Malgré les progrès récents associés à l’utilisation des nucléases d’ingénierie du génome, certaines problématiques persistent. Par exemple, l’isolement des cellules génétiquement modifiées est un travail long et parfois laborieux. De plus, la spécificité des nucléases est aussi un point souvent mal caractérisé. Cette dernière peut avoir des conséquences importantes in vitro, mais particulièrement in vivo. Le but de mon projet de maitrise était de développer des techniques permettant d’adresser ces deux problématiques. Ici, nous avons créé une cassette de sélection auto-excisable qui exploite le processus de réparation par appariement simple brin (SSA) et qui permet une isolation simple de clones modifiés sans laisser de « cicatrices » dans l’ADN. Le procédé se base sur une sélection à la puromycine, une contre sélection au ganciclovir et une excision de la cassette de résistance via l’utilisation de nucléases thermosensibles. Nous avons démontré la faisabilité de cette approche en intégrant la protéine fluorescente EGFP au locus AAVS1 et en insérant une étiquette de purification au locus EZH2. Ce locus code la protéine Enhancer of Zeste Homolog 2 (EZH2). Dans un deuxième temps, nous avons évalué la possibilité d’utiliser deux paires de nickases pour créer deux cassures simple brin (SSB) et ainsi induire indirectement une cassure double brin dans l’ADN. Cette approche permet de diminuer de façon importante la possibilité de créer des mutations à des sites non-ciblés. Nous avons déterminé que deux SSBs doivent avoir lieu sur des brins opposés et à proximité afin de stimuler la modification génique voulue. Toutefois, ces paires de nickases ont une efficacité plus faible que les nucléases clivant au même endroit. Les nouveaux outils décrits dans ce mémoire permettront éventuellement de simplifier l’ingénierie du génome en diminuant la charge de travail nécessaire à l’enrichissement des cellules modifiées génétiquement et en augmentant la spécificité des nucléases, ce qui permet de réduire les probabilités de mutations à des loci hors cible. / Despite recent advances in the use of engineered nucleases, some issues remain. For example, isolation of genetically engineered cells is a long and sometimes laborious process. Moreover, the specificity of nucleases is often poorly characterized. The latter may have important consequences in vitro, but particularly in vivo. We aimed to develop techniques for addressing these two problems. Here we have created a self-excisable selection cassette that exploits the single-strand annealing (SSA) repair process and allows for simple isolation of modified clones and scarless genome editing. The method is based on puromycin selection, ganciclovir counter-selection and excision of the resistance cassette via the use of heat-sensitive nucleases. We demonstrate the feasibility of this approach by integrating the fluorescent protein EGFP at the AAVS1 locus and by inserting a purification tag at the EZH2 locus. This locus encodes the protein Enhancer of Zeste Homolog 2 (EZH2). Secondly, we evaluated the possibility of using two pairs of nickases to create two single-strand breaks that could be repaired as a double strand break. As a proof of concept, we created two single-strand breaks at a distance of 513 bp at the CCR5 locus. When they take place on opposite strands, the latter can recreate the effect of a double-strand break, but with a lower efficiency than the nucleases cleaving at the same site. We determined that the double-strand break effect created by two single-strand breaks increases as the distance between the two single-strand breaks decreases. The new tools described here make it possible to simplify genome engineering by reducing the workload necessary for the enrichment of genetically modified cells and by increasing the specificity of the nucleases by decreasing the potential for off-target mutagenesis.

Thèse ou mémoire avec insertion d'articles. / Les biodiesels, des carburants renouvelables d'origine biologique obtenus par transestérification des huiles, sont considérés comme des alternatives plus respectueuses de l'environnement en comparaison aux diesels pétroliers. Leur combustion génère moins d'émissions de monoxyde de carbone, de dioxyde de soufre et d'hydrocarbures imbrûlés que les diesels. Cependant, malgré leurs avantages, les biodiesels présentent une viscosité élevée entraînant des problèmes d'atomisation, une faible stabilité à l'oxydation, une mauvaise performance à basse température et des émissions plus importantes d'oxydes d'azote. L'objectif de ce projet de maîtrise était d'optimiser le profil lipidique de la levure oléagineuse *Yarrowia lipolytica* grâce à la biologie synthétique pour produire des biodiesels aux propriétés améliorées. Les mutants construits durant cette étude ont montré une augmentation des titres lipidiques et ont généré des profils lipidiques plus insaturés. À l'aide de modèles mathématiques basés sur la longueur et l'insaturation des lipides, les propriétés des biodiesels produits à partir de ces mutants ont été prédites, révélant des biodiesels améliorés avec une viscosité réduite et une opérabilité à des températures sous 0 °C. D'ailleurs, ce travail a abouti à l'amélioration de l'efficacité de l'édition génétique par CRISPR-Cas9 chez *Y. lipolytica* par le développement du promoteur synthétique p*TEF*(-41-406)-Kozak pour l'expression de l'endonucléase Cas9. De plus, nous avons optimisé les conditions de croissance de la levure pour une surproduction de lipides en utilisant un plan factoriel. Pour ce dernier, nous avons développé et standardisé une méthode de quantification des lipides à haut débit basée sur la fluorescence du rouge de Nil. Les essais d'optimisation ont révélé qu'un ratio C/N de 61 est optimal pour obtenir le meilleur rendement lipidique en culture. Ces travaux contribuent à faire avancer la recherche sur les biodiesels provenant des levures oléagineuses en tant que remplacement aux diesels et à l'avancement des connaissances sur les lipides microbiens. / Biodiesels are renewable fuels of biological origin obtained by transesterification of oils and are considered more environmentally-friendly alternatives to petroleum-based diesels. Their combustion generates fewer emissions of carbon monoxide, sulfur dioxide and unburned hydrocarbons than diesels. However, despite their advantages, biodiesels have a high viscosity leading to atomization problems, a poor oxidation stability, a poor low-temperature performance and higher emissions of nitrogen oxides. The aim of this project was to optimize the lipid profile of the oleaginous yeast *Yarrowia lipolytica* using synthetic biology to produce biodiesels with improved properties. The mutants constructed during this study showed an increase in lipid titers and generated more unsaturated lipid profiles. Using mathematical models based on lipid length and unsaturation, the properties of biodiesels produced from these mutants were predicted, revealing improved biodiesels with reduced viscosity and better operability at temperatures below 0°C. Moreover, this work led to the improvement of the efficiency of CRISPR-Cas9 gene editing in *Y. lipolytica* through the development of the synthetic promoter p*TEF*(-41-406)-Kozak for the expression of the Cas9 endonuclease. In addition, we optimized yeast growth conditions for lipid overproduction using a factorial design. For the latter, we developed and standardized a high-throughput lipid quantification method based on Nile Red fluorescence. Optimization trials revealed that a C/N ratio of 61 is optimal for obtaining the best lipid yield in culture. This work contributes to advance research on biodiesels from oleaginous yeasts as a replacement for diesels, and to further the knowledge of microbial lipids.

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L'intention de ce mémoire est d'éclairer le processus de privatisation des êtres vivants qui découle des manipulations technoscientifiques visant la production d'organismes génétiquement modifiés. Premièrement, une rétrospective des développements conceptuels ayant jalonné l'histoire de la génétique permet de révéler l'origine des concepts clés par l'entremise desquels la biologie moléculaire contemporaine appréhende son objet d'étude. Deuxièmement, les thèses fondatrices de la biologie moléculaire -le déterminisme génétique et le mutationnisme évolutif -sont confrontées à une conception alternative des phénomènes d'ontogenèse et de phylogenèse inspirée de la phénoménologie afin de dévoiler les limites inhérentes à la conception génétique des êtres vivants. Finalement, en opposition à l'objectivité dont se pare la biologie moléculaire, une mise en perspective socio-historique cherche à révéler les modalités par lesquelles la génétique a participé et participe encore aujourd'hui aux enjeux sociaux et économiques qui ont accompagné ses développements. Les premières théories qui allaient mener à la biologie moléculaire contemporaine sont ainsi rapportées à leur contexte d'émergence, c'est-à-dire à l'âge d'or du capitalisme agraire caractéristique de la campagne anglaise de la fin du XVIIIe siècle, afin de révéler le rapport de ces dernières aux préoccupations qui animaient les cultivateurs de cette époque, notamment en ce qui a trait à l'élevage sélectif. De même, la biologie moléculaire contemporaine est rapportée à la dynamique inhérente au capitalisme avancé mis en place aux États-Unis depuis le début du XXe siècle afin de révéler les modalités par lesquelles elle participe à la présente appropriation des organismes vivants modifiés par le génie génétique. En procédant de manière synthétique, ce mémoire soutient que l'appropriation contemporaine des êtres vivants s'opère au carrefour d'une redéfinition radicale des rapports sociaux à la nature et d'une redéfinition toute aussi radicale des rapports sociaux d'appropriation. Le procès d'appropriation des êtres vivants par le biais du génie génétique est expliqué à partir de la convergence des modalités technoscientifiques d'appréhension du monde naturel et des modalités contemporaines d'appropriation des biens produits socialement désormais organisées autour de la propriété intellectuelle. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Vivant, Génétique, Génie génétique, Organismes génétiquement modifiés, Propriété intellectuelle, Capitalisme agraire, Capitalisme avancé.

Avec le développement récent des variétés végétales transgéniques, la mise au point et l'application d'approches adaptées à l'étude de leur innocuité apparaît importante. L'intégration de nouveaux caractères montrant un impact réel ou possible sur les caractéristiques de la plante modifiée, en particulier, rendent impératif la mise au point de stratégies à la fois exhaustives et efficaces pour une prise en compte correcte de leurs impacts éventuels sur la santé humaine. À titre d'exemple, des lignées de pomme de terre transgéniques exprimant un inhibiteur de protéases de type aspartate, l'inhibiteur CDI (pour Cathepsin D lnhibitor) de tomate, ont été développées dans notre laboratoire dans le double but de protéger la plante contre les insectes et de stabiliser les protéines recombinantes éventuellement exprimées dans ses tissus. Suite à des démonstrations diverses quant à leur efficacité (Brunelle et al., 2004, Rivard et al., 2006), il est apparu clair rapidement que l'expression du transgène cdi avait un impact marqué sur le métabolisme de la plante, avec des effets éventuels possibles sur les caractéristiques de ses tissus comestibles. Afin d'évaluer l'innocuité de ces lignées pour la santé humaine, une étude en plusieurs volets a été réalisée ici, basée sur les normes définies par les agences internationales de sécurité alimentaire. L'évaluation sanitaire des OGM repose en général sur un principe de base appelé équivalence en substance, qui consiste à comparer les teneurs en macronutriments, en micronutriments et en composés anti-nutritionnels et toxiques dans les lignées transgéniques à l'étude et dans leur contrepartie conventionelle. Dans le cadre du présent projet, une analyse compositionnelle de base a été faite pour les composantes majeures, mineures et toxiques de tubercules produits à partir de lignées de pomme de terre CDI et de lignées témoins transgéniques et conventionnels. Toutes les composantes analysées n'ont montré aucune variation significative quant à leur teneur dans les lignées analysées (ANOVA; P < 0.05), à l'exception de variations mineures pour le magnésium. Afin d'obtenir une image plus générale (ou "holistique") et pour augmenter les chances de détecter d'éventuels effets pléiotropiques suite à l'insertion du transgene cdi dans le génome de plante, une analyse protéomique basée sur l'électrophorèse bidimensionnelle (2-DE) a été réalisée pour le suivi comparatif de nombreuses protéines en simultané. Les données obtenues indiquent que les pommes de terre CDI étaient équivalentes aux pommes de terre conventionnelles obtenues de la lignée-mère, exception faite de la protéine recombinante CDI. Etant donné les liens de parenté entre l'inhibiteur CDI et un ensemble de protéines potentiellement allergènes retrouvés naturellement dans les tubercules, il convenait ensuite d'effectuer une évaluation spécifique des risques d'allergénicité associés aux tubercules modifiés. L'évaluation du potentiel allergène des OGM, effectuée généralement selon des normes établies par l'OMS et la FAO, tient compte de l'origine du transgène inséré, de l'homologie de séquence entre la protéine recombinante et les protéines connues comme étant allergènes, des phénomènes de réactivité croisée avec des allergènes connus, des propriétés physico-chimiques de la même protéine et de son immunogénicité potentielle évaluée in vivo dans des modèles animaux. In silico, l'inbiteur CDI de tomate s'est avéré partager un haut degré de similarité avec son équivalent structural de la pomme de terre, et avec d'autres protéines de type Kunitz de la pomme de terre reconnues comme étant allergènes. Ces données nous suggéraient alors d'évaluer plus à fond le comportement de ces différentes protéines dans les différentes lignées testées. Des tests de digestibilité in vitro ont d'abord été réalisés pour étudier la stabilité relative de ces différentes protéines en conditions de pH extrêmes et en présence de protéases de type pepsique et pancréatique. En bref, nous avons observé que les protéines de type Kunitz dans le tubercule cru étaient résistantes à l'hydrolyse pepsique et pancréatique sur une période d'au moins 60 min. Tenant compte des procédés de transformation auxquels la pomme de terre est généralement soumise, des pommes de terre cuites dans l'eau, des pommes de terre cuites au four à micro-ondes et des frites ont été préparées pour estimer la stabilité des protéines endogènes à la chaleur. Toutes les protéines de type Kunitz se sont avérées relativement stables mais néanmoins digérées complètement et en quelques minutes (par les protéases) après un traitement à 100 °C pendant 5 min, ce qui suggère que la protéine CDI et ses homologues de type Kunitz pourraient montrer un potentiel allergène à l'état cru, mais pas après cuisson. Afin de compléter cette évaluation des lignées CDI, des splénocytes isolés de la rate de souris BALB/c naïves ont été mis en culture pour déterminer leur taux de prolifération in vitro et leur profil en cytokines en réponse aux protéines de pomme de terre. Les résultats ont montré une prolifération élevée pour les protéines natives (non dénaturées), en comparaison à celles traitées à la pepsine ou à la chaleur. Une induction plus élevée de l'interféron gamma (IFN-y), au détriment de l'interleukine-4 (IL-4), a aussi été notée. Un autre groupe de souris BALB/c a été administrée oralement des protéines solubles de la plante afin de distinguer 1' immunogénicité des protéines de leurs effets allergènes. Il a été démontré, en bref, que les protéines de pomme de terre sont immunogènes plutôt qu'allergènes chez les souris. Étant donné que la protéine CDI montre une homologie de 30% avec l'inihibeur de trypsine de soya SBTI et que les deux protéines appartiennent à la même famille, la famille Kunitz, un test complémentaire avec le sérum de patients humains allergiques au soya a finalement été réalisé in vitro. En résumé, aucune activité croisée n'a été démontrée, nous suggérant à nouveau que les pommes de terre CDI étudiées dans cette étude n'étaient pas plus (ou moins) allergènes que leur équivalents conventionnels analysés en parallèle. L'ensemble de données obtenues dans le cadre de ce projet suggèrent, en somme, que les tubercules issus de lignées CDI sont équivalents aux tubercules conventionels correspondants, et que le transgène cdi exprimé dans les lignées modifiées n'est à l'origine d'aucun effet immunogène ou allergène particulier à l'inverse des effets parfois observables pour les protéines endogènes de même famille retrouvées dans le tubercule.

Les réticences de la société à l'égard de l'utilisation pharmaceutique de protéines purifiées à partir de sources potentiellement porteuses d'agents pathogènes ont contribué à l'émergence d'une nouvelle approche pour l'expression hétérologue des protéines, baptisée "moléculture végétale" (de l'anglais : molecular farming). Prometteuse à plusieurs égards, cette nouvelle discipline a attiré l'attention de plusieurs équipes de recherche en biotechnologie végétale, qui se sont aussi penchées, depuis quelques années, sur les limites associées à cette approche. En dépit des avantages évidents associés à la production des protéines recombinantes dans les tissus végétaux, l'activité biologique de la protéine recombinante et les mécanismes de protection endogène de la cellule hôte contre les protéines étrangères [la reconnaissance du non-soi] constituent, notamment, des contraintes souvent importantes pour la production efficace de protéines in planta. L'expression de certaines protéines recombinantes chez les plantes pourrait par exemple, en théorie, interrompre des interactions protéine-protéine spécifiques ou créer des réactions métaboliques indésirables en altérant des processus biochimiques ou des sentiers métaboliques essentiels au bon fonctionnement de la cellule hôte. Dans le but de mieux comprendre l'impact de l'expression des protéines recombinantes chez les plantes, le présent projet visait à étudier l'effet de la compartimentation cellulaire sur l'intégrité structurale et l'activité biologique in planta d'un inhibiteur de protéases à large spectre d'action, l'aprotinine bovine, exprimé chez la pomme de terre, Solanwn tuberosum L. Des lignées de pomme de terre accumulant l'aprotinine dans trois compartiments cellulaires - le cytosol, le réticulum endoplasmique (RE) et le milieu extracellulaire - ont d'abord été développées, après quoi le niveau d'expression du transgène et le taux d'accumulation de la protéine ont été déterminés par des procédures courantes de PCR en temps réel et d'immunodétection sur membrane solide. Une nouvelle technique pour la détection, la quantification et la caractérisation des protéines a ensuite été développée pour l'étude de la protéine recombinante exprimée, basée sur l'emploi conjoint de biopuces à protéines et d'un spectromètre de masse, le système SELDI-TOF/MS. Afin de cerner l'impact métabolique possible de la protéine recombinante sur la plante hôte, des analyses protéomiques basées sur l'électrophorèse bidimensionnelle, l'analyse d'images et la spectrométrie de masse ont finalement été réalisées afin de détecter et d'identifier, le cas échéant, les composantes du protéome endogène éventuellement modulées dans la plante modifiée. La rapidité et la précision de l'approche de détection des protéines par SELDITOF/MS font de la nouvelle approche d'analyse une technique prometteuse dans le domaine de la moléculture, utile pour l'étude préliminaire rapide des formes protéiques accumulées. En bref, cette approche nous a permis de détecter trois formes tronquées d'aprotinine bovine chez les plantes dirigeant cette protéine dans le RE, démontrant que la stabilité des protéines recombinantes dans ce compartiment cellulaire n'est pas universelle, à l'inverse des théories courantes. Malgré l'absence d'effet notable de l'inhibiteur recombinant sur la croissance et la morphologie des clones produits, des analyses protéomiques- subséquentes ont révélé, par ailleurs, que plusieurs protéines montrant une teneur altérée chez ces clones étaient impliquées dans la synthèse et la maturation des protéines endogènes au niveau cellulaire, suggérant un effet d'interférence de l'aprotinine sur la synthèse protéique cellulaire et expliquant possiblement une baisse significative de la teneur en protéines foliaires totales observée chez les mêmes clones. En dépit d'un taux d'accumulation plus faible chez les clones accumulant l'inhibiteur dans le milieu extracellulaire, ce dernier compartiment s'est avéré mieux adapté à l'accumulation d'aprotinine, générant une protéine entière et non tronquée montrant peu d'effets sur le métabolisme générale de la plante hôte. Ces résultats, qui illustrent la complexité des interactions moléculaires et cellulaires pouvant survenir in planta entre une protéine recombinante et la plante hôte, mettent aussi en évidence l'importance d'études empiriques détaillées sur l'impact des signaux d'adressage ajoutés aux constructions génétiques développées à des fins de moléculture.

Le principal objectif des Projets «Génome Humain», qui de par leur ampleur s'avèrent les projets les plus ambitieux jamais entrepris dans le domaine de la biologie moléculaire, consiste à séquencer le génome humain. Les découvertes et connaissances engendrées par ces projets apporteront des éléments novateurs dans la lutte aux maladies génétiques et rendront possible notamment le dépistage systématique des maladies génétiques et, espère-t-on, leur prévention ainsi que leur guérison par thérapie génique. Cependant, les connaissances acquises et les techniques développées pourraient être récupérées et appliquées à des fins indésirables. Les Projets «Génome Humain», de par leur inextricable promiscuité avec la technique, représentent un modèle paradigmatique de la technoscience. Or, celle-ci entraîne actuellement des discours réducteurs en génétique sur la liberté humaine, et dans les pratiques, induit un rapport d'instrumentalisation qui remet en cause la dignité humaine.

Le champignon Pseudozyma flocculosa a été particulièrement étudié pour son activité de lutte biologique contre le blanc. Par génie génétique, une molécule à activité antifongique, la flocculosine, a été isolée et caractérisée. Suite à ces travaux, l'utilisation des champignons du genre Pseudozyma pour la production de protéines recombinantes a présenté un nouvel axe de recherche. Toutefois, la variété des outils moléculaires disponibles pour l'étude des Pseudozyma spp. est limitée aux séquences régulatrices (promoteur, terminateur) du gène HSP70 d'un champignon voisin, Ustilago maydis. Les objectifs de notre recherche étaient donc les suivants : 1) obtenir des séquences promotrices de P. flocculosa; 2) comparer l'activité de ces séquences promotrices avec le promoteur HSP70; et 3) démontrer l'utilité de ces outils moléculaires dans le contexte d'une nouvelle approche d'étude de l'écologie de P. flocculosa. Dans un premier temps, un promoteur spécifique a été ciblé, soit le promoteur du gène d'actine car celui-ci est reconnu comme étant fort et constitutif chez d'autres champignons. En parallèle, un promoteur dont les transcrits étaient parmi les plus abondants dans des conditions de cultures déterminées a été identifié et cloné. Le gène codant pour la glycéraldéhyde 3-phosphate-déshydrogénase (GPD), une enzyme importante du métabolisme carboné de la cellule, a donc pu être cloné et séquencé. Nous avons ainsi obtenu 1133 pb de la séquence promotrice du gène d'actine et 1139 pb du gène GPD de P. flocculosa. Dans un deuxième temps, la comparaison de la force de ces deux promoteurs avec celle du promoteur HSP70 a permis d'établir que les promoteurs d'actine et de GPD présentaient une activité forte chez P. flocculosa et comparable à celle de HSP70 chez P. antarctica. Enfin, le développement d'une souche de P. flocculosa (Act4) exprimant de façon constitutive la GFP a permis son observation in situ pendant l'interaction tritrophique plante-agent pathogène-agent de lutte biologique. Il a ainsi été possible de montrer que P. flocculosa ne présentait pas de croissance remarquable en absence du blanc sur la feuille et ce, quelle que soit la plante-hôte utilisée. Néanmoins, en présence des structures du champignon pathogène, le développement de la souche Act4 était clairement stimulé.

Les organismes génétiquement modifiés (OGM) suscitent en Europe une intense controverse depuis le milieu des années nonante, qui s'est cristallisée sur les risques pour la santé et l'environnement. Cette thèse postule que les OGM nous posent des questions plus larges sur l'innovation. Est-il par exemple possible d'évaluer la pertinence d'innovations, comme celle des OGM, pour tendre vers une meilleure politique et gestion de l'innovation ? Une approche systémique a été développée pour progresser sur cette question. Elle poursuit trois axes: la compréhension de problèmes agronomiques, des stratégies actuelles pour les gérer et des possibilités d'innovations pour les résoudre à l'horizon 2015-2020. La partie empirique est basée sur des études de cas de couples problème/innovations dans deux filières agroalimentaires. Il s'agit de maladies problématiques en arboriculture fruitière (pommier) et en grandes cultures (froment d'hiver). Les données de quatre composantes sont intégrées : entretiens semi-dirigés, observation participante, revue de la littérature scientifique et analyse de la littérature grise des filières. La gestion de l'innovation dans les filières est caractérisée par une vision de l'innovation à géométrie variable et par des situations de verrouillage technologique (lock-in). Sur un plan conceptuel, on peut distinguer dans la recherche agronomique plusieurs voies d'innovations (trajectoires technologiques) qui poursuivent des logiques distinctes et sont influencées par les déterminants d'innovation. Sur le plan méthodologique, des améliorations des méthodes d'évaluation des innovations sont avancées. Enfin, plusieurs politiques d'innovation adaptées sont proposées (comparaison des choix technologiques, prospective par scénarios). Cette recherche aboutit à une réflexion sur les sciences agronomiques et à la mise en débat d'un nouveau champ disciplinaire : l'agronomie politique. Les propositions visent à ré-encastrer l'innovation dans les enjeux écologiques contemporains et dans les projets politiques et aspirations citoyennes.

Les nucléases programmables et site-spécifiques comme CRISPR-Cas9 sont des signes avant-coureurs d’une nouvelle révolution en génie génétique et portent en germe un espoir de modification radicale de la santé humaine. Le « multiplexing » ou la capacité d’introduire plusieurs modifications simultanées dans le génome sera particulièrement utile en recherche tant fondamentale qu’appliquée. Ce nouvel outil sera susceptible de sonder les fonctions physiopathologiques de circuits génétiques complexes et de développer de meilleures thérapies cellulaires ou traitements antiviraux. En repoussant les limites du génie génétique, il sera possible d’envisager la réécriture et la conception de génomes mammifères. Le développement de notre capacité à modifier profondément le génome pourrait permettre la création de cellules résistantes aux cancers, aux virus ou même au vieillissement ; le développement de cellules ou tissus transplantables compatibles entre donneurs et receveurs ; et pourrait même rendre possible la résurrection d’espèces animales éteintes. Dans ce projet de recherche doctoral, nous présentons l’état de l’art du génie génétique « multiplex », les limites actuelles et les perspectives d’améliorations. Nous tirons profit de ces connaissances ainsi que de l’abondance des éléments transposables de notre ADN afin de construire une plateforme d’optimisation et de développement de nouveaux outils de génie génétique qui autorisent l’édition génomique à grande échelle. Nous démontrons que ces technologies permettent la production de modifications à l’échelle du génome allant jusqu’à 3 ordres de grandeur supplémentaires que précédemment, ouvrant la voie au développement de la réécriture des génomes de mammifères. En outre, l’observation de la toxicité engendrée par la multitude de coupures double-brins dans le génome nous a amenés à développer un bio-interrupteur susceptible d’éviter les effets secondaires des thérapies cellulaires actuelles ou futures. Enfin, en conclusion, nous exposons les potentielles inquiétudes et menaces qu’apporte le domaine génie génétiques et apportons des pistes de réflexions pour diminuer les risques identifiés. / Programmable and site-specific nucleases such as CRISPR-Cas9 have started a genome editing revolution, holding hopes to transform human health. Multiplexing or the ability to simultaneously introduce many distinct modifications in the genome will be required for basic and applied research. It will help to probe the physio-pathological functions of complex genetic circuits and to develop improved cell therapies or anti-viral treatments. By pushing the boundaries of genome engineering, we may reach a point where writing whole mammalian genomes will be possible. Such a feat may lead to the generation of virus-, cancer- or aging- free cell lines, universal donor cell therapies or may even open the way to de-extinction. In this doctoral research project, I outline the current state-of-the-art of multiplexed genome editing, the current limits and where such technologies could be headed in the future. We leveraged this knowledge as well as the abundant transposable elements present in our DNA to build an optimization pipeline and develop a new set of tools that enable large-scale genome editing. We achieved a high level of genome modifications up to three orders of magnitude greater than previously recorded, therefore paving the way to mammalian genome writing. In addition, through the observation of the cytotoxicity generated by multiple double-strand breaks within the genome, we developed a bio-safety switch that could potentially prevent the adverse effects of current and future cell therapies. Finally, I lay out the potential concerns and threats that such an advance in genome editing technology may be bringing and point out possible solutions to mitigate the risks.