Os resultados obtidos no mestrado mostraram que a samambaia do campo (Pteridium aquilinum) reduz a citotoxicidade das células natural killer (NK) esplênicas e a resposta imune celular do tipo tardia (DTH) de camundongos. Entretanto, até aquele momento não era sabido qual a célula afetada pela planta causava a diminuição da DTH. Assim, o objetivo inicial deste estudo foi verificar qual a célula envolvida na diminuição da DTH. Além disto, buscou-se descobrir o mecanismo de ação imunotóxico da P. aquilinum, o principio tóxico envolvido e se este efeito poderia ser revertido pelo selênio (Se). Para tal, camundongos C57BL/6 foram administrados com extrato de P. aquilinum, por gavage, durante 30 dias e suplementados com Se por mais 30 dias e a análise histológica revelou redução significativa na área de polpa branca esplênica que foi completamente revertida pelo tratamento com Se. Ainda, foi possível verificar que a diminuição da DTH foi causada pela redução da produção de IFNγ pelas células NK durante a indução da resposta imune celular. Além disto, camundongos administrados com ptaquilosídeo, por gavage, durante 14 dias mostraram a mesma redução na atividade das células NK causada pelo extrato de P. aquilinum, assim como a prevenção deste efeito pela co-administração de Se. Por fim, na análise da expressão gênica das células NK esplênicas dos camundongos tratados com ptaquilosídeo e/ou selênio pôde-se observar o aumento da expressão dos genes Mt1 e Mt2, possíveis responsáveis pelo mecanismo imunotóxico da planta, sendo posteriormente confirmado pelo aumento de metalotioneína e consequente redução de Zn2+ livre no espaço intracelular das células NK. Os resultados deste estudo claramente mostram que os efeitos imunossupressores da P. aquilinum são induzidos pelo ptaquilosídeo e são decorrentes do aumento da expressão dos genes da Mt1 e Mt2 e que a suplementação com Se pode prevenir e reverter estes efeitos tóxicos. / The results obtained in the master showed that the bracken fern (Pteridium aquilinum) reduces both the cytotoxicity of splenic natural killer cells (NK) and the delayed-type hypersensitivity (DTH) from mice. However, it was not known until that time, which cell affected by the plant that caused a decrease in DTH. Thus, the initial goal of this study was to determine which cell was involved in the reduction of DTH. Moreover, we sought to discover the mechanism of action of the P. aquilinum, the toxic principle involved and whether this effect could be reversed by selenium (Se). For that, C57BL/6 mice were treated with extract of P. aquilinum, by gavage, for 30 days and supplemented with Se for following 30 days. The histological analysis revealed a significant reduction in the splenic white pulp area that was completely reversed by treatment with Se. Still, it was verified that the decrease in DTH was caused by reduced production of IFNγ by NK cells during the induction of cellular immune response. In addition, the mice administered with ptaquiloside, by gavage, for 14 days showed the same reduction in the NK cell activity caused by the extract of P. aquilinum, as well as the prevention of this effect by co-administration of Se. Finally, we could observe an increase in the expression of Mt1 and Mt2 genes in the gene expression analysis of splenic NK cells from mice treated with ptaquiloside and/or selenium. These genes were probably responsible for immunotoxic mechanism of the plant, which was confirmed later by the augment of metallothionein and consequent reduction of free Zn2+ into the intracellular space of NK cells. The results of this study clearly show that the immunosuppressive effects of P. aquilinum are induced by ptaquiloside and they are a consequence of the augment in the gene expression of Mt1 and Mt2 and that the supplementation with Se can prevent and reverse these toxic effects.

A doença articular, especificamente a osteoartrite é uma das enfermidades mais prevalentes e mais debilitantes que acomete os cavalos, tendo um grande impacto econômico na indústria eqüina. Assim sendo, a investigação contínua e avanços na área terapêutica são de fundamental importância. A osteoartrite é uma doença degenerativa que pode ser deflagrada por uma série de fatores e onde, ultimamente, todos os tecidos articulares encontram-se comprometidos. Não obstante, é na degradação da matriz extracelular da cartilagem articular que ocorrem os eventos de maior expressão e repercussão. Na gênese da degradação da matriz extracelular encontra-se um desequilíbrio entre os processos anabólicos e catabólicos responsáveis pela homeostase normal da cartilagem articular e pela adaptação deste tecido às forças que sobre ele incidem. Estes processos são orquestrados por proteínas anabólicas, como, por exemplo o fator de crescimento tipo insulina 1 (IGF-l), e por citocinas inflamatórias que, de forma contrária, são responsáveis pela depleção de colágeno e de proteoglicanas da matriz, representando o grupo de proteínas catabólicas, cujo exemplo clássico é a interleucina-1. A interleucina-1 tem papel central nos processos fisiopatológicos da osteoartrite por desencadear vários eventos catabólicos nos sinoviócitos e condrócitos, incluindo a indução de gens de metaloproteinases e agrecanases e de outros mediadores inflamatórios como a cicloxigenase, a prostaglandina E2 e as espécies reativas do oxigênio. Seus efeitos biológicos se verificam após a ligação com dois tipos de receptores específicos e são modulados pela ocorrência natural de uma proteína antagonista destes receptores. O presente estudo procurou observar os efeitos antiinflamatórios desta proteína antagonista do receptor (IRAP) no líquido sinovial de equino através do emprego da técnica de citometria de fluxo. Nos ensaios observou-se que: 1-a adição de IRAP às células de líquido sinovial estimuladas in vitro por LPS e PMA reduziu a liberação de espécies reativas de oxigênio produzidas por elas; 2 - o plasma, quando utilizado como controle, exibiu efeitos semelhantes aos do IRAP sobre as células de líquido sinovial ativadas in vitro; 3- o efeito antiinflamatório deve-se mais à variação na intensidade de produção de espécies reativas do oxigênio do que à flutuação no percentil de células do líquido sinovial engajadas em sua geração, in vitro. Estes resultados suportam a aplicabilidade terapêutica do IRAP® pelo efeito antiinflamatório verificado sobre as células do liquido sinovial avaliadas por citometria de fluxo. Eles corroboram, ainda, para o uso da citometria de fluxo como instrumento eficaz na avaliação da produção de espécies reativas de oxigênio por células do líquido sinovial ativadas pelos estímulos de LPS e PMA, tanto quantitativamente como qualitativamente. / Joint disease in horses, specifically osteoarthritis, is one of the most prevalent and debilitating illnesses affecting equine industry and for this reason continued research and improvements in therapeutics are needed. Osteoarthritis is a degenerative disease that can be triggered by a number of factors and where ultimately all articular tissues are affected. The hallmark of osteoarthritis is the degeneration of the articular cartilage matrix, where the most relevant and expressive events take place. In the development of osteoarthritis there is disruption in extracellular matrix homeostasis with an overall balance toward cartilage metabolism. Homeostasis of the articular environment relies on balance between anabolic and catabolic events and results in ability of cartilage to respond to molecular or mechanical cues. This apparently antagonic processes are orquestrated by soluble protein mediators, for example the anabolic insulin-like growth factor-I (IGF-I), and, on the other side, by inflammatory cytokines, which in turn, are implicated in degradative processes of articular cartilage, characteristic of osteoarthritis. They deplete cartilage matrix from collagen and proteoglycans and the classical example of such a cytokine is interleukin-1. Interleukin-1 has a central role in the physiopathologic processes of osteoarthritis and has been implicated in the genesis of a number of catabolic events when acting on chondrocytes and synoviocytes. Examples are gene induction for metalloproteinases and agrecanases production, as well as production of other inflammatory mediators like ciclooxygenase, prostaglandin E2 and oxygen-derived reactive species. Its biological effects are observed after interaction with two different but specific types of receptors and are modulated by the occurrence of a natural antagonist, the interleukin-1 receptor antagonist protein (IRAP). In the present study the anti-inflammatory effects of this antagonist protein were evaluated in synovial fluid using cytometric flow techniques. It was observed that: 1- addition of IRAP to synovial fluid cells stimulated in vitro by LPS and PMA reduced the production of oxygen-derived reactive species; 2- plasma, used as a control, exhibited similar effects on activated synovial cells when compared to IRAP in vitro 3- the anti-inflammatory effect is due, in its majority, to the variation in intensity of oxygen-derived reactive species, more than on fluctuations on the percentage of synovial fluid cells actively engaged in its generation in vitro. These results support the therapeutic aplicability of IRAP® for its anti-inflammatory effect observed on synovial fluid cells evaluated with flow cytometric techniques. They also corroborate to the usefulness of cytometric flow techniques in equine synovial fluid cells; they are an invaluable tool to evaluate quantitative and qualitatively the production of oxygen-derived reactive species mediated by their activation with PMA and LPS.

Benzodiazepínicos (BDZ) são fármacos ansiolíticos que se caracterizam por atuar em receptores GABAa presentes no sistema nervoso central. Além dos receptores centrais os BDZ também possuem afinidade por sítios ligantes periféricos presentes em vários tecidos, dentre eles nas glândulas adrenais e em células polimorfonucleares. O presente experimento analisou os efeitos de BDZ sobre a atividade de neutrófilos e sobre os níveis séricos de corticosterona de ratos. Especificamente, o burst e a fagocitose de neutrófilos foram estudados após o tratamento ex vivo e in vitro com diazepam, RO 5-4864, clonazepam e/ou PK 11195. Os efeitos do diazepam sobre a atividade de neutrófilos também foram avaliados após o uso prolongado deste fármaco. Finalmente, os efeitos in vitro dos BDZ foram estudados após a incubação com um bloqueador do canal de cálcio (Ca2+) o L-verapamil. Os resultados mostraram que (1) o tratamento agudo ex vivo com diazepam (10 mg/kg) produziu um aumento do burst oxidativo e da fagocitose induzida por PMA, LPS e Staphylococcus aureus; (2) o tratamento prolongado (21 dias) com diazepam (10 mg/kg) produziu um aumento do burst oxidativo induzido pelos mesmos estímulos e reduziu a fagocitose dos neutrófilos (porcentagem e intensidade); (3) o tratamento agudo ex vivo com diazepam, mas não o prolongado, aumentou os níveis séricos de corticosterona; (4) os efeitos da adição in vitro de diazepam (100 nM) foram na mesma direção daqueles observados após o tratamento agudo; (5) o RO 5-4864 (100 nM) induziu in vitro efeitos similares aos obtidos ex vivo (10 mg/kg) e in vitro (100 nM) com diazepam; (6) o tratamento ex vivo com clonazepam (10 mg/kg) diminuiu o burst oxidativo de neutrófilos induzido por PMA, LPS e Staphylococcus aureus enquanto que o tratamento com este fármaco na dose de 1 mg/kg aumentou o burst oxidativo destas células frente a todos os estímulos; (7) o tratamento ex vivo (1 e 10 mg/kg) e in vitro (100 nM) com clonazepam não alterou a fagocitose de neutrófilos; (8) os efeitos da adição in vitro de clonazepam sobre a atividade de neutrófilos vão na mesma direção daqueles observados após o tratamento ex vivo na dose de 1 mg/kg; (9) o clonazepam (1 e 10 mg/kg) aumentou os níveis séricos de corticosterona; (10) a adição in vitro do PK 11195 (100 nM) per se ou associado com diazepam (100 nM) ou RO 5-4864 (100 nM) aumentou o burst oxidativo e diminuiu a fagocitose realizada pelos neutrófilos; (11) a adição in vitro do PK 11195 (100 nM) associado com o clonazepam (100 nM) diminuiu o burst oxidativo induzido por PMA e diminuiu a fagocitose realizada por estas células; finalmente, (12) a pré incubação por 2 minutos com L-verapamil (100 nM) bloqueou todos os efeitos do diazepam sobre a atividade de neutrófilos estimulada por PMA, LPS e Staphylococcus aureus e reverteu os efeitos do RO 5-4864 no burst oxidativo induzido por PMA. Esses resultados sugeriram que os efeitos dos BDZ não estão relacionados com a ativação de PBR nas células da glândula adrenal e também que eles não estão relacionados a um aumento dos níveis séricos de corticosterona. Indicaram que os BDZ tenham produzido mudanças na concentração do Ca2+ intracelular dos neutrófilos através da ativação de PBR seguida de um aumento da permeabilidade da membrana plasmática ao Ca2+ através da abertura de canais sensíveis ao L-verapamil, permitindo a entrada do Ca2+. Os diferentes efeitos dos BDZ sobre o burst oxidativo e a fagocitose de neutrófilos foram atribuídos a ações específicas deste fármaco em subtipos de PBR presentes nos neutrófilos e nas membranas mitocondriais. Finalmente, os resultados sugeriram o desenvolvimento de tolerância aos efeitos do diazepam sobre os níveis séricos de corticosterona mas não sobre a atividade de neutrófilos. / Benzodiazepines (BDZ) exert their anxiolytic effects via specific binding sites coupled to neuronal GABAa receptors. They also affect a second, pharmacologically different type of receptor, which has been found in many sites such as blood polimorphonuclear cells and adrenals. The present experiment was designed to analyze the effects of BDZ on neutrophil activity and corticosterone serum levels in rats. Specifically, neutrophil oxidative burst and phagocytosis were studied after ex vivo and in vitro treatments with diazepam, Ro 5-4864, clonazepam and/or PK 11195. Diazepam effects on neutrophil activity were also taken after long-term treatment. Finally, in vitro effects of BDZ were studied after incubation with L-verapamil, a Ca2+ channel blocking agent. Results showed that (1) acute and ex vivo diazepam (10.0 mg/kg) treatment induced an increment on PMA, LPS and Staphylococcus aureus induced oxidative burst and phagocytosis (2) long-term (21 days, 10 mg/kg/day) diazepam treatment increased the oxidative burst induced by the same stimuli and reduced both intensity of phagocytosis and the percentage of neutrophil performing phagocytosis; (3) acute and ex vivo diazepam treatment, but not long-term diazepam treatment increased corticosterone serum levels; (4) the effects induced by in vitro addition of diazepam (100 nM) were in the same direction of those observed after acute treatment; (5) Ro 5-4864 (100 nM) induced similar effects to those of diazepam after ex vivo (10.0 mg/kg) and in vitro (100 nM) treatments; (6) ex vivo (10.0 mg/kg) clonazepam treatment decreased the neutrophil oxidative burst induced by PMA and S. aureus after a 1.0 mg/kg dose and decreased these parameters after a higher (10 mg/kg) dose; (7) ex vivo (1.0 and 10.0 mg/kg) and in vitro (100 nM) clonazepam treatments did not change neutrophil phagocytosis; (8) in vitro clonazepam (100 nM) induced effects on neutrophil activity that were in the same direction of those observed after the 1.0 mg/kg dose (9) clonazepam (1.0 and 10.0 mg/kg) increased corticosterone serum levels; (10) in vitro PK 11195 (100 nM) per se or associated with diazepam (100 nM) or Ro 5-4864 (100 nM) increased PMA, LPS and S. aureus induced neutrophil oxidative burst and decreased cell phagocytosis; (11) in vitro PK 11195 (100 nM) together with clonazepam (100 nM) decreased PMA-induced oxidative burst and decreased S. aureus phagocytosis; finally, (12) in vitro L-verapamil (100 nM) incubation for 2 minutes prevented all effects induced by diazepam on PMA, LPS and S. aureus -induced neutrophil activity and reverted the effects induced by Ro 5-4864 (100 nM) on PMA-induced oxidative burst. These results suggest that BDZ effects on neutrophil activity were not related to PBR activation within the adrenal gland cells, leading to increments on corticosterone serum levels. They suggest instead that BDZ induced [Ca2+]i changes in neutrophils through PBR activation followed by an increase in plasma membrane permeability due to L-verapamil sensitive Ca2+ channels and subsequent extracelular Ca2+ entry. The differences of BDZ effects on neutrophil oxidative burst and phagocytosis were attributed to specific actions on different PBR subtypes present on neutrophil and mitochondrial membranes. Finally, results suggest the development of tolerance to diazepam effects on corticosterone serum levels but not on neutrophil activity.

A produção in vitro de embriões (PIVE) bovinos é uma ferramenta importante na reprodução animal, com aplicações acadêmicas e comerciais, e com grande relevância econômica. Apesar da sua aplicabilidade, a eficiência da PIVE ainda pode ser aumentada. Efeitos espermáticos podem ser evidenciados no desenvolvimento embrionário durante a PIVE apresentando grandes variações nas taxas de produção. Devido ao aspecto multifatorial da fertilidade, as avaliações espermáticas apresentam resultados inconstantes, mesmo com o uso de métodos mais precisos de análise como a citometria de fluxo, combinada às sondas fluorescentes, que permitem avaliar maior número de espermatozoides e de atributos simultaneamente. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito de atributos espermáticos (motilidade antes e após gradiente de Percoll®, integridade de membranas plasmática e acrossomal, alto potencial de membrana mitocondrial e resistência da cromatina) de maneira individual, (diferença para apenas para um atributo espermático) e de maneira combinada em perfis espermáticos (diferença para todos os atributos espermáticos simultaneamente). O efeito foi avaliado por meio das taxas de clivagem, blastocisto e eficiência de desenvolvimento embrionário (taxa de blastocisto/taxa de clivagem). Os resultados demonstraram que os atributos motilidade prévia ao Percoll®, a integridade da membrana acrossomal e o potencial de membrana mitocondrial, individuais, apresentam efeito negativo sobre as taxas de desenvolvimento embrionário e de blastocisto. A motilidade após o gradiente de Percoll®, a integridade da membrana plasmática e a resistência da cromatina, bem como a combinação de todos os atributos espermáticos analisados, sob mesmas condições, não apresentaram efeito sobre a PIVE. Deste modo, conclui-se que controversamente alguns atributos espermáticos podem apresentar efeitos negativos sobre as taxas da PIVE e que a função e interação de atributos espermáticos com o processo in vitro devem ser mais bem compreendidas, a fim de permitir o aprimoramento deste processo podendo aumentar as taxas de produção, maximizando a eficiência da PIVE. / In vitro production (IVP) of bovine embryos is an important technology of animal reproduction. This technology is applied on research and livestock, with economic highlights, however IVP efficiency could be higher, and can be influenced by male effects. Until now, sperm evaluations had failed to determine these male effects, even using advanced technologies such as large mix of fluorescent probes by flow cytometry analysis, which evaluates a large number of sperm cells and traits simultaneously. Then, the aim of this study was to determine the effect of sperm traits (motility before and after Percoll® selection, plasma membrane and acrosome integrity, high mitochondrial membrane potential, and chromatin structure) on IVP rates. Effect of each trait was enriched to evaluate the individual trait effect (differences between groups of bulls exclusively for the enriched trait, while others traits was homogenous). Combined effect of traits was also evaluated (differences between groups of bulls, and groups of batches from same bulls, for all traits simultaneously, generating a sperm profile). Enriched and combined effects were evaluated on cleavage, blastocyst and embryo development (blastocyst/cleavage) rates. Results showed that motility before Percoll® selection, acrosome integrity, and high mitochondrial membrane enriched effects had negative impact on blastocyst and embryo development rates. Motility after Percoll® selection, plasma membrane integrity, chromatin structure, and combined effects were not significant on IVP rates. We can conclude that controversially, some sperm traits could have a negative effect on IVP outcomes, thereafter sperm traits physiology and interactions with in vitro systems must be better understood to enhance in vitro fertilization conditions, increasing IVP yields.

O objetivo do presente estudo foi avaliar a atividade funcional dos polimorfonucleares (PMNs) do sangue de cabritos neonatos "in vitro" - metabolismo oxidativo e a fagocitose induzidos por S.aureus e E.coli, por meio da citometria de fluxo. Foram utilizados 32 cabritos da raça Saanen, acompanhados quanto ao estado de saúde do nascimento até os 15 dias de idade, distribuídos em quatro grupos: G1- colostro de cabra "in natura"; G2- colostro de cabra aquecido a 56ºC por 60 minutos; G3- colostro de vaca "in natura" e G4 - leite de cabra; sendo avaliados nos seguintes tempos: t0 (antes da ingestão do colostro); t1 (24-48h p.n.); t2 (72-96h p.n); t3 (168-192h p.n) e t4 (336-360h p.n). A avaliação estatística foi realizada pela análise de variância (ANOVA) para a comparação entre os grupos e intragrupos para amostras de pequeno tamanho, de acordo com as variáveis do estudo, com nível de significância de 5%. O metabolismo oxidativo basal não diferiu nos grupos e com a idade. O metabolismo oxidativo aumentou com o estímulo por S. aureus após a ingestão de colostro tratado pelo calor (G2), não apresentando diferenças nos demais grupos. O estímulo com E. coli o aumentou após a ingestão de colostro tratado (G2) e após a ingestão de leite de cabra (G4) a partir de t3, não diferindo nos grupos que receberam colostro de cabra e vaca "in natura" (G1 e G3 respectivamente). A comparação entre metabolismo oxidativo basal e induzido para o S. aureus foi maior antes e após a mamada do colostro nos grupos colostro de cabra "in natura" e sem colostro (G1 e G4); e, após a ingestão do colostro nos grupos que o receberam tratado pelo calor e de vaca respectivamente (G2 e G3). Para a E. coli a resposta foi maior após a ingestão de colostro tratado pelo calor (G2); antes e após a mamada de colostro de vaca (G3) ou leite (G4); não houve diferença entre o metabolismo basal e induzido para a E. coli no grupo que recebeu colostro de cabra "in natura" (G1). A fagocitose induzida pelo S.aureus não diferiu em nenhum dos grupos; o percentual de fagocitose aumentou após a ingestão de colostro de cabra "in natura" (G1) no momento t1. A fagocitose induzida pela E.coli foi maior após a ingestão de colostro de cabra nos dois grupos. O percentual de fagocitose foi maior após a ingestão do colostro tratado pelo calor e não diferiu nos demais grupos. Os resultados permitiram concluir que a ingestão do colostro não interferiu no metabolismo oxidativo basal; o desencadeamento da explosão respiratória de PMNs induzido pelas bactérias foi maior após a ingestão de colostro de cabra aquecido a 56ºC por 60 minutos; houve indícios de aumento da fagocitose para S. aureus e um aumento da intensidade de fluorescência e do percentual de fagocitose para E.coli nos grupos que receberam colostro de cabra (G1 e G2); não ficou esclarecida a influência da idade na atividade funcional de PMNs do sangue de cabritos neonatos "in vitro"; os resultados do presente estudo subsidiam propostas de melhoria do manejo da produção caprina baseada na utilização de colostro de cabra tratado pelo calor. / The aim of this study was to evaluate "in vitro" functional activities of neonates goats blood polymorphonuclear leukocytes (PMNs) respiratory burst and phagocytosis induced by S. aureus and E. coli, by flow cytometry. We used 32 Saanen goats, accompanied on the health status from birth to 15 days of age divided into four groups: G1-goat colostrum \"in nature\"; G2- goat colostrum heated to 56 ° C for 60 minutes; G3-cow colostrum \"in nature\" and G4 - goat milk, being evaluated at the following times: t0 (before intake of colostrum), t1 (24-48h after birth), t2 (72-96h a.b), t3 (168-192h a.b), t4 (336-360h a.b). Statistical analysis was performed by analysis of variance (ANOVA) for comparison between groups and within groups for samples of small size, according to the study variables, with 5% of significance. The respiratory burst did not differ in basal and age groups. The stimulation of respiratory burst in S. aureus increased significantly after ingestion of colostrum treated by heat (G2) and it was not different in the other groups. Stimulation with E. coli increased after colostrum treated by heat intake (G2) and after ingestion of goat\'s milk (G4) from t3; no difference in the groups that received colostrum from goats and cows \"in nature\" (G1 and G3 respectively). The comparison of basal and induced respiratory burst for S. aureus was higher before and after the intake of colostrum or goat milk in the groups colostrum \"in nature\" and without colostrum (G1 and G4) and, after ingestion of colostrum in the groups treated with heat and bovine colostrum, respectively (G2 and G3). For E. coli, response was higher after ingestion of colostrum treated by heat (G2), before and after feeding cow colostrum (G3) or goat milk (G4), there was no difference between basal metabolism and induced to E. coli in the group that received goat colostrum \"in nature\" (G1). Phagocytosis induced by S. aureus did not differ in any group, the percentage of phagocytosis increased after ingestion of goat colostrum \"in nature\" (G1) at time t1. Phagocytosis induced by E. coli was increased after colostrum intake in both groups that received goat colostrum. The percentage of phagocytosis was increased after ingestion of colostrum but it did not differ in treated and other groups. The results showed that ingestion of colostrum did not affect the basal respiratory burst; triggering the respiratory burst of PMNs induced by bacteria was greater after eating goat colostrum heated to 56 ° C for 60 minutes, there was evidence of increased phagocytosis of S. aureus and there was an increase in fluorescence intensity and percentage of phagocytosis of E.coli in the groups receiving goat colostrum (G1 and G2); it was not clarified the influence of age on functional activity of PMNs from the blood of goats neonates "in vitro"; and the results of this study subsidize proposals for improving the management of goat production based on the use of goats colostrum treated by heat.

A Artrite Encefalite Caprina (AEC) é uma lentivirose multisistêmica que tem a glândula mamária caprina como um dos alvos lesionais da doença. Pode causar uma manifestação mamária específica, chamada de mastite endurativa, além da mama representar uma importante via de eliminação do vírus, mesmo em animais que não apresentam a forma clínica. Considerando-se a possibilidade desta virose, cuja célula alvo predominante é o monócito, levar a alterações imunológicas que influenciem a susceptibilidade do animal a outras doenças, objetivou-se avaliar essa interação do vírus e da imunidade do hospedeiro por meio de fenotipagem, fagocitose e produção de Espécies reativas de oxigênio (ERO) e dos mecanismos de morte das células sanguíneas e lácteas de cabras naturalmente infectadas. Para isso 200 cabras foram triadas e, destas selecionadas oito fêmeas não sororreagentes e dez sororreagentes na pesquisa de anticorpos séricos para AEC, dentro dos padrões hematológicos da espécie e com dois exames bacteriológicos do leite negativos. O leite e o sangue colhido destes animais foram submetidos às seguintes provas: fenotipagem dos leucócitos CD4+, CD8+, CD14+, PG68A+ e CD45+, fagocitose de Staphylococcus aureus e de Escherichia coli por células CD14+ e PG68A+, produção de ERO e marcação com Anexina-V e Iodeto de Propídeo (PI) por granulócitos e células mononucleares. A infecção pelo VAEC pode ser associada a um aumento de células CD14+ no leite, mas não no sangue. Os outros perfis celulares não sofreram alterações. Quanto a função fagocítica, o vírus reduziu a porcentagem de fagocitose de Staphylococcus aureus por granulócitos PG68A+ do leite. Esta alteração não ocorreu na fagocitose de Escherichia coli e na produção de ERO dessas células, nem na fagocitose e produção de ERO pelas células CD14+ ressaltando que nesses processos a espécie bacteriana pode sofrer interações com o vírus ou mesmo com a resposta imune do organismo infectado. O VAEC não influenciou significativamente os mecanismos de morte ora investigados, mas a tendência dos resultados sugere que possa haver indução de morte por apoptose e/ou por necrose nos granulócitos do sangue e influenciar no processo de necrose destas células no leite, sem alterar esses processos nas células mononucleares. Ressalta-se a importância da interação monócito-neutrófilo na glândula mamária, principalmente nos animais sororreagentes para AEC, mesmo na ausência de mastite bacteriana. / The caprine arthritis encephalitis (CAE) is a multisystem lentivirose that have the goat mammary gland as one target of the lesional disease. May cause a mammary specific expression, called indurative mastitis, beyond these organ represent a major route of virus elimination, even in animals that do not exhibit this clinical manifestation. Considering the possibility of this virus, whose target cell are predominantly monocyte, lead to immunological changes that influence the animal\'s susceptibility to other diseases, this study aimed to evaluate the interaction of virus and host immunity by phenotyping, phagocytosis and production of reactive oxygen species (ROS) and the mechanisms of cell death, in blood and milk of goats naturally infected. For that, 200 goats were screened and was selected eight females non sero-reagents and ten seroreagents for serum antibodies against CAE, with the haematological analises within the species standards and two negative bacteriological tests of milk. Milk and blood from these animals underwent the following tests: phenotyping of leukocytes CD4+, CD8+, CD14+, PG68A+ and CD45+, phagocytosis of Staphylococcus aureus and Escherichia coli ROS production by CD14+ and PG68A+ cells, and labeling with Annexin-V and propidium iodide (PI) for granulocytes and mononuclear cells. CAEV infection may be associated with an increase in CD14+ cells in milk, but not in blood. The other cellular profile did not change. In the phagocytic function, the virus reduced the percentage of phagocytosis of Staphylococcus aureus by granulocytes PG68A+ milk. This change did not occur in the phagocytosis of Escherichia coli and production of ROS in these cells, nor in phagocytosis and ROS production by CD14+ cells, noting that in those cases the bacterial species may undergo interactions with the virus or even with the immune response of the infected organism. The VAEC not significantly affect the mechanism of death now investigated, but the tendency of the results suggests that can induce apoptosis and/or necrosis in the blood granulocytes and influence the process of necrosis of these cells in milk, without changing these processes mononuclear cells. We emphasize the importance of monocyte-neutrophil interaction in the mammary gland, especially in animals seropositive for CAE, even in the absence of bacterial mastitis.

Apesar dos esforços mundiais a malária ainda é uma doença com altas taxas de morbidade e mortalidade. Investigamos o efeito de moléculas sintéticas relacionadas a melatonina e a triptamina no ciclo celular de P. falciparum, bem como mostramos que essa classe de compostos apresenta ação antimalárica significativa. Avaliamos também 5 novas hidroxinaftoquinonas sintéticas em cultura in vitro de P. falciparum, todas apresentaram atividade antimalárica, tendo N3 destacado-se por apresentar um IC50 na faixa nanomolar. Mostramos que o possível mecanismo de ação de N3 é inibindo o potencial de membrana mitocondrial. Em células de mamíferos HEK293, N3 não mostrou toxicidade significativa. No modelo de infecção utilizando P. berghei (ANKA GFP) o composto N3 não foi capaz de curar os animais infectados, apesar da redução significativa da parasitemia no quarto dia após a infecção. Nessa tese mostramos o uso da citometria de fluxo como uma ferramenta prática possibilitando a avaliação do ciclo do parasita. / Despite the worldwide effort the malaria is still a devastating disease. We have tested melatonin and synthetic related indoles molecules on P. falciparum cell cycle and showed the potential antimalarial activity. We have tested 5 new synthetic hydroxynaphthoquinones on in vivo culture of P. falciparum 3D7, all of them showed antimalarial activity, but only N3 showed an IC50 in the nanomolar range. We demonstrate that the probable mechanism of action of N3 is inhibiting the mitochondrial membrane potential. In mammalian cells, N3 did not show cytotoxicity. Subsequently, we tested the compound N3 in murine infection model of P. berghei. After 4 days the parasitemia was assessed and the survival monitored for 30 days. N3 was not able to cure the infected animals, despite the initial reduction of parasitemia on 4th day post-infection. In this thesis we have demonstrated the use of flow cytometry as a useful and powerful tool in malaria research.

Um importante fator na virulência do P. falciparum é sua capacidade de aderência a receptores endoteliais, mediada por proteínas PfEMP1. No Brasil, o número de variantes PfEMP1 é limitado, com raras evoluções graves da doença, e presença de indivíduos portadores do parasita e sem sintomas. Localizamos anticorpos contra a membrana do eritrócito infectado em plasmas de indivíduos de Rondônia; sem diferenças na resposta imune nos dois grupos (selecionados tanto para ICAM1 quanto CD36), tanto em frequência quanto em; encontramos diferenças significativas em capacidade de inibição de citoadência apenas em casos pontuais, sem correlação com índice de reatividade ou fenótipo; observamos presença de anticorpos pan-reativos, capazes de aglutinar diferentes isolados, porém sem diferenças entre os isolados selecionados para ICAM1 e CD36. Os dados indicam que a resposta contra a superfície da hemácia infectada - ao menos dos isolados e fenótipos testados neste trabalho - não parece ser um critério decisivo para o tipo de evolução de malaria sofrida pelo paciente. / An important factor in P. falciparum\'s virulence is its ability to adhere to endothelial receptors, mediated by PfEMP1 proteins. In Brazil the number of PfEMP1 variants is limited, severe disease is rare, and there are many individuals carrying the parasite without symptoms. We detected antibodies against the membrane of erythrocytes using plasma of infected individuals from Rondônia, finding only in some cases differences in the immune response, both in frequency and degree; we also could not find differences between the ability to inhibit cytoadherence in static condition. There was no correlation between this capacity and the reactivity index or phenotype; we observed the presence of pan-reactive antibodies that were capable of agglutinating different isolates, but without any difference between ICAM1 and CD36 selected isolates. Taken together, our data indicate the immune response against the infected red blood cell is not decisive for the outcome of malaria suffered by the patients.

Ecstasy é o nome popular do 3,4-metilenodioximetanfetamina (MDMA), uma droga de abuso muito utilizada por adultos jovens. Diferentes relatos de caso têm mostrado correlações positivas entre o abuso do Ecstasy e doenças infecciosas. Muitos estudos em modelos animais mostraram que o MDMA induz alterações de imunidade inata e adquirida; entretanto pouco se sabe sobre os mecanismos pelos quais estes efeitos ocorrem. Buscamos neste trabalho por efeitos da administração i.p. de MDMA sobre parâmetros comportamentais, neuroendócrinos e de atividade de neutrófilos e o fizemos à luz de mecanismos neuroimunomodulatórios. Nossos resultados mostraram que o MDMA (5,0; 8,0; 10,0 e 20,0 mg/kg) produz, 30 minutos após a administração (1) aumento da atividade locomotora avaliada no campo aberto e no LCE e (2) diminuição do burst oxidativo de neutrófilos após indução por Staphylococcus aureus nas doses de 8,0; 10,0 e 20,0 mg/kg. Adicionalmente, 60 minutos após a administração de 10,0 mg/kg observou-se (3) um aumento de atividade locomotora avaliada no campo aberto e no LCE, (4) aumento do turnover de noradrenalina e de dopamina no hipotálamo; (5) aumento do turnover de dopamina no estriato; (6) aumento dos níveis séricos de corticosterona; (7) diminuição do burst oxidativo após indução por SAPI e PMA e, também, da porcentagem e da intensidade de fagocitose por neutrófilos sanguíneos; (8) aumento do número de eritrócitos, da quantidade de hemoglobina e da porcentagem do hematócrito e diminuição do número de linfócitos sanguíneos; (9) diminuição do número total de células na medula óssea; (10) aumento do número de leucócitos e (11) diminuição do peso relativo do baço. A exposição in vitro ao MDMA (12) não alterou o burst oxidativo e a fagocitose por neutrófilos. Esses resultados sugerem que o MDMA produz ao mesmo tempo alterações comportamentais, neuroquímicas, endócrinas e imunológicas em camundongos. A estimulação motora dos animais parece relacionada a um aumento da atividade catecolaminérgica central e, muito especialmente, do sistema dopaminérgico estriatal. É possível sugerir que a alteração na imunidade inata após MDMA esteja relacionada ao aumento de atividade do eixo HHA e, conseqüentemente, dos níveis séricos de corticosterona. Não se descarta, porém, uma possível ativação do SNAS induzida pelo MDMA. Finalmente, observamos que o MDMA não tem efeito direto sobre neutrófilos. / Ecstasy is the popular name of N-metil-3,4 methylenedioxymethamphetamine (MDMA), a drug of abuse widely used by young adults. Different case reports have been demonstrating the existence of a positive correlation between Ecstasy abuse and the presence of infectious disease. Many studies conducted in animal models showed that MDMA reduces innate and adaptative immunity. However, little is known about the mechanisms behind these reported effects. In this work we searched for effects of i.p. MDMA administration on behavioral, neuroendocrines, and neutrophil activity in mice, especially parameters looking for neuroimmune relationships. We showed that MDMA treatment (5,0; 8,0; 10,0; and 20,0 mg/kg) produces after 30 minutes (1) increased locomotor activity in the open field and plus maze apparatuses, (2) decreased neutrophil oxidative burst after Staphylococcus aureus (SAPI) after in vitro induction 8,0, 10,0, and 20,0 mg/kg doses. Additionally, 60 minutes after MDMA (10,0 mg/kg) we observed (3) increased locomotor activity in the open field and plus maze apparatuses, (4) increased noradrenaline and dopamine turnover in the hypothalamus, (5) increased dopamine turnover in the striatum, (6) increased level of serum corticosterone, (7) decreased neutrophil oxidative burst after SAPI and PMA inductions, and also decreased percentage and intensity of neutrophil phagocitosis, (8) increased erythrocyte number, hemoglobin level, and hematocrit, and decreased peripheral blood Iymphocyte number, (9) decreased bane marrow total cell number, (10) increased leucocyte number on spleen and (11) splenic weight reduction. It was also observed that (12) in vitro exposure to MDMA induced no effects on both neutrophil oxidative burst and phagocytosis. These results suggest that MDMA produces at the same time behavioral, neurochemical, endocrine, and immunological alterations in mice. The increased locomotor activity observed seems to be related to an action on central catecholaminergic activity, mainly, at the level of the dopaminergic striatal system. It is also possible to suggest that the observed innate immunity alterations are related to an increased HPA axis activity induced by MDMA, via corticosterone. However, we cannot discharge a possible SNS activation induced by MDMA, a fact that could have contributed to the present reported effects. Finally, and importantly we observed that in vitro MDMA has no effects on neutrophil activity.

Inflammatory processes are known to protect vertebrates from injuries and infections. However, from an immunological perspective the role of leukocytes in snakes inflammatory process is poorly understood. Within this context, leukocyte classification in these animals is not clearly defined, with authors disagreeing on existent cell types and their classification. Due to the great variation of snakes leukocytes on cytochemistry, an analysis focused exclusively on optical morphology is insufficient to determine different cell types. Thus, additional methods, as flow cytometry, are important to better understand the function and origin of each cell type. In particular, studies of chronic stress induced by captivity in reptiles demonstrate that serum corticosterone levels rise during the adaptation period and are associated with immune suppression. However, it is not known how the leukocyte functions of reptiles are altered under these conditions. The objective of this research was to adapt leukocyte density gradients (ficoll and percoll) for snake blood samples, and characterize recovered cells based on size, presence of granules and internal complexity (organelle), and on their cellular innate functions (oxidative burst and phagocytosis), in front of bacterial, fungal and chemical challenges, by flow cytometry; enabling the qualitative and quantitative assessment of innate activities presented by cells constituting the immune system of Boa constrictor, Bothrops jararaca and Crotalus durissus. Additionally, the study proposes to correlate innate leukocyte functions performances with serum corticosterone concentrations, in recent wild-caught viperids (B. jararaca and C. durissus), at two moments of adaptation to captivity (5 and 60 days of captivity). Comparison between gradient methods for leukocyte isolation did not show any statistical difference in types and proportion of leukocytes populations between snakes of the same species. When verified by means of flow cytometric cell sorting and confirmed by optical microscopy, populations were mainly composed of azurophils, heterophils, large lymphocytes and small lymphocytes. Concerning innate leukocyte functions, heterophils, lymphocytes and azurophils were involved in the phagocytosis response. Regarding oxidative burst activity, only azurophils presented a significative and strong oxidative burst when compared to their respective baseline. During adaptation to captivity process, B. jararaca heterophils phagocytic activity showed a positive correlation with serum corticosterone levels. However, the percentage of phagocytosis presented by azurophils and the quantity of particles ingested by lymphocytes, presented a negative correlation with serum corticosterone concentrations. For C. durissus, phagocytosis displayed by lymphocytes also presented a negative correlation with serum corticosterone levels. In both vipers species, oxidative burst activity showed no correlation with serum corticosterone concentrations. We believe that the data generated in this research will contribute to the development of new diagnostic tests, phylogenetic analyzes, ecotoxicological and ecoimmunological studies, as well as assisting in the clinic-sanitary management of snakes in captivity. / O processo inflamatório é conhecido por proteger os vertebrados de lesões e infecções. No entanto, sob uma perspectiva imunológica, as funções dos leucócitos no processo inflamatório das serpentes são pouco compreendidas. Neste contexto, a caracterização leucocitária nestes animais ainda não está definida, havendo discordância na literatura sobre os tipos celulares existentes e suas classificações. Devido à grande variação citoquímica apresentada por estas células, uma análise focada apenas na morfologia óptica é insuficiente para determinar os diferentes tipos celulares. Assim, o empego de métodos mais avançados, como a citometria de fluxo, são importantes para o melhor entendimento da função e da origem de cada tipo celular. Em particular, estudos sobre o estresse crônico induzido pelo cativeiro em répteis demonstram que níveis séricos de corticosterona aumentam durante o período de adaptação, e estão associados à imunossupressão; no entanto, ainda não está claro como as funções leucocitárias são alteradas nestas condições. Neste cenário, o objetivo do presente estudo foi pesquisar gradientes de densidade (ficoll e percoll) para a recuperação de leucócitos provenientes do sangue periférico de serpentes, e caracterizar, por meio da citometria de fluxo, as células recuperadas com base no tamanho, presença de grânulos e complexidade interna (organelas), e em suas funções celulares inatas (burst( oxidativo e fagocitose) frente a desafios bacterianos, fúngicos e químicos, possibilitando, desta forma, a avaliação qualitativa e quantitativa das funções apresentadas pelos leucócitos constituintes do sistema imunológico de três serpentes neotropicais, Boa constrictor, Bothrops jararaca e Crotalus durissus. Ainda, o estudo propôs correlacionar o desempenho destas funções com as concentrações séricas de corticosterona em viperídeos (B. jararaca e C. durissus) recém capturados da natureza, em dois momentos de adaptação ao cativeiro (após cinco e 60 dias de cativeiro). A comparação entre os dois métodos de recuperação leucocitária (ficoll e percoll) não apresentou diferença estatística em relação aos tipos e proporção dos leucócitos recuperados do sangue periférico de serpentes de mesma espécie. Nas três espécies, após análise por citometria de fluxo, as populações leucocitárias obtidas nos citogramas foram identificadas mediante procedimento de sorting celular, com posterior análise por microscopia óptica, sendo compostas por azurófilos, heterófilos, linfócitos grandes e linfócitos pequenos. Em relação às funções leucocitárias, heterófilos, linfócitos e azurófilos apresentaram capacidade de fagocitose nas três espécies. Com relação ao burst oxidativo, apenas os azurófilos apresentaram uma atividade significativa em relação aos respectivos valores basais para as espécies investigadas. Na fase de adaptação ao cativeiro, a atividade fagocítica dos heterófilos de B. jararaca mostrou correlação positiva com os níveis séricos de corticosterona. Entretanto, a porcentagem de fagocitose apresentada pelos azurófilos e a quantidade de partículas ingeridas pelos linfócitos apresentaram correlações negativas. Para C. durissus, a porcentagem de fagocitose dos linfócitos também apresentou correlação negativa com os níveis de corticosterona. Em ambas as espécies, não houve correlação entre a atividade de burst oxidativo e as concentrações séricas de corticosterona. Acreditamos que os dados gerados nesta pesquisa contribuirão para o desenvolvimento de novos testes diagnósticos, análises filogenéticas, estudos ecotoxicológicos e ecoimunológicos, além de auxiliar no manejo clínico-sanitário de serpentes em cativeiro.