Os dados foram submetidos às análises de redundância (RDA) e similaridade (ANOSIM) e ao teste de Mantel. Foram observadas diferenças significativas na estrutura das comunidades de AOA, AOB e BFNVL, sugerindo que a cobertura vegetal, assim como os atributos físico-químicos do solo, influencia a atividade destes micro-organismos nas três áreas. Santa Virgínia e Picinguaba apresentaram maior abundância de AOA e AOB, sendo AOA proporcionalmente mais abundante do que AOB em todas as áreas. Já as comunidades de BFNVL foram mais abundantes em Santa Virgínia e Restinga. A diversidade das comunidades de Crenarchaeota foi similar entre as áreas, porém, Picinguaba revelou maior diversidade de unidades taxonômicas operacionais (UTOs). Este trabalho possibilitou uma primeira exploração da diversidade e abundância das comunidades de AOA, AOB e BFNVL nos solos de Mata Atlântica do Estado de São Paulo, sendo que as informações obtidas poderão auxiliar futuros estudos sobre o entendimento do papel destas comunidades no ciclo global do nitrogênio na Terra. / The community structure of ammonia-oxidizing archaea and bacteria (AOA and AOB, respectively) and free-living nitrogen-fixing bacteria was evaluated in soil samples collected in three areas of Atlantic forest of São Paulo (Santa Virgínia, Picinguaba and Restinga) using culture-independent molecular techniques. After DNA extraction from the soil samples, AOA, AOB and BFNVL profiles were accessed by PCR-DGGE, and their respective genes (amoA, nifH and 16S rDNA) were quantified by qPCR. In addition, it was performed the pyrosequencing of the 16S rDNA variable V3 and V4 regions of archaea and bacteria, respectively. The data were subjected to redundancy analysis (RDA); analysis of similarity (ANOSIM); and the Mantel test. There were significant differences in the AOA, AOB and BFNVL community structure, suggesting that the vegetation cover and the physical and chemical attributes of soil influences the activity of these micro-organisms from the three areas. AOA and AOB were more abundant in Santa Virginia and Picinguaba, and AOA was more abundant than AOB in all areas. On the other hand, BFNVL communities were more abundant in Santa Virginia and Restinga. The diversity of Crenarchaeota communities was similar among the three areas, however, Picinguaba revealed greater diversity of operational taxonomic units (OTUs). This study allowed the first evaluation of the diversity and abundance of AOA, AOB and free-living nitrogen-fixing bacteria communities in the soils of the Atlantic Forest of the São Paulo State, Brazil. The information obtained here will support future studies focused on the role of these communities in the global nitrogen cycle on Earth.

Orientador: Anselmo Nogueira / Resumo: Muitas características fenotípicas das plantas mudam drasticamente ao longo do desenvolvimento vegetal e podem influenciar as interações ecológicas. Dado que existe um custo energético associado a manutenção de diferentes mutualismos, investigamos a relação entre os estádios de desenvolvimento vegetal e o estabelecimento de três mutualismos, assim como a possível interferência do mutualismo raiz-rizóbio sobre os mutualismos nectário extrafloral-formiga e flor-abelha. No campo selecionamos 30 plantas da espécie de leguminosa de Cerrado, Chamaecrista desvauxii var. latistipula, com diferentes tamanhos, de indivíduos juvenis a maiores reprodutivos, para avaliar a ocorrência e intensidade das interações mutualistas raiz-rizóbio, nectário extrafloral-formiga e flor-abelha. Em casa de vegetação montamos um experimento manipulando as bactérias do tipo rizóbio e o tipo de solo em que as plantas foram cultivadas, no qual investigamos a interferência da interação raiz-rizóbio sobre os recursos vegetais disponíveis para outros mutualismos. As plantas amostradas em campo variaram entre 4 a 1300 unidade de tamanho. A interação raiz-rizóbio e nectário extrafloral-formiga ocorreu em plantas ainda muito pequenas, enquanto a interação flor-abelha se estabeleceu em plantas maiores. A intensidade da interação teve padrão exponencial para os nódulos radiculares e visitação das abelhas, e quadrático para as formigas. Esses padrões distintos na intensidade dos mutualismos sugeriram possível interf... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Plant phenotypic traits change drastically throughout plant development and can modify ecological interactions. Whereas there is an energy cost associated with maintenance of different mutualisms on the same plant, we investigated the relationship between plant development and the establishment of multiple mutualisms. Besides, we evaluated the possible interference of the root-rhizobia mutualism on extrafloral nectary-ant and flower-bee mutualisms. In the field, we selected 30 plants of Cerrado legume species, Chamaecrista desvauxii var. latistipula, with different sizes, from juvenile to reproductive individuals, to evaluate the occurrence and intensity of root-rhizobia, extrafloral nectary-ant and flower-bee interactions. In a greenhouse, we manipulate the rhizobia bacteria and soil type, investigating the interference of root-rhizobia on plant resources available for other mutualisms. Plants sampled in field ranged from 4 to 1300 plant size. Root-rhizobia and extrafloral nectary-ant interactions occurred on tiny plants, while flower-bee interaction was established on larger plants. The strength of interactions had an exponential pattern for root nodules and bee visitation, and quadratic for ant visitation. These distinct patterns suggested a possible interference between mutualisms since the number of root nodules and the flower-bee interaction increased and the extrafloral nectary-ant interaction decreased. Moreover, in the rhizobium exclusion experiment, plants with inoc... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

A estrutura das comunidades de arquéias e bactérias amônio oxidantes (AOA e AOB, respectivamente) e de bactéria fixadoras de nitrogênio de vida livre (BFNVL) foi avaliada em amostras de solo coletadas em três áreas de Mata Atlântica do Estado de São Paulo (Santa Virgínia, Picinguaba e Restinga) por meio de metodologias independentes de cultivo. Após a extração do DNA do solo, o perfil das comunidades de AOA, AOB e BFNVL foi acessado por PCR-DGGE e seus respectivos genes, amoA, 16S DNAr e nifH, quantificados por meio de qPCR. Além disso, foi realizado o pirosequenciamento do gene 16S DNAr da região V3 em arquéias e da região V4 de bactérias. Os dados foram submetidos às análises de redundância (RDA) e similaridade (ANOSIM) e ao teste de Mantel. Foram observadas diferenças significativas na estrutura das comunidades de AOA, AOB e BFNVL, sugerindo que a cobertura vegetal, assim como os atributos físico-químicos do solo, influencia a atividade destes micro-organismos nas três áreas. Santa Virgínia e Picinguaba apresentaram maior abundância de AOA e AOB, sendo AOA proporcionalmente mais abundante do que AOB em todas as áreas. Já as comunidades de BFNVL foram mais abundantes em Santa Virgínia e Restinga. A diversidade das comunidades de Crenarchaeota foi similar entre as áreas, porém, Picinguaba revelou maior diversidade de unidades taxonômicas operacionais (UTOs). Este trabalho possibilitou uma primeira exploração da diversidade e abundância das comunidades de AOA, AOB e BFNVL nos solos de Mata Atlântica do Estado de São Paulo, sendo que as informações obtidas poderão auxiliar futuros estudos sobre o entendimento do papel destas comunidades no ciclo global do nitrogênio na Terra. / The community structure of ammonia-oxidizing archaea and bacteria (AOA and AOB, respectively) and free-living nitrogen-fixing bacteria was evaluated in soil samples collected in three areas of Atlantic forest of São Paulo (Santa Virgínia, Picinguaba and Restinga) using culture-independent molecular techniques. After DNA extraction from the soil samples, AOA, AOB and BFNVL profiles were accessed by PCR-DGGE, and their respective genes (amoA, nifH and 16S rDNA) were quantified by qPCR. In addition, it was performed the pyrosequencing of the 16S rDNA variable V3 and V4 regions of archaea and bacteria, respectively. The data were subjected to redundancy analysis (RDA); analysis of similarity (ANOSIM); and the Mantel test. There were significant differences in the AOA, AOB and BFNVL community structure, suggesting that the vegetation cover and the physical and chemical attributes of soil influences the activity of these micro-organisms from the three areas. AOA and AOB were more abundant in Santa Virginia and Picinguaba, and AOA was more abundant than AOB in all areas. On the other hand, BFNVL communities were more abundant in Santa Virginia and Restinga. The diversity of Crenarchaeota communities was similar among the three areas, however, Picinguaba revealed greater diversity of operational taxonomic units (OTUs). This study allowed the first evaluation of the diversity and abundance of AOA, AOB and free-living nitrogen-fixing bacteria communities in the soils of the Atlantic Forest of the São Paulo State, Brazil. The information obtained here will support future studies focused on the role of these communities in the global nitrogen cycle on Earth.