La cellulose et ses dérivés sont utilisés dans un vaste nombre d’applications incluant le domaine pharmaceutique pour la fabrication de médicaments en tant qu’excipient. Différents dérivés cellulosiques tels que le carboxyméthylcellulose (CMC) et l’hydroxyéthylcellulose (HEC) sont disponibles sur le commerce. Le degré de polymérisation et de modification diffèrent énormément d’un fournisseur à l’autre tout dépendamment de l’origine de la cellulose et de leur procédé de dérivation, leur conférant ainsi différentes propriétés physico-chimiques qui leurs sont propres, telles que la viscosité et la solubilité. Notre intérêt est de développer une méthode analytique permettant de distinguer la différence entre deux sources d’un produit CMC ou HEC. L’objectif spécifique de cette étude de maitrise était l’obtention d’un profil cartographique de ces biopolymères complexes et ce, par le développement d’une méthode de digestion enzymatique donnant les oligosaccharides de plus petites tailles et par la séparation de ces oligosaccharides par les méthodes chromatographiques simples. La digestion fut étudiée avec différents paramètres, tel que le milieu de l’hydrolyse, le pH, la température, le temps de digestion et le ratio substrat/enzyme. Une cellulase de Trichoderma reesei ATCC 26921 fut utilisée pour la digestion partielle de nos échantillons de cellulose. Les oligosaccharides ne possédant pas de groupements chromophores ou fluorophores, ils ne peuvent donc être détectés ni par absorbance UV-Vis, ni par fluorescence. Il a donc été question d’élaborer une méthode de marquage des oligosaccharides avec différents agents, tels que l’acide 8-aminopyrène-1,3,6-trisulfonique (APTS), le 3-acétylamino-6-aminoacridine (AA-Ac) et la phénylhydrazine (PHN). Enfin, l’utilisation de l’électrophorèse capillaire et la chromatographie liquide à haute performance a permis la séparation des produits de digestion enzymatique des dérivés de cellulose. Pour chacune de ces méthodes analytiques, plusieurs paramètres de séparation ont été étudiés. / Cellulose and its derivatives are used in a wide range of applications, including the pharmaceutical industry for the manufacturing of medicines as inactive additives. Various cellulosic derivatives such as carboxymethylcellulose (CMC) and hydroxyethylcellulose (HEC) are readily available for such use. The degree of polymerization and modification differs from one supplier to the other, according to the origin of the cellulose and its process of chemical modification, conferring on them different physico-chemical properties, such as viscosity and solubility. Our interest is to develop an analytical method that can distinguish between different sources of a given CMC or HEC product. The specific objective of this master’s study was to obtain a fingerprint of these complex biopolymers by developing an enzymatic digestion method to produce smaller oligosaccharides that could be separated by simple chromatographic methods. The digestion was studied as a function of various parameters, such as the composition of the hydrolysis solution, the pH, the temperature, the duration of digestion and the substrate/enzyme ratio. A cellulase enzyme from Trichoderma reesei ATCC 26921 was used for the partial digestion of our samples of cellulose. Since these oligosaccharides do not possess a chromophore or fluorophore, they can’t be detected either by absorbance or fluorescence. It was thus necessary to work out the labeling method for oligosaccharides using various agents, such as 8-aminopyrene-1,3,6-trisulfonic acid (APTS), 3-acetylamino-6-aminoacridine (AA-Ac) and phenylhydrazine (PHN). Finally, the use of capillary electrophoresis and high performance liquid chromatography allowed the separation of the enzymatic digestion products of the cellulose derivatives (CMC and HEC). For each of these analytical separation techniques, several parameters of the separation were studied.

L'objectif de cette thèse est l'étude de la formation de nanoparticules carbonées dans un plasma basse pression. Les poussières sont créées par pulvérisation d'une couche de polymère déposée sur l'électrode d'une décharge radio fréquence à couplage capacitif. La présence des poudres perturbe et modifie les propriétés du plasma. La croissance des poudres peut notamment déclencher des instabilités basse fréquence qui évoluent avec la taille et la densité des poudres. Au centre du plasma, une région sans poudre, appelée void, est souvent observée. Cette région se caractérise en particulier par une forte luminosité. Différents diagnostics (mesures électriques, imagerie vidéo rapide, Fluorescence Induite par Laser) sont utilisées afin d'analyser ces différents comportements résultant des interactions entre le plasma et les poussières. L'analyse approfondie des instabilités a permis de mettre en évidence plusieurs régimes et d'extraire leurs principales caractéristiques comme leur durée et l'évolution de leurs fréquences. Ces instabilités se traduisent par la formation de petites "boules" de plasma qui se déplacent et interagissent au sein de celui-ci. Des phénomènes particulièrement surprenants de fusion et de division de ces boules ont été mis en évidence. Concernant le void, nos travaux ont confirmé la forte excitation présente dans cette zone. Dans la dernière partie de la thèse, la dissociation de l'aluminium triisopropoxide(ATI) est étudiée dans un plasma à l'aide de la Spectroscopie infrarouge à Transformée de Fourier. Ce diagnostic nous a permis de mettre en évidence l'évolution de la densité d'ATI en fonction des paramètres de la décharge. Nous avons également quantifié les différents composants hydrocarbonés formés par polymérisation. / The objective of this thesis is to study the formation of carbonaceous nanoparticles in a low pressure plasma. Dust particles are created by sputtering a polymer layer deposited on the bottom electrode of a capacitively coupled radio-frequency discharge. The presence of dust particles disturbs and changes the plasma properties. The growth of dust particles can trigger low frequency instabilities that evolve with the dust particle size and density. In the center of the discharge, the void, a dust-free region, is observed. It is characterized by an enhanced luminosity. Different diagnostics (electrical measurements, high speed imaging, Laser Induced Fluorescence) are used in order to understand these different behaviors resulting from plasma-dust particle interactions. Dust particle growth instabilities are investigated showing the existence of different instability regimes. Their main characteristics are extracted such as their duration and their evolution frequency. These instabilities are characterized by the formation of small plasma spheroids moving and interacting in the discharge. Several interesting phenomena are evidenced such as the merging and splitting of these plasma spheroids. Concerning the void, our investigations confirmed the high excitation occurring in this region. In the last part of the thesis, the dissociation of aluminium triisopropoxide (ATI) is studied in a plasma using Fourier Transform InfraRed spectroscopy. Thanks to this diagnostic, the evolution of ATI density has been studied as a function of the discharge parameters. We have also quantified the different hydrocarbon compounds formed by polymerization.

La cellulose et ses dérivés sont utilisés dans un vaste nombre d’applications incluant le domaine pharmaceutique pour la fabrication de médicaments en tant qu’excipient. Différents dérivés cellulosiques tels que le carboxyméthylcellulose (CMC) et l’hydroxyéthylcellulose (HEC) sont disponibles sur le commerce. Le degré de polymérisation et de modification diffèrent énormément d’un fournisseur à l’autre tout dépendamment de l’origine de la cellulose et de leur procédé de dérivation, leur conférant ainsi différentes propriétés physico-chimiques qui leurs sont propres, telles que la viscosité et la solubilité. Notre intérêt est de développer une méthode analytique permettant de distinguer la différence entre deux sources d’un produit CMC ou HEC. L’objectif spécifique de cette étude de maitrise était l’obtention d’un profil cartographique de ces biopolymères complexes et ce, par le développement d’une méthode de digestion enzymatique donnant les oligosaccharides de plus petites tailles et par la séparation de ces oligosaccharides par les méthodes chromatographiques simples. La digestion fut étudiée avec différents paramètres, tel que le milieu de l’hydrolyse, le pH, la température, le temps de digestion et le ratio substrat/enzyme. Une cellulase de Trichoderma reesei ATCC 26921 fut utilisée pour la digestion partielle de nos échantillons de cellulose. Les oligosaccharides ne possédant pas de groupements chromophores ou fluorophores, ils ne peuvent donc être détectés ni par absorbance UV-Vis, ni par fluorescence. Il a donc été question d’élaborer une méthode de marquage des oligosaccharides avec différents agents, tels que l’acide 8-aminopyrène-1,3,6-trisulfonique (APTS), le 3-acétylamino-6-aminoacridine (AA-Ac) et la phénylhydrazine (PHN). Enfin, l’utilisation de l’électrophorèse capillaire et la chromatographie liquide à haute performance a permis la séparation des produits de digestion enzymatique des dérivés de cellulose. Pour chacune de ces méthodes analytiques, plusieurs paramètres de séparation ont été étudiés. / Cellulose and its derivatives are used in a wide range of applications, including the pharmaceutical industry for the manufacturing of medicines as inactive additives. Various cellulosic derivatives such as carboxymethylcellulose (CMC) and hydroxyethylcellulose (HEC) are readily available for such use. The degree of polymerization and modification differs from one supplier to the other, according to the origin of the cellulose and its process of chemical modification, conferring on them different physico-chemical properties, such as viscosity and solubility. Our interest is to develop an analytical method that can distinguish between different sources of a given CMC or HEC product. The specific objective of this master’s study was to obtain a fingerprint of these complex biopolymers by developing an enzymatic digestion method to produce smaller oligosaccharides that could be separated by simple chromatographic methods. The digestion was studied as a function of various parameters, such as the composition of the hydrolysis solution, the pH, the temperature, the duration of digestion and the substrate/enzyme ratio. A cellulase enzyme from Trichoderma reesei ATCC 26921 was used for the partial digestion of our samples of cellulose. Since these oligosaccharides do not possess a chromophore or fluorophore, they can’t be detected either by absorbance or fluorescence. It was thus necessary to work out the labeling method for oligosaccharides using various agents, such as 8-aminopyrene-1,3,6-trisulfonic acid (APTS), 3-acetylamino-6-aminoacridine (AA-Ac) and phenylhydrazine (PHN). Finally, the use of capillary electrophoresis and high performance liquid chromatography allowed the separation of the enzymatic digestion products of the cellulose derivatives (CMC and HEC). For each of these analytical separation techniques, several parameters of the separation were studied.

La métrologie laser basée sur l'analyse de la fluorescence de traceurs moléculaires est devenue l'un des outils clefs pour l'étude expérimentale de la dynamique des fluides réactifs. Une étude spectroscopique des propriétés photophysiques de fluorescence dans le domaine spectral UV-visible de plusieurs molécules fluorescentes appartenant aux cétones aliphatiques et aux aromatiques mono- et bicycliques a permis d'approfondir la compréhension de l'influence de la température, de la pression et de la concentration d'oxygène sur leur fluorescence. Les résultats expérimentaux obtenus ont ensuite permis le développement d'un modèle de simulation du rendement de fluorescence pour les espèces aromatiques (naphtalène et toluène), qui fournit des résultats très proches de ceux mesurés.De ces résultats, le développement de la technique d'imagerie de fluorescence (PLIF) sur la phase vapeur d'un carburant multi-composant a conduit à étendre cette analyse spectrale de fluorescence au cas du kérosène (Jet A-1). La comparaison entre les propriétés de fluorescence du kérosène et des traceurs aromatiques étudiés a notamment permis d'établir une stratégie de mesure de la concentration de la phase vapeur du kérosène dans des environnements où la teneur en oxygène est variable. Les signaux de fluorescence provenant des espèces mono- et di-aromatiques contenues dans le kérosène soulignent des évolutions différentes avec les conditions de température et teneur en oxygène. L'utilisation de filtres optiques appropriés associés à deux caméras ICCD permet alors une mesure bidimensionnelle de la température et de la concentration de kérosène en phase vapeur. La thèse débouche finalement sur l'application de cette technique PLIF-kérosène en combinaison avec la technique PLIF du radical OH en sortie d'un système d'injection industriel multi-point de nouvelle génération intégré dans une chambre de combustion haute pression.

Cette thèse est une contribution à l’étude des flammes de méthane turbulentes non prémélangées en rotation, dites swirlées, avec ou sans enrichissement en oxygène de l’oxydant. L’étude se focalise sur la stabilité de la flamme, les émissions polluantes et la dynamique du jet en non réactif et réactif. Notre dispositif expérimental se compose d’un brûleur à swirler coaxial avec injection radiale de méthane au voisinage de la sortie du brûleur. Ce dernier est confiné dans une chambre de combustion. La teneur en oxygène dans l’oxydant, le nombre de swirl géométrique et la richesse globale à l’injection sont les principaux paramètres qui peuvent être précisément contrôlés. La stabilité de la flamme est caractérisée par chimiluminescence OH*. Les émissions polluantes sont mesurées par des analyseurs en ligne via un prélèvement dans les gaz brûlés. La dynamique du jet est caractérisée principalement par PIV stéréoscopique dans un plan longitudinal et plusieurs plans transverses. La diffusion du méthane dans le jet swirlé est abordée qualitativement par fluorescence induite par laser de l’acétone dans un plan. À ce jour, peu de travaux portent sur la caractérisation notamment dynamique de ces flammes swirlées avec enrichissement en O2. La mise en rotation du jet est à l’origine d’une zone de recirculation centrale qui favorise la stabilisation de la flamme en régime pauvre et à grand nombre de Reynolds. L’étude des émissions polluantes montre que les régimes de combustion à l’air pour lesquels la flamme est liftée stable sont aussi ceux qui produisent du CO et du CH4 résiduel en des quantités non négligeables. L’enrichissement en oxygène permet alors de convertir les imbrûlés et ce pour de faibles enrichissements tout en améliorant la stabilité de flamme via une diminution de la hauteur d’accrochage et des fluctuations associées comme le confirment de précédentes études. L’augmentation des NOx par la voie thermique a été quantifiée pour des enrichissements en oxygène inférieurs à 30 % vol. L’étude systématique en non réactif et réactif apporte des détails sur la topologie tridimensionnelle du jet swirlé suivant les paramètres de l’étude. L’étude de la décroissance des vitesses et de la décroissance du nombre de swirl dans la direction de l’écoulement permetde mettre en évidence l’effet de la flamme sur le jet swirlé. Un couplage entre l’évolution du taux d’entraînement par la recirculation externe et les émissions polluantes est mis en évidence pour expliquer l’évolution des NOx suivant la richesse globale à l’injection. Nous avons proposé une modélisation des écoulements swirlés qui repose sur les écoulements à vorticité hélicoïdale afin d’identifier les caractéristiques principales des structures hélicoïdales au sein de l’écoulement. / This thesis is a contribution to the study of turbulent non-premixed swirling methane flames with or without oxygen addition in the oxidizer. The study deals with the flame stability, the pollutant emissions and the jet dynamic behaviour in non-reacting and reacting conditions. The burner, operating in a combustion chamber, consists of two concentric tubes with a swirler placed in an annular arrangement, which supplied the oxidant flow (air or oxygen-enriched air). The central pipe delivers fuel (methane) radially just below the burner exit plane. The oxygen content in the oxidizer, the geometric swirl number and the global equivalence ratio are the main parameters, which can be precisely set. OH* chemiluminescence imaging is used to characterize flame stability. Multi-gas analyzers are used to measure pollutant emissions in the exhaust gas. The flow is characterized using stereoscopic PIV measurements in different longitudinal and transverse planes. A qualitative study dealing with the methane diffusion imaging is also conducted by use of acetone planar laser-induced fluorescence. Up to now only few studies have examined the dynamic behavior of this type of swirled flames with oxygen addition. Introducing swirl allows creating a central recirculation zone which favors lean flame stabilization at higher Reynolds numbers. The mapping of the combustion regimes combined with the pollutant emission results show that the stable lifted flames are related to high CO and residual CH4 emission levels in the exhaust gas. Oxygen addition, even by a few percent, allows improving CO and unburned hydrocarbons conversion and increasing flame stability at the same time via a decrease of liftoff heights and the related fluctuations. The NOx emissions increase via the thermal pathway with increasing the oxygen-enrichment rate up to 30 % vol. A comparative study in non-reacting and reacting conditions is conducted to give insight into the tridimensional flow field topology varying the above-mentioned parameters. Mean streamwise velocity and swirl number decay rates show the flame effects on the flow dynamics. A coupling mechanism between the entrainment rate of the surroundings via the external recirculation and the pollutant emissions is proposed to explain the NOx emission trend with the global equivalence ratio. A model is also proposed based on the helical vortices to identify the main features of helix structures in the jet in non-reacting and reacting conditions.

La propulsion électrique est à un tournant de son histoire. La récente mise en oeuvre de satellites de télécommunication "tout-électrique" se traduit par l’ouverture d’un nouveau marché, et par une évolution des besoins opérationnels. L’identification de ces nouvelles missions nécessite l’amélioration des performances de nos moteurs. La première partie de ces travaux rapporte l’utilisation d’un outil de spectroscopie laser destiné à caractériser la distribution en vitesse des ions. Les différentes méthodes de calcul du champ électrique dans les propulseurs de Hall ont été exposées. Deux instabilités ioniques ont été observées et analysées. Les sources d’erreurs liées aux mesures par sondes électrostatiques ont été analysées, et un exemple de sonde plane étudié. Une analyse paramétrique de l’influence des paramètres de champ magnétique sur les performances des propulseurs de Hall a été conduite. Le concept de moteur "sans parois" est présenté. L’identification de ce concept constitue une avancée porteuse de promesses pour l’avenir de la propulsion électrique. / Electric propulsion is facing new challenges. Recently, the launch of "all-electric" satellites has marked the debut of a new era. Going all-electric now appears as an interesting alternative to conventional systems for telecom operators. A laser spectroscopy technique was used during this research to investigate the ion velocity distribution dynamics. The different methods for determining the electric field in Hall thrusters were exposed. Two unstable ion regimes were identified and examined. Measurement uncertainties using electrostatic probes were assessed. Planar probed have been designed and tested. A thorough investigation of the influence of the magnetic field parameters on the performance of Hall thrusters was performed. The wall-less Hall thruster design was presented, and preliminary experiments have revealed its interest for the electric propulsion community.

Cette thèse à été réalisée au sein de l'équipe d'astrophysique de laboratoire du département de physique moléculaire de l'Institut de Physique de Rennes. Dans ces travaux, une première partie présente l'application de la technique CRESU à l'étude d'agrégats de Van der Waals d'eau et de propane. Nous avons observé expérimentalement la formations d'agrégats d'eau sur une gamme de températures allant de 22.9 à 69.4 K, puis modélisé les premières étapes de l'agrégation en nous appuyant sur la détermination théorique de coefficients de vitesse. Nous avons également effectué les premières mesures du coefficient de formation du dimère de propane sur une gamme de température allant de 22.9 à 49.1 K. La seconde partie de ces travaux porte sur la détection de les produits de réactions impliquant les atomes de carbone et diverses molécules (C2H4, C2H6, C4H8 et NH3) à une température ambiante. Ces études ont été menées au synchrotron de l'Adavanced Light Source de Berkeley. Nous avons également étudié la cinétique et la formation des produits de la réaction entre atomes de carbone et ammoniac sur une gamme de température allant de 50 à 296 K. Pour cela nous avons utilisé le dispositif CRESU de l'Institut des Sciences Moléculaires de Bordeaux. Ces données ont été incrémentées dans un modèle de nuage interstellaire dense afin de voir leur influence sur l'abondance des hydrures azotées. Les travaux de cette thèse contribuent à mieux comprendre les mécanismes de réactions élémentaires menant à la formation et à la croissance de molécules et d'agrégats de Van der Waals en phase gazeuse dans des conditions physiques variées. Ils fournissent des données importantes pour la modélisation d'atmosphères planétaires, de nuages interstellaires et de processus de combustion. / This thesis has been carried out in the team of astrophysics laboratory in the Molecular Physics Department of the Physics Institute of Rennes. In this work, a first part presents the application of the CRESU technique to aggregation of van der Waals clusters of water and propane. We experimentally observed water aggregation on a range of temperatures from 22.9 to 69.4 K, then modeled the early stages of aggregation building on the theoretical determination of rate coefficients. We also made the first measurements of propane dimer formation coefficient over a temperature range of 22.9 to 49.1 K. The second part of this work concerns the detection of the products reactions involving carbon atoms and various molecules (C2H4 , C2H6 , C4H8 and NH3) at room temperature. These studies were conducted at the synchrotron Adavanced Light Source of Berkeley . We also studied the kinetics and products formation of the reaction between carbon atoms and ammonia over a temperature range of 50-296 K. To do this we used the device CRESU of the molecular science institute of Bordeaux. This data was incremented in a dense interstellar cloud model to see their influence on the abundance of nitrogen hydrides. The work of this thesis contribute to better understanding the mechanisms of reactions leading to the formation and growth of molecules and van der Waals clusters in the gas phase in various physical conditions. They provide important data for modeling planetary atmospheres , interstellar clouds and combustion process.

Des années 50 à nos jours, la propulsion électrique n'a cessé d'évoluer afin de s'imposer dans le domaine de la propulsion spatiale. Les Propulseurs à effet Hall (PEH) sont principalement utilisés pour des missions de correction de trajectoire ou de maintien en orbite des satellites. Ils délivrent des faisceaux d'ions à forte densité de courant et à faible énergie, ce qui en font de bons candidats potentiels pour d'autres applications comme la microélectronique ou encore les traitements de surfaces. Le xénon est l'ergol le plus utilisé en raison de sa masse élevée et de son faible énergie d'ionisation. Cependant son coût élevé et la difficulté d’approvisionnement motivent la recherche d'alternatives pour le fonctionnement des MEH. C'est dans ce cadre que cette thèse s'est inscrite avec l'idée d'un développement d'une source de faible puissance fonctionnelle en argon. L'amorçage d'une telle décharge n'étant pas immédiat, une démarche progressive qui passe par des décharges de mélange de gaz a été adoptée. Les décharges Xe-Ar se sont révélées très intéressantes pour la compréhension des mécanismes physiques qui régissent les PEH. La caractérisation en vitesse des ions Xe II (par Fluorescence Induite par Laser) associée à l'analyse en énergie par RPA a permis de remonter à des informations utiles sur les zones d'ionisation et d'accélération. Une technique originale de résolution temporelle du RPA basée sur une interruption rapide de la décharge ou sur les oscillations naturelles du courant de décharge, a été développée et a permis l'identification et la quantification des différentes espèces présentes dans le jet d'ions. Grâce aux résultats de l'étude paramétrique des décharges de mélange Xe-Ar, une décharge d'argon pur a pu être amorcée et caractérisée pour la première fois dans un PEH de faible puissance. / Since the 50s, electric propulsion has improved in order to establish itself on space propulsion field. The Hall Effect Thruster (HET) are mainly used for trajectory correction or satellites orbit maintaining. The HET provide high current densities and low energy ion beam that making it a good candidate for other applications such as microelectronics or surface treatments. Xenon propellant is most commonly used due to its high atomic mass and its low ionization energy. However, the high cost and difficult supply of xenon, leads to looking for alternative propellant for HET operation. In this context, this PhD thesis had as goal the development of a functional Argon low power source. Argon discharge ignition is not immediate, that why a progressive approach which involves gas mixture discharges was adopted. The Xe-Ar discharge gives very interesting results for the understanding of physical mechanisms governing HET. The characterization of Xe II ions velocity (Laser Induced Fluorescence) associated to the energy analysis by RPA have provided access to useful information on ionization and acceleration areas. An original time resolved RPA technique, based on an ultra-fast discharge interruption or on the discharge current oscillations, has been developed. This technique allows the identification and the quantification of different species present in the ion beam. Thanks to the discharge Xe-Ar study, a pure argon discharge could be initiated and characterized for the first time in a low power HET.

La cartographie peptidique est une méthode qui permet entre autre d’identifier les modifications post-traductionnelles des protéines. Elle comprend trois étapes : 1) la protéolyse enzymatique, 2) la séparation par électrophorèse capillaire (CE) ou chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC) des fragments peptidiques et 3) l’identification de ces derniers. Cette dernière étape peut se faire par des méthodes photométriques ou par spectrométrie de masse (MS). Au cours de la dernière décennie, les enzymes protéolytiques immobilisées ont acquis une grande popularité parce qu’elles peuvent être réutilisées et permettent une digestion rapide des protéines due à un rapport élevé d’enzyme/substrat. Pour étudier les nouvelles techniques d’immobilisation qui ont été développées dans le laboratoire du Professeur Waldron, la cartographie peptidique par CE est souvent utilisée pour déterminer le nombre total de peptides détectés et leurs abondances. La CE nous permet d’avoir des séparations très efficaces et lorsque couplée à la fluorescence induite par laser (LIF), elle donne des limites de détection qui sont 1000 fois plus basses que celles obtenues avec l’absorbance UV-Vis. Dans la méthode typique, les peptides venant de l’étape 1) sont marqués avec un fluorophore avant l’analyse par CE-LIF. Bien que la sensibilité de détection LIF puisse approcher 10-12 M pour un fluorophore, la réaction de marquage nécessite un analyte dont la concentration est d’au moins 10-7 M, ce qui représente son principal désavantage. Donc, il n’est pas facile d’étudier les enzymes des peptides dérivés après la protéolyse en utilisant la technique CE-LIF si la concentration du substrat protéique initial est inférieure à 10-7 M. Ceci est attribué à la dilution supplémentaire lors de la protéolyse. Alors, afin d’utiliser le CE-LIF pour évaluer l’efficacité de la digestion par enzyme immobilisée à faible concentration de substrat,nous proposons d’utiliser des substrats protéiques marqués de fluorophores pouvant être purifiés et dilués. Trois méthodes de marquage fluorescent de protéine sont décrites dans ce mémoire pour étudier les enzymes solubles et immobilisées. Les fluorophores étudiés pour le marquage de protéine standard incluent le naphtalène-2,3-dicarboxaldéhyde (NDA), la fluorescéine-5-isothiocyanate (FITC) et l’ester de 6-carboxyfluorescéine N-succinimidyl (FAMSE). Le FAMSE est un excellent réactif puisqu’il se conjugue rapidement avec les amines primaires des peptides. Aussi, le substrat marqué est stable dans le temps. Les protéines étudiées étaient l’-lactalbumine (LACT), l’anhydrase carbonique (CA) et l’insuline chaîne B (INB). Les protéines sont digérées à l’aide de la trypsine (T), la chymotrypsine (CT) ou la pepsine (PEP) dans leurs formes solubles ou insolubles. La forme soluble est plus active que celle immobilisée. Cela nous a permis de vérifier que les protéines marquées sont encore reconnues par chaque enzyme. Nous avons comparé les digestions des protéines par différentes enzymes telles la chymotrypsine libre (i.e., soluble), la chymotrypsine immobilisée (i.e., insoluble) par réticulation avec le glutaraldéhyde (GACT) et la chymotrypsine immobilisée sur billes d’agarose en gel (GELCT). Cette dernière était disponible sur le marché. Selon la chymotrypsine utilisée, nos études ont démontré que les cartes peptidiques avaient des différences significatives selon le nombre de pics et leurs intensités correspondantes. De plus, ces études nous ont permis de constater que les digestions effectuées avec l’enzyme immobilisée avaient une bonne reproductibilité. Plusieurs paramètres quantitatifs ont été étudiés afin d’évaluer l’efficacité des méthodes développées. La limite de détection par CE-LIF obtenue était de 3,010-10 M (S/N = 2,7) pour la CA-FAM digérée par GACT et de 2,010-10 M (S/N = 4,3) pour la CA-FAM digérée par la chymotrypsine libre. Nos études ont aussi démontrées que la courbe d’étalonnage était linéaire dans la région de travail (1,0×10-9-1,0×10-6 M) avec un coefficient de corrélation (R2) de 0,9991. / Peptide mapping is a routine method for identifying post-translational modifications of proteins. It involves three steps: 1) enzymatic proteolysis, 2) separation of the peptide fragments by capillary electrophoresis (CE) or high performance liquid chromatography (HPLC), 3) identification of the peptide fragments by photometric methods or mass spectrometry (MS). During the past decade, immobilized enzymes for proteolysis have been gaining in popularity because they can be reused and they provide fast protein digestion due to the high ratio of enzyme-to-substrate. In order to study new immobilization techniques developed in the Waldron laboratory, peptide mapping by CE is frequently used, where the total number of peptides detected and their abundance are related to enzymatic activity. CE allows very high resolution separations and, when coupled to laser-induced fluorescence (LIF), provides excellent detection limits that are 1000 times lower than with UV-Vis absorbance. In the typical method, the peptides produced in step 1) above are derivatized with a fluorophore before separation by CE-LIF. Although the detection sensitivity of LIF can approach 10 12 M for a highly efficient fluorophore, a major disadvantage is that the derivatization reaction requires analyte concentrations to be approx. 10 7 M or higher. Therefore, it is not feasible to study enzymes using CE-LIF of the peptides derivatized after proteolysis if the initial protein substrate concentration is <10-7 M because additional dilution occurs during proteolysis. Instead, to take advantage of CE-LIF to evaluate the efficiency of immobilized enzyme digestion of low concentrations of substrate, we propose using fluorescently derivatized protein substrates that can be purified then diluted. Three methods for conjugating fluorophore to protein were investigated in this work as a means to study both soluble and immobilized enzymes. The fluorophores studied for derivatization of protein standards included naphthalene-2,3-dicarboxaldehyde (NDA), fluoresceine-5-isothiocyanate (FITC) and 6-carboxyfluorescein N-succinimide ester (FAMSE). The FAMSE was found to be an excellent reagent that conjugates quickly with primary amines and the derivatized substrate was stable over time. The studied substrates were -lactalbumin (LACT), carbonic anhydrase (CA) and insulin chain-B (INB). The CE-LIF peptide maps were generated from digestion of the fluorescently derivatized substrates by trypsin (T), chymotrypsin (CT) or pepsin (PEP), either in soluble or insoluble forms. The soluble form of an enzyme is more active than the immobilized form and this allowed us to verify that the conjugated proteins were still recognized as substrates by each enzyme. The digestion of the derivatized substrates with different types of chymotrypsin (CT) was compared: free (i.e., soluble) chymotrypsin, chymotrypsin cross-linked with glutaraldehyde (GACT) and chymotrypsin immobilized on agarose gel particles (GELCT), which was available commercially. The study showed that, according to the chymotrypsin used, the peptide map would vary in the number of peaks and their intensities. It also showed that the digestion by immobilized enzymes was quite reproducible. Several quantitative parameters were studied to evaluate the efficacy of the methods. The detection limit of the overall method (CE-LIF peptide mapping of FAM-derivatized protein digested by chymotrypsin) was 3.010-10 M (S/N = 2.7) carbonic anhydrase using insoluble GACT and 2.010-10 M (S/N = 4.3) CA using free chymotrypsin. Our studies also showed that the standard curve was linear in the working region (1.0×10-9-1.0×10-6 M) with a correlation coefficient (R2) of 0.9991.

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