Submitted by Cássio da Cruz Nogueira (cassionogueirakk@gmail.com) on 2017-10-16T17:25:12Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_AvaliacaoInvitroEfeitos.pdf: 1226021 bytes, checksum: 04d04874e9e2a9c1dc6bb2c6529fdff8 (MD5) / Approved for entry into archive by Irvana Coutinho (irvana@ufpa.br) on 2017-10-24T12:47:12Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_AvaliacaoInvitroEfeitos.pdf: 1226021 bytes, checksum: 04d04874e9e2a9c1dc6bb2c6529fdff8 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-24T12:47:12Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_AvaliacaoInvitroEfeitos.pdf: 1226021 bytes, checksum: 04d04874e9e2a9c1dc6bb2c6529fdff8 (MD5) Previous issue date: 2011 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A amebíase caracteriza-se como uma doença crônica, não inflamatória, afebril que envolve a parede do intestino grosso podendo invadir a mucosa intestinal e se disseminar para outros órgãos, principalmente o fígado. A infecção por Entamoeba histolytica é tratada pelo metronidazol, mas este apresenta efeitos colaterais, por isso buscam-se medicamentos mais eficazes e que não tragam nenhum efeito adverso ao paciente. Além disso, o teste de novos fármacos pode revelar importantes particularidades do parasito, tais como a descoberta de vias metabólicas ou mesmo possíveis diferenças em sua estrutura. No presente trabalho foi testado o efeito amebicida do metronidazol, da dinitroanilina orizalina, uma droga inibidora de microtúbulos, da aquilfosfocolina miltefosina, que inibe a síntese de fosfolipídios de membrana, e da droga hibrida TC95, que apresenta os grupos funcionais dinitroanilina e alquilfosfocolina. Realizou-se cultura com trofozoítos do protozoário, onde as drogas e o controle com os diluentes foram adicionados após 7 horas de cultivo. Foi feita a contagem dos trofozoítos viáveis após período de 12 horas da adição das drogas e do controle em intervalos de 12 a 60 horas. Após análise das curvas de crescimento, detectou-se que o TC95 foi a droga mais efetiva dos três tratamentos, a miltefosina obteve pouca inibição e a orizalina não foi efetiva. Isso se deve a maior suscetibilidade do parasito a danos de membrana, com pouca efetividade da inibição dos microtúbulos. / Amebiasis is characterized as a chronic, noninflammatory, afebrile which involves the colon wall and can invade the intestinal mucosa and spread to other organs, especially the liver. Entamoeba histolytica infection is treated with metronidazole, but this one presents side effects, so researches have been done to find more effective drugs with no adverse effects to the patient. In addition, testing new drugs may reveal important features of the parasite, such as the discovery of metabolic pathways or possible differences in their structure. In the present study, it was tested the amoebicidal effect of metronidazole, dinitroaniline oryzalin, a microtubule inhibitor, miltefosine, an alkylphosphocholine, that inhibits the membrane phospholipids syntesis, and TC95, a hybrid drug that presents the functional groups dinitroaniline and alkylphosphocholine. It was performed a culture with protozoan trophozoites, where the drugs and the control with diluents were added after 7 hours of culture. It was made a count of the viable trophozoites 12 hours after the addition of the drugs and the control at intervals of 12 to 60 hours. After analyzing the growth curves, it was found that the TC95 was the most effective drug of the three treatments, miltefosine had little inhibition and oryzalin was not effective. This is due to greater susceptibility of the parasite to membrane damage, with little effectiveness on microtubules inhibition.

O objetivo deste trabalho foi desenvolver biosensores de membranas baseados na técnica de Ressonância Plasmônica de Superfície (SPR) e aplicá-los no estudo da interação do citocromo c (cit c) com modelos de membranas. SPR é uma técnica ótica, que através de medidas de variações de índice de refração (n) próximas a uma interface mensura com alta sensibilidade a adsorção ou ligação de moléculas. Inicialmente desenvolvemos um sistema de gradiente de fluxo acoplado ao SPR, denominado FIG-SPR, e demonstramos a determinação automatizada da variação de n em função da concentração (dn/dC) de diferentes compostos e biopolímeros. O desenvolvimento dos biosensores de membranas iniciou-se com o estudo dos fatores que afetam a formação de uma membrana de bicamada híbrida (HBM). HBMs são compostas de uma monocamada de alcanotiol adsorvida sobre o ouro, e sobre esta uma camada fosfolipídica. A formação da HBM depende da fusão de vesículas em superfícies hidrofóbicas e que não é bem compreendido no nível molecular. Nossos estudos mostraram que na presença de cálcio e espermina a formação da HBM é favorecida, de tal forma que a monocamada de fosfolipídio alcança valores de espessura próximos àqueles previstos, cerca de 20 Å\'. Além disso, mostramos que em soluções de baixa força iônica a camada lipídica não é homogênea. Demonstramos também que a presença de cálcio na concentração 150 mM diminui o tempo de formação da monocamada lipídica cerca de 14 vezes quando comparado ao tempo indicado na literatura. A homogeneidade da HBM e a carga superficial da mesma foram verificadas com a adsorção e a dissociação de cit c e de albumina bovina (BSA). Utilizando HBMs de composição lipídica variada demonstramos a adsorção e a dissociação de cit c induzida por cálcio em HBMs mistas, incluindo um modelo mimético da membrana mitocondrial interna (IMM) constituído de fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina e cardiolipina (PC/PE/CL) na proporção (4,5:3,5:2,0). Demonstramos que a adsorção de cit c nativo segue um perfil cooperativo e padrões esperados de variação de afinidade e cooperatividade em pHs 6,8, 7,4 e 8,0. Um modelo matemático foi desenvolvido para tratar as curvas de ligação de cit c, que é uma adaptação do modelo de Hill para adsorção de proteínas em superfícies. Os resultados de SPR juntamente com dados obtidos por Microscopia de Força Atômica (AFM) sugerem que a ligação cooperativa de cit c com HBM ocorre devido à reorganização das moléculas de CL e formação de domínios fosfolipídicos. O tratamento dos resultados cinéticos da dissociação de cit c por cálcio indica a existência de duas constantes de velocidade de dissociação (kd), sendo a primeira constante (kd1) relacionada à perda das interações eletrostáticas entre a proteína e a HBM, e a segunda (kd2) à perda das interações hidrofóbicas. Além disso, a dissociação do cit c do modelo estudado requer uma concentração mínima de cálcio de 30 µM para se tornar significativa. O estudo da interação entre moléculas de cit c foto-oxidadas (citc405) e a HBM de PC/PE/CL sugerem que ela ocorre com menor afinidade, nos três pHs estudados, se comparados aos resultados com cit c nativo. Além disso, nossos resultados sugerem que o citc405 não é facilmente dissociado por cálcio devido à perda da cooperatividade na interação. Possíveis implicações em eventos celulares destas descobertas, como a liberação do cit c da IMM e a iniciação da apoptose, são discutidas / The aim of this work was to develop membrane biosensors based on Surface Plasmon Resonance (SPR) and to apply them to study the interactions between cytochrome c (cyt c) and model membranes. SPR is an optical technique that provides high-sensitivity measurements of refractive index (n), allowing the characterization of the adsorption and desorption of molecules near interfaces. Initially we developed a flow gradient system connected to SPR, which was called FIG-SPR, and demonstrated the automated determination of the concentration gradient of refractive index (dn/dC) of different materials and biopolymers. The development of the membrane biosensors was initiated by studying the factors that affect the formation of a hybrid bilayer membrane (HBM). HBMs are composed of two monolayers: an alcanethiol monolayer adsorbed on gold over which is adsorbed a layer of phospholipids. The formation of an HBM depends on the fusion of phospholipid vesicles on hydrophobic surfaces, a process that is not well understood at the molecular level. Our results showed that in the presence of calcium and spermine the complete formation of an HBM is facilitated, i.e., the phospholipid monolayer reaches the expected thickness of about 20Å\'. However, in low ionic strength solutions the lipid layer that is formed is not homogeneous. We have also demonstrated that in the presence of 150 mM of calcium the time necessary for the formation of the lipid monolayer is reduced 14 times when compared to the times suggested in the literature. The homogeneity of the HBM and its superficial charge were verified with the adsorption and desorption of cyt c and bovine serum albumine (BSA). The adsorption and desorption of cyt c in different HBMs were studied including a model of the internal mitochondrial membrane (IMM), which is made of phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine and cardiolipin (PC/PE/CL) in the ratio (4,5: 3,5: 2,0). We demonstrated that the adsorption of native cyt c follows a cooperative profile showing expected changes in affinity and cooperativity in different solution pHs of 6,8, 7,4 and 8,0. A mathematical model, which is an adaptation of the Hill model for adsorption of proteins in surfaces, was developed to treat the binding curves of cyt c. The results of SPR together with those obtained by Atomic Force Microscopy (AFM) suggested that the cooperative binding of cyt c in HBMs occurs due to the reorganization of CL molecules and formation of phospholipid domains. The kinetic results of the dissociation of cyt c induced by calcium indicates the existence of two velocity constants (kd), being the larger (kd1) related to the dissociation of cyt c interacting electrostatically with the HBM, and the smaller (kd2) related to the dissociation of cyt c interacting hydrophobically with the HBM. Moreover, the dissociation of cyt c from the HBM requires a minimum calcium concentration of 30 µM. The study of the interaction between photo-oxidized cyt c molecules (cytc405) and the PC/PE/CL HBM suggests that it occurs with smaller affinity when compared with the results obtained with the native cyt c. Moreover, cytc405 is not easily dissociated by calcium due to the loss of the interaction cooperativity with the HBM. Possible implications of these discoveries in cellular events, such as the release of cyt c from the IMM and the initiation of apoptosis, are discussed