Le botulisme est une maladie nerveuse, commune à l’homme et aux animaux, due à l’action de la toxine botulique produite par Clostridium botulinum. Il existe 8 types de toxines dénommées A à H. Les bactéries capables de produire cette toxine se différencient en six groupe sur la base de leurs caractéristiques phénotypiques et biologiques. Les souches de C. botulinum responsables du botulisme humain appartiennent aux groupes I et II selon qu’elles soient protéolytiques ou non. Elles produisent les toxines A, B, E et F, ainsi que le nouveau type H récemment découvert. C. butyricum et C. baratii sont également capables de produire les toxines botuliques de type F et E et appartiennent au groupe V et VI. C. argentinense appartient au groupe IV et est capable de synthétiser la toxine de type G. Elle a été soupçonnée d’être impliquée dans des cas de botulisme infantile en Argentine. Les souches de C. botulinum responsables du botulisme animal appartiennent au groupe III (C. novyi sensu lato) et produisent les toxines C, D et leurs formes mosaïques C/D et D/C. La toxine botulique est le poison le plus puissant connu à ce jour. La dose létale nécessaire pour tuer une personne en bonne santé par intoxication alimentaire est de 70 µg seulement. C’est pourquoi cette toxine a fait l’objet d’études particulièrement approfondies, notamment celles impliquées dans des cas de botulisme humain. Elle peut également être utilisée pour le traitement de certaine pathologie ou la chirurgie esthétique (Botox). Malheureusement, elle peut également être utilisée à mauvais escient, en tant qu’arme de guerre ou à des fins de bioterrorisme. C’est pourquoi l’emploi de la toxine botulique ou de sa bactérie productrice fait l’objet d’une législation particulièrement stricte. Mon projet de doctorat s’est organisé autour de plusieurs projets de recherche visant à développer des méthodes de détection et de typage de du germe et de sa toxine (projets Européens BIOTRACER et AniBioThreat ; projets NRBC-bio ; LNR botulisme aviaire en France). Lors de mes recherches j’ai concentré mon travail sur le développement de méthodes capable de suivre et remonter à la source d’une contamination, qu’elle soit délibérée, accidentelle ou naturelle. Afin d’y parvenir j’ai investigué les gènes des flagellines de C. botulinum groupe I à III, responsables du botulisme humain et animal. L’analyse des gènes flaA et flaB a mis en évidence 5 groupes majeurs et 15 sous-groupes, certain étant spécifiques de régions géographiques. FlaB s’est montré spécifique de C. botulinum type E. Les gènes flagellines fliC, spécifiques à C. botulinum du groupe III, se divisent 5 groupes, avec fliC-I et fliC-IV associés aux types mosaïques C/D et D/C. J’ai étudié la prévalence des souches productrices de toxine de type mosaïques chez les volailles et les bovins. Les résultats montrent que les types C/D et D/C sont majoritaires en Europe. Enfin, j’ai séquencé 17 génomes provenant de souches responsables de botulisme animal en France (14 types C/D et 3 types D/C). Leur analyse montre que ces souches sont très proche génétiquement, entre elles et avec les souches Européennes. Grâce à ces données j’ai mis en évidence un large contenu extra chromosomique dans les souches C/D, qui peut être utilisé pour créer une carte d’identité génétique. D’autre part, l’étude des séquences Crisps à des fins de typage ne s’est pas avérée suffisamment résolutive, du fait de système Crispr-Cas déficient chez les souches C/D. Enfin, un très haut degré de discrimination a été atteint par typage SNP, qui a permis de distinguer jusqu’à l’origine de chaque souche. L’ensemble de ces résultats est développé dans le présent manuscrit / Clostridium botulinum is the etiologic agent of botulism, a deadly paralytic disease that can affects both human and animals. Different bacteria, producing neurotoxins type A to H, are responsible for the disease. They are separated into different groups (I to VI) on the basis of their phenotypical and biological characteristics. Human botulism is mainly due to Groups I and II producing neurotoxins A, B, E and F, with type H recently discovered. Also C. butyricum and C. baratii species (Groups V and VI), producing toxins type F and E respectively, are scarcely reported. C. argentinense Group IV, producing toxin type G, which has been suspected to be associated with infant botulism in Argentina. Animal botulism is mainly due to Group III, which is constituted by C. novyi sensu lato species. They produce toxin types C, D and their mosaic variants. Botulinum neurotoxins are the most powerful toxin known to date with as little as 70 µg enough to kill a person by food poisoning. Therefore, it received a great deal of attention. Botulinum neurotoxins have been deeply studied, especially human related toxins compared to animal. The toxins found to be useful for medical or cosmetic (Botox) treatments, but it was also used as a biological warfare agent, and for bioterrorism. Its extreme potency is equal to its dangerousness. Therefore, governments show concerns of its potential misuse as a bioterrorism weapon; research programs are funded to study and raise awareness about both the toxins and the producing organisms. My PhD work was structured by the different projects I was involved in, which were related to C. botulinum detection and typing, like BIOTRACER and AniBioThreat European projects, the French national CBRN program, or the NRL for avian botulism. The main transversal objective I followed lead me to develop new methods to trace back the origin of C. botulinum contamination, in case of a deliberate, accidental or naturally occurring botulism outbreak. I investigated flagellin genes as potential genetic targets for typing C. botulinum Group I-II and III, responsible for human and animal botulism respectively. Flagellin genes flaA and flaB showed the investigated C. botulinum Group I and II strains to cluster into 5 major groups and up to 15 subgroups, some being specific for certain geographical areas, and flaB being specific to C. botulinum type E. Flagellin fliC gene investigated in C. botulinum Group III showed to cluster into five groups, with fliC-I and fliC-IV associated to type C/D and D/C respectively, being not discriminative enough to differentiate highly genetically related strains. I also studied the prevalence of mosaic toxin genes in C. botulinum Group III in animal botulism, mainly in poultry and bovine. The results brought out the mosaic toxin types C/D and D/C to be predominant in the samples investigated throughout Europe. Finally, I explored the full genome sequences of 14 types C/D and 3 types D/C C. botulinum Group III strains, mainly originating from French avian and bovine botulism outbreaks. Analyses of their genome sequences showed them to be closely related to other European strains from Group III. While studying their genetic content, I was able to point out that the extrachromosomal elements of strains type C/D could be used to generate a genetic ID card. Investigation of Crispr typing method showed to be irrelevant for type C/D, due to a deficient Crispr-Cas mechanism, but deserve more investigation for type D/C. The highest level of discrimination was achieved while using SNP core phylogeny, which allowed distinguishing up to the strain level. Here are the results I’m going to develop in this manuscript

Les phénomènes évolutifs qui perturbent l’organisation des gènes dans les génomes eucaryotes sont de deux types : les changements dans l’ordre des gènes, ou réarrangements, et les modifications du contenu en gènes du génome, par duplications, délétions ou gains de gènes. Ces processus sont mal connus, tant au niveau de leurs mécanismes d’apparition que de leur impact fonctionnel et sélectif. Ce travail de thèse s’articule autour de deux projets. Le premier s’intéresse à la distribution des points de cassure de réarrangements évolutifs entre un génome ancestral et ses descendants modernes. Cette distribution a été modélisée en fonction des caractéristiques locales du génome pour mettre en évidence quels facteurs influencent la probabilité de cassure. Nos résultats montrent que la distribution des cassures peut s’expliquer simplement comme une fonction de la longueur des espaces intergéniques, fonction qui est cependant non-linéaire contrairement aux attentes sous un régime aléatoire classique. La répartition des points de cassure dans les génomes semble principalement liée à des propriétés de structure, et n’est que peu soumise à des contraintes de sélection. Elle pourrait être liée à la structure chromatinienne du génome. Le second projet s’inscrit dans le cadre du séquençage du génome du poisson zèbre, et fournit un aperçu global de l’organisation de ce génome. Les génomes de poissons téléostéens sont anciennement dupliqués : l’analyse est axée sur les conséquences de cette duplication. Les résultats montrent que le génome du poisson zèbre présente une organisation assez typique d’un génome téléostéen. Les gènes retenus en deux copies après la duplication du génome appartiennent à des catégories fonctionnelles particulières, et sont biaisés vers des gènes déjà conservés après les duplications 1R et 2R ayant eu lieu au début de l’histoire des vertébrés. / Evolutionary processes disrupting the gene organisation in eukaryotic genomes belong to two categories: changes in the order of the genes, known as rearrangements, and changes in the content of the genome by gene duplications, deletions and gains. The mechanisms through which these events arise, and their functional and selective impact on genomes, are poorly understood. This thesis covers two different projects. Firstly, we investigated the distribution of rearrangement breakpoints between an ancestral genome and its modern descendants. This distribution was modelled according to local genomic characteristics to highlight factors influencing the breakage process. Our results show that the distribution of breakpoints can be simply explained as a function of intergenic spacers length, although in a non-linear fashion differing from classical random expectations. The repartition of breakpoints in genomes seems to be linked to structural properties, and is only marginally affected by selective constraints. It might in fact reflect local chromatin structure in the genome. The second project is part of the joint sequencing effort for the zebrafish genome, and provides an overview of the organisation of this genome. Teleost fish genomes are anciently duplicated: the analysis focuses on the consequences of this duplication. Results show that the zebrafish genome displays a typical teleost fish genome organisation. Genes retained in two copies after the whole genome duplication belong to specific functional categories, and are biased towards genes already conserved as duplicates after the 1R and 2R duplication events that have taken place early in vertebrate history.

L’édition du génome repose sur la création de cassures double brin à un endroit précis du génome à l’aide de nucléases artificielles (ZFN, TALEN, CRISPR/Cas9) et sur les différents systèmes de réparation que la cellule va mettre en place pour réparer ces dommages. Les deux systèmes de réparation principaux sont le NHEJ (Non Homologous End Joining) et la RH (Recombinaison Homologue). Le NHEJ consiste en une ligation directe des extrémités de la coupure pouvant induire de petites insertions ou délétions avant la ligation. Ces mutations, si elles sont introduites dans un exon, vont modifier le cadre de lecture et pouvoir inactiver le gène cible (Knock Out). La RH permet la réparation de la cassure en recopiant les informations présentes sur la chromatide soeur. Si un ADN exogène comportant des homologies avec la séquence à réparer est inséré avec les nucléases artificielles, la cellule peut le prendre comme matrice de réparation, il est ainsi possible d’insérer n’importe quelle mutation ou transgène de manière précise (Knock In). Ici, différentes stratégies ont été développées pour optimiser ces approches d’édition du génome. Le couplage du domaine Nter de la protéine CtIP à la nucléase Cas9 permet d’augmenter le taux d’insertion par homologie d’un transgène au site de coupure. Le couplage de l’exonucléase Trex2 à la nucléase Cas9 nickase permet quant à lui d’augmenter le taux de mutation après coupure. Ces nouvelles approches peuvent être largement utilisées et permettent de faciliter l’édition du génome. / Genome editing relies on the ability of artificial nucleases (TALEN or CRISPR/Cas9 system) to induce double strand break into a precise and unique sequence in a whole genome and on the different DNA repair system. The two major DNA repair systems are NHEJ (Non Homologous End Joining) and HR (Homologous Recombination). NHEJ consists on DNA end direct ligation. This system can lead to deletion or insertion at the cut site. These mutations, when induced in an exon, can induce reading frame change and gene inactivation (Knock out). HR consists on the use of sister chromatid to copy lost information in order to complete the double strand break. If an exogenous DNA with homologies with the targeted DNA is inserted with artificial nucleases, it can be used as a template and can permit to introduce any transgene at the cut site (Knock In). In this work, different strategies were used to optimize genome editing. By fusing Nter part of CtIP to Cas9, the KI rate of an exogenous DNA is increased and by fusing Trex2 exonuclease to Cas9, the mutation rate induced is also increased. These two approaches can be widely used to improve genome editing strategies.

Dans l’alimentation humaine, le blé joue un rôle capital du fait de sa valeur nutritive. Une hausse de la production de plus de 20 % sera nécessaire d’ici 2050 simplement pour garantir aux populations les standards actuels de consommation alimentaire. Prenant en compte les bouleversements climatiques créant des contraintes environnementales conséquentes, l’amélioration du rendement en blé sans perte de qualité devient un réel défi mondial. C’est dans ce contexte que s’inscrit ma thèse.La génomique translationnelle est une approche intégrative qui fait le lien entre Recherche Fondamentale et Appliquée, où les espèces modèles jouent le rôle de pivot pour étudier les espèces d’intérêt agronomique. J’ai mis en œuvre cette approche de recherche translationnelle pour étudier finement l’histoire évolutive, l’organisation et la régulation du génome du blé. Le blé est une espèce polyploïde qui a subi des duplications chromosomiques récentes (500 000 et 10 000 ans) et anciennes (<90 millions d’années). Mes travaux ont consisté à utiliser les espèces de céréales apparentées pour étudier l’impact de ces duplications sur la plasticité structurale et expressionnelle des copies de gènes dupliqués du blé moderne. Mes travaux ont montré que la polyploïdie chez le blé est suivie d’une diploïdisation. Cette diploïdisation est en cours chez le blé moderne ; elle consiste en l’accumulation de mutations, de perte de gènes ou de modification de l’expression des gènes dupliqués. Cette diploïdisation est non aléatoire ; elle génère des blocs chromosomiques dominants à forte stabilité et d’autres plus sensibles, à forte plasticité. Au travers de l’analyse du génome du blé, la polyploïdie apparaît comme une force majeure de l’évolution, voire de l’adaptation, en permettant la spécialisation structurale et fonctionnelle des gènes surnuméraires. Cette asymétrie de plasticité structurale et expressionnelle post-polyploïdie entraine in fine la diploïdisation des phénotypes. Mes travaux de thèse l’illustre au travers de l’analyse des bases génétiques de l’inhibition du tallage, contrôlée par une insertion de 109bp codant pour un microRNA porté uniquement par la région chromosomique 1A, dite sensible. Mes travaux montrent une quasi-complète diploïdisation structurale, expressionnelle et phénotypique du blé tendre moderne ouvrant la question d’une re-définition du concept « d’espèces polyploïdes » au regard des analyses génomiques qui peuvent être conduites aujourd’hui, comme cette thèse en est une illustration. / Wheat plays a key role in Human food due to its nutritional value. Wheat production needs to be increased by more than 20% by 2050 to guarantee current human consumption standards. Taking into account climatic changes with high level of environmental constraints, yield improvement without quality loss became a big challenge. This consists in the economical and societal context of the current doctoral thesis.The integrative translational genomic approach consists in transferring fundamental knowledge gained from model species to applied practices for breeding in crops. This strategy was used here to study the evolutionary history, the organization and the regulation of the modern bread wheat genome. Modern wheat is a polypoid species deriving from two hybridization events between diploid progenitors 500 000 and 10 000 years ago, as well as a more ancient that dated back to more than 90 million years ago. The current research consisted in using cereal species closely related to wheat to study the impact of these duplications on the structural and expression plasticity of duplicated genes in wheat.My results established that the diploidization process is in progress in wheat after the successive rounds of polyploidization events. This diploidization consists in the accumulation of mutations, gene loss or expression modification between duplicated genes. This diploidization is nonrandom at the genome level; generating dominant chromosomic regions with high stability in contrast to others regions more sensitive with high plasticity. Based on such wheat genome evolutionary analysis, polyploidy appears as a major evolutionary force driving plant adaptation through structural and expressional specialization of duplicated genes.Such post-polyploidy genomic asymmetry drives finally the phenotype diploidization as illustrated in the current research with the study of genetic basis of the tiller inhibition Trait. This trait seems to be driven by a 109 pb insertion coding for a microRNA located solely on the chromosome 1A, known as a sensitive genomic fraction.The current research established that the modern bread wheat has been quasi-entirely diploidized at the structural, expressional and phenotypic levels, now requiring a new definition of the polypoid concept in line with current genomic investigations, as illustrated in the current thesis.

Wolbachia est une bactérie endosymbiotique, intracellulaire et exclusivement transmise maternellement qui infecterait au moins 106 espèces d'insectes. Wolbachia manipule fréquemment la reproduction de ses hôte à son avantage, notamment en induisant une forme de stérilité conditionnelle appelée incompatibilité cytoplasmique (IC). Chez les moustiques du complexe Culex pipiens, une grande diversité de souches de Wolbachia et de types d'IC a été précédemment identifiée, mais plusieurs aspects de la biologie de cette association restaient peu connus. Les travaux présentés dans cette thèse ont notamment permis de caractériser (i) l'impact de Wolbachia sur la structuration génétique des populations hôtes et (ii) la diversité des souches de Wolbachia et, plus précisément d'appréhender le mécanisme de l'IC. Par un suivi de populations naturelles, nous avons mis en évidence que Wolbachia induisait une forte structuration de la diversité mitochondriale, mais aussi qu'elle participait à des événements répétés d'introgression cytoplasmique entre les différents membres du complexe Cx. pipiens. Nous avons également mené une étude de génomique comparative basée sur le séquençage de quatre génomes complets de Wolbachia très proches phylogénétiquement. Pour cela, nous avons mis en place une série d'analyses approfondies utilisant un large panel d'outils bioinformatiques couplés à des vérifications moléculaires. Nous avons montré qu'il existait peu de polymorphisme entre les groupes de Wolbachia infectant Cx. pipiens. De plus, ces études nous ont permis de mettre en évidence des gènes candidats qui pourraient être directement impliqués dans le mécanisme de l'IC. / Wolbachia is an intracellular bacterial symbiont, exclusively maternally inherited, infecting at least 106 species of insects. Wolbachia commonly manipulates insect reproduction to its own advantage, as well illustrated by a phenomenon of conditional sterility called cytoplasmic incompatibility (CI). In mosquitoes of Culex pipiens complex, a great diversity of Wolbachia strains and of CI types was previously identified, but several aspects of the biology of this symbiotic association remained unknown. The aim of the studies presented in this thesis is to characterize (i) the impact of Wolbachia on the host genetic structure and (ii) the Wolbachia strains diversity in order to attempt an identification of CI molecular basis. By a survey of natural populations, we highlighted that Wolbachia deeply impacts the population structure of mitochondrial diversity, but is also associated with repeated events of cytoplasmic introgression between members of complex Cx. pipiens. We also conducted a study of comparative genomics based on the sequencing of four complete genomes of very closely related Wolbachia strains. For that purpose, we performed a series of analyses using a wide panel of bioinformatic tools coupled with molecular validations. We showed a low polymorphism between two groups of Wolbachia infecting Cx. pipiens. These studies also allowed us to highlight promising candidate genes which could be directly involved in the CI mechanism.

Durant les millions d'années qu'ont duré leurs évolutions, les génomes ont subi de nombreux réarrangements chromosomiques. Les plus fréquents sont les inversions, les translocations réciproques, les fissions et les fusions de chromosomes. Pour étudier ces évènements nous avons premièrement développé une méthode, Phyldiag, qui, à partir de l'ordre des gènes dans les génomes modernes, identifie les segments de chromosomes qui ont été conservés sans être cassé par les réarrangements. Dans un deuxième temps nous avons développé Magsimus, un simulateur réaliste qui fait évoluer in silico un génome ancestral artificiel en lui faisant subir des réarrangements chromosomiques ainsi que des évènements géniques : des duplications, des naissances de novo et des délétions de gènes. Avec ce simulateur nous avons tenté de reproduire des évolutions équivalentes à l'évolution réelle qui, à partir d'un ancêtre commun vivant il y a environ 325 million d'années, a abouti à l'humain, la souris, le chien, l'opossum et le poulet. Nous avons utilisé les segments conservés entre les espèces réelles pour calculer une première estimation des nombres de réarrangements le long des branches de l'arbre des espèces. En comparant les génomes modernes simulés aux génomes modernes réels nous avons quantifié le réalisme de ce paramétrage initial puis nous l'avons affiné par une procédure d'optimisation, ce qui nous a simultanément permis d'estimer une distribution des tailles des inversions. Enfin nous montrons avec un exemple simple qu'il sera nécessaire de forcer la réutilisation de points de cassures pour améliorer le simulateur. / In the course of evolution genomes have been restructured by massive chromosomal rearrangements. The most common rearrangements are inversions, reciprocal translocations, fissions and fusions of chromosomes. To study these events we first developed a tool, PhylDiag, that uses the conservation of gene order in extant genomes to uncover chromosomal segments that remained unbroken from rearrangements. This tool deals with gene duplications, clusters of duplications, annotation errors, segmental duplications and is able to identify small segments, even those that contain a unique gene. Subsequently, we developed Magsimus, a realistic simulator that evolves in silico an artificial genome through chromosomal rearrangements and genic events -- gene duplications, de novo gene births and gene deletions. With this simulator we made an attempt to reproduce evolutions analogous to the real evolution that happened from a common ancestor, that lived 325 million years ago, to the human, the mouse, the dog, the opossum and the chicken. Conserved segments between these species were used to infer a first estimation of the number of rearrangements that occurred along the branches of the species tree. The realism of this initial parameterisation has been quantified by comparing our simulated extant genomes to the real ones. We then used an optimisation process to correct our estimation while we also estimated the shape of a probabilistic distribution of the lengths of inverted segments. At last, with a simple example, we describe why it will be necessary to enforce breakpoints reuses if we want to improve our simulator.

Geotrichum candidum est une levure hémiascomycète ubiquitaire longtemps considérée comme un champignon filamenteux. C’est l’une des levures les plus fréquemment trouvées dans les fromages dans les quelles elle contribue à l’affinage. Dans le cadre du projet ANR ALIA Food Microbiomes en partenariat avec des industriels fromagers et producteur de levain, nous avons caractérisé l’espèce G. candidum par une étude phylogénétique et placé de manière non ambigüe G. candidum parmi les levures hémiascomètes. Une analyse MLST a permis de séparer les souches étudiées en deux groupes. Le premier contient essentiellement des souches environnementales tandis que le second ne contient que des souches isolé du fromage. Cela suggère une certaine sélection ou spécialisation d’un groupe de souche dans la fabrication du fromage. Une méthode de typage inter LTR plus discriminante a permis de typer l’ensemble des souches et peut fournir aux industriels un outil robuste pour le suivi d’une souche en production. Le génome de G. candidum CLIB 918 = ATCC 204307 a été séquencé. Les premières analyses ont mis en évidence des discontinuités évolutives parmi les gènes qui le composent. Parmi les 6802 gènes identifiés, 315 gènes présentent des orthologues chez les champignons filamenteux et non chez les levures. Cela suggère que durant l’évolution, G. candidum a conservé un grand nombre de gènes qui a été perdu chez les autres levures ou en a reçu certain par transfert horizontal de gènes. L’existence de ce même type de gènes chez d’autres levures ayant une position basale dans l’arbre des hémiascomycètes, suggère que G. candidum et ces levures ont une position intermédiaire lors de la transition évolutive champignon vers levure. Il est à noter que certains d’entre eux sont impliqués dans le métabolisme et pourraient jouer un rôle dans l’adaptation de cette levure à la fabrication du fromage. / Geotrichum candidum is a hemiascomycetous yeast frequently found in the environment and foodstuffs. It is one of the main yeasts in cheese and it is widely used as adjunct culture in the maturation of cheese. Within ANR project ALIA Food Microbiomes in partnership with industry, we characterized the species the species G. candidum by a multigene phylogenetic study. MLST analysis allowed us to separate the studied strains into two groups. The first contains mainly environmental strains while the second contains only strains isolated from cheese. This suggests a specialization or a selection of a group of strains within industry. We developed a typing method by inter LTR profiles, which can provide a robust tool for an industrial monitoring of strains. The genome of G. candidum CLIB 918 = ATCC 204307 was sequenced. Preliminary analyses revealed evolutionary discontinuities among genes. 6802 genes where identified in which 315 genes have orthologs in filamentous fungi and not in yeast. This suggests that during evolution, G. candidum has retained a large number of genes which have been lost in other yeasts or has received some by horizontal gene transfer. The existence of this other yeasts also having a basal position in hemiascomycetous tree suggests that G. candidum and these other yeasts have an intermediate position during the evolutionary transition fungus to yeast. It is noteworthy that some of them are involved in the metabolism and may play a role in the adaptation of the yeast to the cheese environment.

Chez les eucaryotes, le génome est organisé en chromatine, une structure nucléoprotéique essentielle pour la régulation de l’expression génique ainsi que pour le maintien de la stabilité du génome. Les ciliés sont d’excellents organismes modèles pour étudier les mécanismes généraux qui maintiennent l’intégrité du génomes eucaryote. Chez Paramecium tetraurelia, la différentiation du génome somatique à partir du génome germinal est caractérisée par des événements massifs et reproductibles d’élimination d’ADN. D’une part, des éléments répétés (transposons,régions minisatellites), de plusieurs kilobases de long, sont imprécisément éliminés.D’autre part, 45000 séquences courtes et uniques, appelées IES, sont précisément éliminées au nucléotide près. Une classe de petits ARN, appelé scnRNAs, est impliquée dans la régulation epigénétique de l’élimination d’ADN, mais comment les scnRNA contrôlent l’élimination d’ADN reste mystérieux. Nous avons testé l’hypothèse selon laquelle une organisation particulière de la chromatine, en particulier des modifications post-traductionelles des histones associées à des formes répressives de la chromatine, est impliquée dans le processus d’élimination d’ADN. Nous avons montré que la triméthylation de l’histone H3 sur la lysine 9 et la lysine 27 (H3K9me3 et H3K27me3)apparaît transitoirement dans le noyau somatique en développement au moment où se produisent les événements d’élimination d’ADN. Nous avons identifié la protéine de type Polycomb, Ezl1, et montré qu’elle est une histone methyltransferase qui présente une dualité de substrat et catalyse à la fois la mise en place de K9me3 et K27me3 sur l’histone H3. Nous avons montré que la déposition de H3K9me3 et H3K27me3 dans le noyau en développement requiert les scnRNAs. Des analyses de séquençage haut débit ont montré que Ezl1 est requise pour l’élimination des longues séquences répétées germinales, suggérant que les scnRNA guident la déposition des marques d’histones au niveau de ces séquences. Au contraire des régions répétées du génome, les IES montrent une sensibilité différente aux scnRNAs et à Ezl1, suggérant que plusieurs voies partiellement chevauchantes sont impliquées dans leur élimination. Notre étude montre que des caractéristiques intrinsèques des séquences d’ADN, telles que leur taille, peut contribuer à la définition des séquences germinales à éliminer. De manière intéressante, nous avons aussi montré que Ezl1 est requise pour la répression transcriptionnelle des éléments transposables. Nous suggérons que les voies H3K9me3et H3K27me3 coopèrent et contribuent à préserver le génome somatique de Paramecium des parasites génomiques. / Eukaryotic genomes are organized into chromatin, a complex nucleoprotein structureessential for the regulation of gene expression and for maintaining genome stability.Ciliates provide excellent model organisms with which to gain better understandinginto the regulation of genome stability in eukaryotes. In the ciliate Parameciumtetraurelia, differentiation of the somatic genome from the germline genome ischaracterized by massive and reproducible programmed DNA elimination events. Longregions of several kilobases in length, containing repeated sequences and transposableelements are imprecisely eliminated, whereas 45,000 short, dispersed, single-copyInternal Eliminated Sequences (IESs) are precisely excised at the nucleotide level. Aspecific class of small RNAs, called scnRNAs, is involved in the epigenetic regulation ofDNA deletion. How scnRNAs may guide DNA elimination in Paramecium remains tobe discovered. Here, we investigated whether chromatin structure, in particular histonepost-translational modifications known to be associated with repressive chromatin,might control DNA elimination. We showed that trimethylated lysine 9 and 27 onhistone H3 (H3K9me3 and H3K27me3) appear in the developing somaticmacronucleus when DNA elimination occurs. We identified the Polycomb-groupprotein, Ezl1, and showed that it is a dual histone methyltransferase that catalyzes bothH3K9me3 and H3K27me3 in vitro and in vivo. Genome-wide analyses show thatscnRNA-mediated H3K9me3 and H3K27me3 deposition is necessary for theelimination of long, repeated germline DNA. Conversely, single copy IESs displaydifferential sensitivity to depletion of scnRNAs and Ezl1, unveiling the existence ofpartially overlapping pathways in programmed DNA elimination. Our study revealsthat cis-acting determinants, such as DNA length, also contribute to the definition ofgermline sequences to delete. We further showed that Ezl1 is required fortranscriptional repression of transposable elements. We suggest that H3K9me3 andH3K27me3 pathways cooperate and contribute to safeguard the Paramecium somaticgenome against intragenomic parasites.

La plupart des virus sont connus pour leur capacité à causer des maladies symptomatiques chez l’Homme et chez les autres animaux. Certains d’entre eux sont des grands virus à ADN nommés Virus à Grand ADN Nucléo-Cytoplasmique (NCLDV), rapportés comme infectant les cellules eucaryotiques. Au début du XXI ème siècle, quatre familles ont été définies par Iyer et al. comme ayant une origine commune (groupe monophylétique) : Asfarviridae, Phycodnaviridae, Irido-Ascoviridae et Poxviridae.En 2003, la description d’Acanthamoeba polyphaga mimivirus a cassé un paradigme dans le monde des virus. Par leur taille de particule (450nm), par leur longueur de génomes(supérieure à 1Mb) et leur contenu génique, leur découverte a changé la définition traditionnelle des virus (Lwoff). Depuis 2013 et notamment par les isolements successifs de Pandoravirus,Pithovirus et Mollivirus, ces virus ont été décrits comme possédant de nouvelles propriétés.Leur découverte a été rendue possible grâce à la méthode de co-culture utilisant des protistes, notamment des cellules du genre Acanthamoeba. Cette méthode a été de nombreuses fois modulée par différentes équipes. Dans notre cas, nous avons combiné différentes stratégies appliquées à notre co-culture : la co-culture a été couplée à la cytométrie en flux pour détecter la lyse des protistes. De plus, la cytométrie a été utilisée avec un marqueur à ADN dans le but d’identifier de façon putative le virus et de discriminer les différentes populations virales. Enfin,nous sommes capables de séparer ces populations en utilisant un appareil FACS trieur.L’ensemble de ces techniques a permis l’isolement de nouveaux virus. / Most viruses are known for their ability to cause symptomatic diseases in humans andother animals. Some of them are large DNA viruses named Nucleo-cytoplasmic Large DNAviruses (NCLDV), known for infecting eukaryotic cells. At the beginning of the 21st centuryfour families were defined by Iyer et al. as having a common origin (monophyletic group):Asfarviridae, Phycodnaviridae, Irido-Ascoviridae and Poxviridae.In 2003, the description of Acanthamoeba polyphaga Mimivirus broke this paradigmin the virus world. Because of their particles size (450 nm), their genome size (up to 1Mb),and their gene contents, their discovery changed the traditional definition of viruses (Lwoff).Since 2013 and the successive isolations of Pandoravirus, Pithovirus and Mollivirus; theseviruses have been characterized as possessing various novel properties.Their discoveries have been possible thanks to the co-culture method using protistnotably Acanthamoeba genus cells. This method went through multiple improvements and isemployed by different teams in different ways. In our case and in order to enhance thismethod we combined strategies applied in our co-culture. Indeed, this method consists inusing flow cytometry to detect lysis of protist cells (after all steps of co-culture enrichment).In addition, the flow cytometry was used with a DNA marker in order to identity viruses anddiscriminate viral populations. Then, we were able, using a FACS sorter device, to separatedifferent viral populations from our supernatants.Altogether these techniques have permitted the isolation of new viruses.

Les éléments transposables (ET) ont un impact majeur sur le fonctionnement etla dynamique des génomes, à l’échelle de l’individu et de l’espèce. Le cilié Parameciumest un modèle original pour l’étude des ET. Chaque individu unicellulaire a un génomegerminal qui subit, lors des processus sexuels, des réarrangements massifs, comprenantl’élimination des ET et de leurs vestiges à copie unique, pour former un génome somatiqueoptimisé pour l’expression des gènes. La programmation épigénétique de cesréarrangements implique des petits ARN dans un processus complexe de soustractiongénomique.Au cours de ma thèse, j’ai effectué des analyses bioinformatiques et biostatistiques dedonnées hétérogènes à l’échelle du génome pour : (i) Identifier et analyser des propriétésintrinsèques, de dizaines de milliers de vestiges d’ET à copie unique, appelés "InternalEliminated Sequences" (IES). (ii) Comprendre le rôle de déterminants génétiques et dedifférents facteurs épigénétiques dans le ciblage et l’élimination des IES.L’ensemble de ces analyses met en lumière la co-Évolution des ET et des mécan-Ismes de défense de l’hôte. / Transposable elements (TE) have major impact on the function and dynamicsof genomes, both at the level of the individual and of the species. The ciliate Parameciumprovides an original model for studies of TE. Each individual unicell has a germlinegenome that undergoes massive rearrangements at each sexual generation including thephysical elimination of TE and their single copy remnants, yielding a somatic genomestreamlined for gene expression. The epigenetic programming of the rearrangementsinvolves small RNAs in a complex process of genomic subtraction.During my thesis, I carried out bioinformatic and biostatistical analyses of heteroge-Neous, genome-Scale datasets in order to : (i) Identifiy and study the intrinsic propertiesof tens of thousands of TE remnants know as "Internal Eliminated Sequences" (IES).(ii) Explore the roles of genetic determinants and epigenetic factors in the targeting andelimination of the IESs.Taken together, the studies illustrate the co-Evolution of TE and host defense mecha-Nisms.