L’immunité pré-existante dirigée contre la capside de l’AAV constitue l’un des obstacles majeurs à la sécurité et à l’efficacité du transfert de gène à l’aide de vecteurs AAVr. En particulier, les réponses cellulaires cytotoxiques dirigées contre l’AAV se sont trouvées être un défi à caractériser en raison de la faible fréquence des LT CD8+ circulants spécifiques de la capside, qui peuvent rarement être détectés par cytométrie de flux ou test ELISpot classiques. Ici, nous avons utilisé des tétramères de CMH classe I fluorescents en association avec un enrichissement magnétique pour détecter ex vivo des lymphocytes T CD8+ spécifiques de la capside dans des PBMCs humains. Pour la première fois, nous avons mis en évidence que tous les individus possèdent des LT CD8+ spécifiques de la capside, parmi lesquels on retrouve une sous-population de lymphocytes TEMRA mémoires effecteurs. Nous n’avons par ailleurs observé aucune corrélation entre les réponses ELISpot IFNγ et les fréquences ex vivo de LT CD8+ spécifiques de la capside, ce qui nous indique que ces fréquences ne sont pas prédictives de la fonctionnalité des cellules détectées. De manière intéressante, l’évaluation fonctionnelle de lignées primaires humaines de LT CD8+ spécifiques de la capside, amplifiées à partir de PBMCs après enrichissement par tétramères, a révélé qu’une dégranulation en réponse à des cellules cibles n’était pas systématiquement corrélée à la sécrétion de Perforin et Granzyme B. Les résultats de nos travaux encouragent le développement de nouvelles technologies associant haute sensibilité de détection et évaluation poly-fonctionnelle afin de prédire l’impact des réponses immunitaires cellulaires spécifiques de la capside de l’AAV lors des essais cliniques de thérapie génique. / Pre-existing immunity to AAV capsid constitutes one of the major hurdle to rAAV-based gene transfer's safety and efficiency in Humans. Particularly, anti-capsid cytotoxic cellular responses have proven to be a challenge to characterise because of the scarcity of circulating AAV-specific CD8+ T lymphocytes which can seldom be detected with conventional flow cytometry or ELISpot assays. Here, we used fluorescent MHC class I tetramers combined with magnetic enrichment to detect AAV-specific CD8+ T cells in human PBMCs ex vivo. For the first time, we evidenced that all individuals tested possessed a pool of AAV-specific CD8+ Tcells that displayed a TEMRA memory subset. Importantly, we observed no correlation between IFNγ ELISpot responses and ex vivo frequencies of AAV-specific CD8+ T cells, which indicates that frequencies of capsid-reactive T cells are not predictive of their functionality. Interestingly, functional assessment of primary AAV8- specific CD8+ T cell lines, expanded from PBMCs after tetramer enrichment, revealed that degranulation activity in response to target cells wasn’t systematically related to secretion of granzyme B and perforin. Our data encourage the development of new technologies combining accrued detection sensitivity and poly-functional assessment to predict the impact of capsid-specific cellular immune responses in rAAV-mediated clinical trials.