Submitted by ANA CLAUDIA SILVA BRAGA null (anabragga@gmail.com) on 2017-08-31T16:15:53Z No. of bitstreams: 1 Tese Doutorado Ana Claudia Silva Braga.pdf: 4552779 bytes, checksum: 456de4a6fbfd60347292d8755d6c8c47 (MD5) / Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-09-01T14:16:37Z (GMT) No. of bitstreams: 1 braga_acs_dr_sjrp.pdf: 4552779 bytes, checksum: 456de4a6fbfd60347292d8755d6c8c47 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-01T14:16:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 braga_acs_dr_sjrp.pdf: 4552779 bytes, checksum: 456de4a6fbfd60347292d8755d6c8c47 (MD5) Previous issue date: 2017-08-04 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O vírus da hepatite C (HCV) causa a doença da Hepatite C e estima-se que cerca de 3% da população mundial esteja infectada com o vírus. A infecção por HCV promove a alteração na expressão de várias proteínas celulares. Estudos têm demonstrado que muitas proteínas de choque térmico (HSPs) possuem um perfil de expressão alterado na presença do vírus e algumas HSPs interagem diretamente com proteínas do HCV. Assim, o presente estudo teve como objetivo avaliar in vitro os níveis de expressão de proteínas de choque térmico na presença e ausência de HCV. Com este propósito, células de hepatoma humano Huh7.5 e células Huh7.5 infectadas com o vírus (HCV JFH-1) foram submetidas à extração de RNA e síntese de cDNA. A expressão diferencial de 84 HSPs e chaperonas foi avaliada por qPCR Array. Os resultados demonstram que cinco genes apresentaram expressão aumentada (em Log2 2), enquanto outros cinco apresentaram expressão reduzida. Para validar estes resultados os 10 genes diferencialmente expressos foram testados por qPCR em três modelos celulares para o HCV: células contendo replicon subgenômico do HCV (SGR-JFH-1), células infectadas com JFH-1 (ambos do genótipo 2a) e células contendo o replicon subgenômico S52 (genótipo 3). O gene HSPB8 mostrou expressão aumentada nos três modelos testados, condizente com os resultados obtidos por qPCR Array. Em seguida, promovemos o silenciamento de HSPB8 e foi observado um aumento na replicação viral. Em contraste, quando aumentamos a expressão de HSPB8, o HCV teve uma diminuição na taxa de replicação. O mesmo procedimento foi adotado para o gene DNAJC5B, validado no modelo viral genótipo 3, e o HCV mostrou padrão de replicação semelhante ao observado para o gene anterior. Esses resultados sugerem que HSPB8 pode atuar como um fator intracelular contra a replicação do vírus da hepatite C e DNAJC5B apresenta a mesma função, mas específico para o genótipo 3. Também avaliamos interações diretas com proteínas do HCV e os resultados demonstraram uma interação física entre a proteína NS4B de HCV e HSPB8. Esses resultados podem contribuir para uma melhor compreensão dos mecanismos envolvidos na replicação do HCV. / Hepatitis C virus (HCV) causes Hepatitis C disease and it is estimated that about 3% of world population are infected with the virus. HCV infection promotes alteration in the expression of several cellular proteins. Studies have shown that many heat shock proteins (HSPs) have an altered expression profile in the presence of the virus and some HSPs interact directly with HCV proteins. Thus, the present study aimed to evaluate in vitro the expression levels of heat shock proteins in the presence and absence of HCV. With this purpose, human hepatoma Huh7.5 cells and Huh7.5 cells infected with the virus (HCV JFH-1) were subjected to RNA extraction and cDNA synthesis. The differential expression of 84 HSPs and chaperones was assessed by qPCR Array. The results demonstrate that five genes showed increased expression (over Log2 2), while five other presented reduced expression. To validate these results, the 10 differentially expressed genes were tested by real-time PCR in three different HCV cell culture models: subgenomic HCV replicon cells (SGR-JFH-1), JFH-1 infected cells (both genotype 2a) and subgenomic S52 cells (genotype 3). The HSPB8 gene showed increased expression in all of three tested models, consistent with qPCR Array results. Then we promoted the silencing of HSPB8 and observed an increase in viral replication. In contrast, when we increased an expression of HSPB8, HCV had a decrease in replication rate. The same procedure was adopted for the DNAJC5B, validated in the viral model genotype 3, and HCV showed replication pattern similar to that observed for the previous gene. These results suggest that HSPB8 may act as an intracellular factor against hepatitis C virus replication and DNAJC5B have the same function, but genotype 3 specific. We also evaluated direct interactions with HCV proteins and the results demonstrated a physical interaction between the HCV NS4B protein with HSPB8. These results can contribute for a better understanding of the mechanisms involved in HCV replication. / FAPESP: 2013/17253-9

Orientador: Fernando Sebastián Baldi Rey / Resumo: A compreensão de processos regulatórios e organização molecular dos organismos vivos progrediram consideravelmente na última década. As metodologias também evoluíram com o sequenciamento de DNA e RNA e de ferramentas genômicas permitindo a análise de centenas ou milhares de genes, proteínas ou metabólitos. O uso simultâneo dessas informações auxilia na obteção de informações relevantes sobre as variáveis que envolvem as variações fenotípicas de características de interesse. O objetivo do presente estudo foi integrar dados fenotípicos, genotípicos e transcriptômicos em busca de aprimoramento sobre os mecanismos genéticos e metabólicos que determinam o perfil de ácidos graxos na carne de bovinos Nelore, a fim de contribuir para o melhoramento da composição de ácidos graxos da carne. Foram utilizados machos da raça Nelore terminados em confinamento, abatidos com média de idade 24 meses. Amostras do músculo L. thoracis, entre a 12ª a 13ª costela foram coletadas para as análises de perfil de ácidos graxos, extração de RNA e de DNA. Os resultados foram apresentados nos capítulos 2 e 3. No capítulo 2, o objetivo foi identificar genes diferencialmente expressos pelo método RNA-seq e perfil de ácidos graxos no músculo L. thoracis com uso de componentes principais (principal components: PC). Foram selecionados dois grupos de 10 animais, os quais possuíam valores de PC1 e PC2 extremos (Alto x Baixo) para os grupos somatórios de ácidos graxos (AG): ácidos graxos saturados (AGS), ácidos g... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The understanding of regulatory processes and molecular organization of organisms has progressed considerably in the last 10 years.The methodologies also evolved with the sequencing of DNA, RNA and genomic tools allowing the analysis a lot of genes, proteins or metabolites. The simultaneous use of this information should help to obtain relevant information about the variables that result the phenotypic variations of traits of interest. The objective of the present study was to integrate phenotypic, genotypic and transcriptomic studies in order to clarify the genetic and metabolic mechanisms that determine the fatty acid profile in Nelore beef, in order to contribute to the improvement of the fatty acid composition of the meat. Nelore males were used in feedlot, coming from farms that integrate three breeding programs and slaughtered with an average of 24 months. Samples of the L. thoracis muscle between the 12th to 13th rib were collected for analysis of fatty acid profile, RNA and DNA extraction. The results were presented in chapters 2 and 3. In chapter 2, the objective was to identify genes differentially expressed by RNA-seq method and fatty acid profile in the L. thoracis muscle with the use of Principal Components (PC). Two groups of 10 animals were selected, which had PC1 and PC2 extreme values (High x Low) for the fatty acids (FA) groups: saturated fatty acids (SFA), monounsaturated fatty acids (MUFA), polyunsaturated fatty acids (PUFA), omega 3 (n-3) and omega 6 (n-6... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Nas últimas décadas observou-se um número crescente de relatos de infecções invasivas por Trichosporon em ambientes hospitalares, devido ao aumento da população suscetível e a melhoria dos métodos diagnósticos. Leveduras do gênero Trichosporon, depois de Candida, são as mais relacionadas à infecção fúngica invasiva em pacientes hematológicos, sendo Trichosporon asahii responsável por 90% dos casos. A identificação de espécies de Trichosporon é realizada através do sequenciamento da região IGS1 do DNA ribossomal, técnica considerada padrão-ouro. Através do estudo dos polimorfismos da região IGS1 do DNA ribossomal, diversos genótipos de T. asahii têm sido descritos, entretanto sem relação com a distribuição geográfica, perfil de suscetibilidade aos antifúngicos ou patogenicidade. O presente estudo teve como objetivo padronizar um método de análise por sequenciamento multilocus para a espécie T. asahii, definindo novos genes (loci) para melhor descrever a filogenia da espécie. Foram analisadas 21 cepas de T. asahii de diferentes origens (Brasil, Europa, Ásia) e genótipos (1,3,4,5,6,7). As sequências de genes estruturais (housekeeping genes) dos genomas de T. asahii (CBS2479 e CBS8904) disponíveis no GenBank foram alinhadas e analisadas in silico para o delineamento e avaliação dos novos primers. Após as reações de PCR e análise das sequências de DNA, quatro novos loci foram selecionados para a análise filogenética multilocus: phosphate carrier protein, topoisomerase 1 (TOP1), beta-1-tubulin, copper-exporting ATPase. As árvores filogenéticas demonstraram dois clados bem distintos, com altos valores de bootstraps. Além disso, os genótipos 1 e 3 foram alocados em clados diferentes. Nossos resultados sugerem uma reclassificação genética para a espécie T. asahii. Novos estudos, incluindo um maior número de cepas e outros marcadores genéticos, são necessários para melhor abordar a filogenia atual de T. asahii / In the last decades there has been a significant increase of the reported cases of invasive fungal infections by Trichosporon in hospital settings, related to the increase of the susceptible population and to the improvement of diagnostic methods. Trichosporon are the most frequent yeast related to invasive fungal infection in hematological patients after Candida, with Trichosporon asahii accounting for 90% of the cases. The gold standard method for Trichosporon species identification is the sequence analysis of the intergenic spacer region 1 (IGS1) from the ribosomal DNA. Based on the polymorphisms of the IGS region of ribosomal DNA, several T. asahii genotypes have been described, without relation with geographical distribution, antifungal susceptibility profile or pathogenicity. The objective of the study was to evaluate a multilocus sequencing method for the T. asahii species, defining new loci to better describe the phylogeny of the species. Twenty-one strains of T. asahii from different origins (Brazil, Europe, Asia) and genotypes (1,3,4,5,6,7) were analyzed. Housekeeping genes from T. asahii genomes (CBS2479 and CBS8904) available in GenBank were aligned and in silico analyses were carried out to design and evaluate the new primers. After PCR reactions and DNA sequence analysis, four new loci were selected for the multilocus plylogenetic analysis along with the IGS1 region from the rDNA: topoisomerase 1 (TOP1), phosphate carrier protein, beta-1-tubulin, copper-exporting ATPase. Phylogenetic trees revealed two well-distinct clades, with high bootstraps values. Moreover, IGS genotypes 1 and 3 strains were split into the different clades. Our results suggest a different genetic background for the species T. asahii. Further studies including more T. asahii strains and other genetic markers are necessary to better address the current phylogeny of T. asahii

Introdução: A nefrite lúpica (NL) é o maior preditor de morbidade e mortalidade em pacientes portadores de lupus eritematoso sistêmico. Recentes estudos mostram que a proteína quimiotática de monócitos (MCP-1) está implicada na ativação de células inflamatórias, afetando a progressão e a severidade da NL, e que a excreção urinária do MCP-1 (uMCP-1) está aumentada em pacientes com NL em atividade. Na literatura os dados sobre o polimorfismo do gene MCP-1 A(-2518)G e do seu receptor CCR2 V(-64)I sobre a susceptibilidade para nefrite lúpica ainda estão em discussão. Objetivos: Avaliar a associação entre o polimorfismo do gene MCP-1 e do seu receptor CCR2 em pacientes com NL e indivíduos saudáveis, além da associação de ambos os polimorfismos com parâmetros clínicos e histológicos nos pacientes portadores de NL. Além disso, avaliar a associação entre a excreção urinária do MCP-1 em pacientes portadores de nefrite lúpica em atividade com parâmetros clínicos e histológicos. Pacientes e Métodos: As genotipagens do MCP-1 e do CCR2 foram realizadas em 197 pacientes com nefrite lúpica através da extração do DNA genômico, seguido da técnica de reação em cadeia da polimerase, utilizando-se primers específicos. A dosagem urinária do MCP-1 foi realizada em 34 pacientes com nefrite lúpica em atividade através da técnica de ELISA. Resultados: Foram estudados 197 pacientes portadores de nefrite lúpica, do sexo feminino, com idade média de 28±9,8 anos, sendo 65,5% de etnia branca e 34,5% não-branca, acompanhados em nosso ambulatório durante o período de 69±37,1 meses. Como grupo controle, utilizou-se um grupo de 220 indivíduos saudáveis do sexo feminino, pareados de acordo com idade e etnia. Quanto à distribuição do genótipo do MCP-1, evidenciou-se que a freqüência do genótipo GG foi significativamente maior nos pacientes portadores de nefrite lúpica quando comparado ao grupo controle (12,7%x5,0%) (p=0,019), enquanto que o genótipo AA apresentou maior freqüência no grupo controle, porém sem significância estatística (48,7%x56,8%). Com relação aos alelos, a freqüência do alelo A foi significativamente maior no grupo controle (75,9%x68%) (p=0,007) quando comparada aos pacientes com NL. Já em relação ao polimorfismo do CCR2, não foi observada nenhuma diferença na freqüência do genótipo entre os dois grupos, porém foi observada maior freqüência do alelo V no grupo controle (89,8%x86,3%) (p=0,046). Não houve associação entre o genótipo e alelos do MCP-1 e do CCR2 com a função renal no início e no final do estudo, marcadores imunológicos, manifestações clínicas (SLEDAI) e a classe histológica. Porém, observou-se um predomínio significante dos flares moderado e grave nos pacientes portadores dos genótipos AA e AG (p< 0,05) em relação ao genótipo GG, enquanto que, em relação à distribuição alélica do MCP-1 e ao CCR2, não se notou diferença estatística. Não se evidenciou diferença estatística entre as curvas de sobrevida renal funcional dos pacientes portadores de nefrite lúpica e os genótipos do MCP-1 e CCR2 e seus respectivos alelos. Notou-se diferença estatística na variação da creatinina sérica ao longo do seguimento (p<0,001). Foram também estudados 34 pacientes portadores de nefrite lúpica em atividade, do sexo feminino, com idade média de 28,4 ± 9,9 anos, sendo 26,5% pacientes de etnia branca e 73,5% de etnia não-branca. A dosagem do MCP-1 urinário foi realizada no início do quadro e após 3 e 6 meses de seguimento. Em relação ao uMCP-1, houve um aumento significante do mesmo no início do quadro renal quando comparado com 3 e 6 meses de tratamento (p<0,05). Evidenciou-se um aumento do uMCP-1 nos pacientes que apresentavam creatinina plasmática inicial > 1,2mg/dl (p<0,05), porém não houve associação entre uMCP-1 e a creatinina após 6 meses de tratamento. Não se observou associação entre os níveis de uMCP-1 com as manifestações clínicas (SLEDAI), classe histológica e marcadores imunológicos, exceto quanto ao anticorpo antifosfolípide, pois houve excreção aumentada do uMCP-1 em pacientes com anticorpo antifosfolípide positivo no início do quadro (p<0,05). Notou-se valores elevados do uMCP-1 nos pacientes que apresentaram flares grave e moderado em relação ao flare leve (p<0,05). Quanto à distribuição genotípica do MCP-1 em relação ao uMCP-1, foi observado uma associação do uMCP-1 em pacientes portadores dos genótipos AG e AA quando comparados ao genótipo GG (p<0,05). Já em relação à distribuição genotípica e alélica do CCR2, não se notou nenhuma diferença na freqüência dos mesmos e a dosagem de uMCP-1. Conclusões: Houve uma significante associação do genótipo GG do polimorfismo do MCP-1 em pacientes portadoras de NL na população estudada, além de uma associação entre os níveis do uMCP-1 com a severidade do flare renal e a função renal nas pacientes portadoras de NL. / Introduction: Lupus Nephritis (LN) contributes substantially to morbidity and mortality in patients with systemic lupus erythematosus. Literature data show monocyte chemoattractant protein (MCP-1) is implicated in the activation of inflamatory cells and has been suggested to affect the progression and severity of lupus nephritis and urinary MCP-1 levels (uMCP-1) are increased in LN patients during active renal disease. Literature data about genotype polymorphism of MCP-1 A(-2518)G and of its receptor CCR2 V(-64)I and susceptibility to LN is still open to discussion. Objectives: The aim of our protocol was to study association of the genotype polymorphism of MCP-1 and CCR2 with LN compared to a healthy matched population and study association these polymorphisms with clinical and histological parameters in LN patients. Moreover, investigate the relationship of uMCP-1 on the onset, severity and resolution of LN flare. Patients and Methods: Genomic DNA was extracted from peripheral leukocytes from 197 LN patients and MCP-1 and CCR2 genomic variants were detected by polymerase chain reaction followed by restriction enzyme-fragment analysis. uMCP-1 levels were mesured by enzyme-linked immunosorbent assay from 34 LN flare patients. Results: One hundred and ninety seven (197) female patients with histological diagnosis de LN undergoing follow up in our institution and 220 ethnically matched healthy controls were enrolled in this study. Epidemiological characteristics of the LN group were: age 28±9.8 years, race 65.5% of caucasians and 34.5% of Brazilian afro-south-latins. Baseline values were collected at the onset of LN and final values in their last follow up (69±37.1 months). There was a significant association of the GG genotype polymorphism of MCP-1 with LN patients compared to controls (12.7%x5.0%) (p=0.019), while the allele A distribuition was associated with healthy controls (75.9%x68%) (p=0.007). Considering CCR2 -64 V/I polymorphism genotype there was a association of the allele V with the control group compared to LN (89.8%x86.3%) (p=0.046). Analyzing genotype polymorphism of MCP-1 and CCR2 there werent correlation with renal function, immunological markers, clinical manifestations (SLEDAI) or histological classes of LN. There was a significant association of the AA and AG genotypes polymorphism of MCP-1 with moderate and severe renal flares compared to GG genotype polymorphism of MCP-1 (p< 0.05). Kaplan-Meier analysis of the renal survival curves with respect to the studied genotypes did not show any influence in the progression of renal disease. There was a significant association of the creatinine onset and on follow up (p<0.001). Thrity four (34) female patients with criteria for active LN and histological diagnosis were enrolled and treated for six months. Each patient was evaluated once a month and uMCP-1 bimonthly. Epidemiological characteristics of the group showed: age 28.4±9.9 years and race 26.5% caucasians and 73.5% Brazilian afro-south-latins. uMCP-1 excretion at onset (T0) of LN was significantly increased when compared to uMCP-1 measured on the third (T3) and sixth months (T6) (p<0.05). Analyzing uMCP-1 values on T0 there was a correlation with creatinine (p<0,05), but not with, clinical manifestations histological classes of LN or immunological markers, except in patients with positive antiphospholipid autoantibodies demonstrated increased of uMCP-1 (p<0.05). Otherwise, uMCP-1 levels were associated with seriousness of nephritis flares, severe and moderate over mild (p<0.05). Considering MCP-1 polymorphism genotype there was association of the AA and AG genotypes with increased uMCP-1 in patients with active renal disease (p<0.05). Conclusions: There is a significant association of the GG genotype of MCP-1 -2518 A/G polymorphism with LN in our population. uMCP-1 levels in LN is associated with flare seriousness and renal function.

Em estudos multiambientais, o processo de recomendação de genótipos com maior produção e a determinação de genótipos estáveis são de suma importância para os melhoristas. Porém, quando ocorre falta de genótipo em um ou mais ambientes este processo passa a ter dificuldades. Pois, este procedimento depende de métodos estatísticos que necessitam de uma matriz de dados sem dados em falta. Desde 1976 diversos matemáticos e estatísticos estudam, continuamente, uma forma de lidar com dados em falta em dados multiambientais buscando obter um método que estime, de forma precisa, as unidades ausentes sem perda de informação. Desta forma, esta pesquisa propõe um novo método de imputação baseado na metodologia AMMI fazendo reamostragens Bootstrap Não-paramétrico na matriz de médias de interação genótipos e ambientes (G × E), o modelo de imputação AMMI Bootstrap Não-paramétrico (IAMMI-BNP). Para estudo de simulação foi considerado o conjunto de dados referente a procedência S. of Ravenshoe - Mt Pandanus - QLD (14.420) de Eucalyptus grandis coletada na Austrália em 1983. Com a finalidade de obter estimativas precisas dos valores em falta, foi considerado dois estudos de simulação. O primeiro considerou 2000 reamostragens no sentido linha da matriz de interação G × E considerando duas porcentagens de perda de dados (10% e 20 %). O segundo estudo de simulação, considerou 200 reamostragens na matriz de falta (10%) e três diferentes modelos de IAMMI-BNP: IAMMI0-BNP, que considera apenas os efeitos principais do modelo AMMI; IAMMI1-BNP e IAMMI2-BNP que considera um e dois eixos multiplicados do modelo AMMI, respectivamente. De forma geral, de acordo com os métodos de comparação o método de imputação proposto nos dois estudos de simulação forneceu valores imputados próximos dos originais. Considerando os estudos de simulação com 10% de perda, a eficiência do método de imputação proposto foi melhor quando se utilizou o modelo IAMMI2-BNP (com dois eixos multiplicativos). O teste das ordens assinaladas de Wilcoxon mostrou que os valores imputados não influenciaram na estimativa da média, indicando que valores médios dos dados imputados de cada ambiente foram estatisticamente semelhantes aos valores médios originais. / In multienvironment studies, the process of recommendation of genotypes with higher production and the determination of stable environments are of utmost importance for plant breeders. However, when there is missing of genotype in one or more environments this process show difficulties. Therefore, this procedure depends on statistical methods that complete data matrix requered. Since 1976 various mathematical and statistical study, continually, one way of dealing with the loss of information on data multienvironments, seeking to obtain a method that estimate, precisely, the missing units without loss of information. In this way, the purpose of this study is develop a new method of apportionment based on the methodology AMMI doing reamostragens bootstrap nonparametric in the array of means of genotype x environment interaction (GE). For the study of simulation was considered the data set concerning the origin of S. Mexico City - Mt Pandanus - QLD (14,420) of Eucalyptus grandis collected in Australia in 1983. It was performed two studies of simulation. The first performed 2000 resampling on the lines of the interaction matrix G X E, for two percentages of missing data (10% and 20%). The second simulation study considered 200 replicates in the missing data set (10 %) and three different models of IMAMMI-BNP: AMAMMI0-BNP, which considers only the main effects of the AMMI model; IAMMI1-BNP and IAMMI2-BNP which considers one and two axes multiplied by the AMMI model, respectively. In general, according to the comparison methods, the imputation method proposed in the two simulation studies provided imputed values similar to the originals. Considering the simulation studies with 10 % loss, the efficiency of the proposed imputation method was better when using the IAMMI2-BNP model (with two multiplicative axes). The Wilcoxon test of the orders showed that the values imputed had no influence on the mean estimate, indicating that mean values of the data imputed from each environment were statistically similar to the original mean values.

O cancro bacteriano, causado por Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Cmm), é uma das doenças mais importantes da cultura do tomate (Lycopersicon esculentum Mill.), especialmente para tomateiros estaqueados. O controle está fundamentado na adoção de um conjunto de medidas preventivas, pois poucas são as informações sobre materiais resistentes à doença e não existe um produto químico que a controle eficientemente. Os objetivos desta tese foram determinar um método de inoculação adequado à seleção de genótipos de tomateiro resistentes ao cancro bacteriano; avaliar a reação de genótipos de tomateiro à inoculação com Cmm; e avaliar o efeito de acibenzolar-S-metil e outros produtos fitossanitários no controle da doença. Para o ensaio de metodologia, foram avaliados quatro métodos de inoculação (aspersão de suspensão bacteriana na face inferior das folhas; aspersão, sob pressão, de suspensão bacteriana na face inferior das folhas; corte do sistema radicular, com tesoura, seguido de imersão na suspensão bacteriana; e ferimento na haste com alfinete entomológico transpassando uma gota de suspensão de inóculo depositada na axila foliar) e três concentrações de inóculo (108 ufc/mL, 107 ufc/mL e 106 ufc/mL). Posteriormente, foi avaliado o efeito da inoculação em plantas com diferentes idades, aos 7, 14, 21 e 28 dias após a emergência. Foram utilizados os genótipos Kadá e Rotam-4 e um isolado bacteriano proveniente de Bragança Paulista, SP. A avaliação foi realizada através de uma escala descritiva, atribuindo-se notas que foram convertidas em índice de murcha bacteriana. A inoculação de Cmm, quatorze dias após a emergência das plantas, através da aspersão de suspensão bacteriana (108 ufc/mL) na face inferior das folhas, com avaliação aos 30 dias após inoculação, foi a metodologia mais apropriada para a avaliar a reação de genótipos de tomateiro. Estabelecida a metodologia, foram avaliados dez genótipos comerciais de tomateiro (Carmen, Débora max, IPA-6, Santa Clara, Alambra, Júpiter, Olimpo, Fanny, Jumbo e Densus) para identificação de materiais resistentes ao cancro bacteriano, tendo-se Kadá e Rotam-4 como controles suscetível e resistente, respectivamente. Alambra e Jumbo apresentaram comportamento semelhante a Rotam-4, sendo materiais promissores para o plantio em áreas com histórico de ocorrência da doença. Para a avaliação de controle do cancro bacteriano foram testados os seguintes produtos: acibenzolar-S-metil (ASM), ASM + mancozeb, ASM + oxicloreto de cobre, mancozeb + oxicloreto de cobre, e oxitetraciclina. Três esquemas de aplicação dos produtos foram adotados: (E1) 4 aplicações (a primeira e a segunda realizadas seis e três dias antes da inoculação; a terceira e a quarta, aos três e seis dias após a inoculação); (E2) apenas as duas aplicações préinoculação; (E3) apenas as duas aplicações pós-inoculação. Esses produtos foram incorporados a meio de cultura para avaliação in vitro de seus efeitos sobre Cmm. Independente da forma de aplicação, o ASM, isolado ou em mistura com fungicidas, proporcionou reduções significativas na severidade da doença e não inibiu o desenvolvimento da bactéria in vitro. / Bacterial canker, caused by Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Cmm), is one of the most important diseases of tomato (Lycopersicon esculentum Mill.). Its control is based on a set of preventive measures, once there is a few information about resistant materials and the chemical control is not efficient. The objectives of this thesis were to determine a suitable inoculation methodology to bacterial canker resistance studies; to evaluate the reaction of commercial tomato genotypes to the inoculation with Cmm; and to evaluate the acibenzolar-S-methyl and other phytossanitary products effects on the control of that disease. To methodology trial, four inoculation methods were evaluated, including foliar pulverization with bacterial suspension; foliar pulverization under pressure with bacterial suspension; cutting of roots with scissor, followed by their immersion in bacterial suspension; and stem wounding with a pin passing over a drop of inoculum suspension deposited on the insertion point of leaf. Besides the inoculation methods, three inoculum concentrations were investigated: 108 cfu/mL; 107 cfu/mL and 106 cfu/mL. Later, it was evaluated the effect of inoculation on plants with different ages: 7, 14, 21 and 28 days after emergency. To those trials, genotypes Kadá and Rotam-4, and a bacterial isolate from Bragança Paulista, SP, were employed. The evaluation was accomplished through a descriptive scale, being attributed notes that were turned into bacterial wilt index. Inoculation of Cmm, fourteen days after emergency of plants, through aspersion with bacterial suspension (108 cfu/mL) over the inferior face of leaves, and evaluation 30 days after inoculation, was the most appropriated methodology to evaluate resistance to bacterial canker in tomato genotypes. After the establishment of the inoculation methodology, ten commercial tomato genotypes (Carmen, Débora max, IPA-6, Santa Clara, Alambra, Jupiter, Olimpo, Fanny, Jumbo and Densus) were investigated to identify resistant materials to the bacterial canker. Kadá and Rotam-4 were employed as susceptible and resistant controls, respectively. Alambra and Jumbo had a similar behavior to Rotam-4, being the most promising materials for the planting in areas with report of occurrence of bacterial canker. To evaluate the bacterial canker control following products were tested: acibenzolar-S-methyl (ASM), ASM + mancozeb, ASM + copper oxicloride, mancozeb + copper oxicloride, and oxytetracycline. Three schemes of application of the products were adopted: (E1) 4 applications (first and second ones were accomplished six and three days before inoculation; third and fourth ones, three and six days after inoculation); (E2) two applications before inoculation only; (E3) two applications after inoculation only. The effect in vitro of these products on Cmm was also evaluated. ASM, isolated or in mixture with fungicides, provided significant reductions in the disease severity independent of the scheme of application and had no effect on bacterial development in vitro.

A relação entre os diferentes genótipos do VJC e a patogênese da LEMP permanece ainda uma questão controversa. O presente estudo visou a caracterização genotipica do vírus JC (VJC) e sua associação com a leucoencefalopatia multifocal progressiva (LEMP) em pacientes com aids em São Paulo, no período de 2000 a 2008. Foram avaliadas 51 amostras de líquor de pacientes com LEMP e 47 amostras de pacientes com aids sem LEMP positivas para os genes T e VP1 pela reação em cadeia por polimerase (PCR). Foram identificados, através do sequenciamento genômico os genótipos 1, 2, 3, 4 e 6, sendo que os mais prevalentes foram os genótipos 2 (33%), 1 (27%), seguidos pelo genótipo 3 (23%). O genótipo 1 e mostrou associação positiva com a LEMP (p<0,05), enquanto que o genótipo 3 mostrou associação inversa à LEMP. Durante a internação em que foi diagnosticada LEMP observamos evolução para óbito em 27 (59%) pacientes e alta em 19 (41%). Não houve associação entre os genótipos do VJC ou carga viral liquórica e a evolução para óbito, mas houve associação significante entre o número de linfócitos TCD4+ e o óbito. No presente estudo, uma mutação no sítio 91 do gene VP1 com substituição da leucina para isoleucina ou valina, não descrita anteriormente, foi encontrada exclusivamente em pacientes com LEMP. Substituições nos sítios 123, 128 e 134 foram observadas mais frequentemente nos casos de LEMP. Não foram encontradas diferenças filogenéticas entre as sequências obtidas dos casos e dos controles. A PCR em tempo real padronizada mostrou sensibilidade e especificidade diagnósticas de 89% e 100%, respectivamente. / The relationship between the different genotypes of VJC and the pathogenesis of progressive multifocal leukoencephalopathy remains a controversial issue. This study aimed to genotypic characterization of JC virus (JCV) and its association with progressive multifocal leukoencephalopathy (PML) in AIDS patients in Sao Paulo, from 2000 to 2008. We analyzed 51 CSF samples from patients with PML and 47 samples of AIDS patients without PML positives for the T and VP1 genes by polymerase chain reaction (PCR). Were identified by genomic sequencing genotypes 1, 2, 3, 4 and 6, and were the most prevalent genotypes 2 (33%), 1 (27%), followed by genotype 3 (23%). Genotype 1 showed a positive association with PML (p <0.05), while genotype 3 was inversely associated with PML. Overall in-hospital mortality was 59% (27 patients). No association between the genotypes of VJC or CSF viral load and progression to death, but there was a significant association between number of CD4 + and death. In this study, a mutation in site 91 of VP1 gene with substitution of leucine for isoleucine or valine, not described previously, was found exclusively in patients with PML. Substitutions at sites 123, 128 and 134 were observed more frequently in cases of PML. No differences were found between phylogenetic sequences obtained from cases and controls. The real-time PCR showed standardized diagnostic sensitivity and specificity of 89% and 100%, respectively.

In plant breeding, genomic prediction (GP) may be an efficient tool to increase the accuracy of selecting genotypes, mainly, under multi-environments trials. This approach has the advantage to increase genetic gains of complex traits and reduce costs. However, strategies are needed to increase the accuracy and reduce the bias of genomic estimated breeding values. In this context, the objectives were: i) to compare two strategies to obtain markers subsets based on marker effect regarding their impact on the prediction accuracy of genome selection; and, ii) to compare the accuracy of four GP methods including genotype × environment interaction and two kernels (GBLUP and Gaussian). We used a rice diversity panel (RICE) and two maize datasets (HEL and USP). These were evaluated for grain yield and plant height. Overall, the prediction accuracy and relative efficiency of genomic selection were increased using markers subsets, which has the potential for build fixed arrays and reduce costs with genotyping. Furthermore, using Gaussian kernel and the including G×E effect, there is an increase in the accuracy of the genomic prediction models. / No melhoramento de plantas, a predição genômica (PG) é uma eficiente ferramenta para aumentar a eficiência seletiva de genótipos, principalmente, considerando múltiplos ambientes. Esta técnica tem como vantagem incrementar o ganho genético para características complexas e reduzir os custos. Entretanto, ainda são necessárias estratégias que aumentem a acurácia e reduzam o viés dos valores genéticos genotípicos. Nesse contexto, os objetivos foram: i) comparar duas estratégias para obtenção de subconjuntos de marcadores baseado em seus efeitos em relação ao seu impacto na acurácia da seleção genômica; ii) comparar a acurácia seletiva de quatro modelos de PG incluindo o efeito de interação genótipo × ambiente (G×A) e dois kernels (GBLUP e Gaussiano). Para isso, foram usados dados de um painel de diversidade de arroz (RICE) e dois conjuntos de dados de milho (HEL e USP). Estes foram avaliados para produtividade de grãos e altura de plantas. Em geral, houve incremento da acurácia de predição e na eficiência da seleção genômica usando subconjuntos de marcadores. Estes poderiam ser utilizados para construção de arrays e, consequentemente, reduzir os custos com genotipagem. Além disso, utilizando o kernel Gaussiano e incluindo o efeito de interação G×A há aumento na acurácia dos modelos de predição genômica.

Após a estabilização da economia na década de 1990, o cenário que vem se consolidando indica claramente o estabelecimento de mercados livres e competitivos, o que conseqüentemente, exige setores eficientes nas diversas atividades. Nesse contexto, a demanda por tecnologia tende a aumentar e, apesar da intensificação, a utilização de pastagens como principal componente da dieta dos rebanhos de animais ruminantes deverá ter o seu lugar de destaque, por ser esta a forma mais econômica de fornecer alimento aos animais. Desse modo espécies de alto potencial forrageiro como a alfafa (Medicago sativa L.), podem ser opções para melhorar a produtividade de forragem e o desempenho animal, pois associam elevada produção com alto valor nutritivo. De março de 2001 a fevereiro de 2002, foi estudado o efeito do método de pastejo sob o acúmulo de forragem total (AFT), o índice de área foliar (IAF), a interceptação luminosa (IL), e os determinantes morfofisiológicos da persistência de cinco genótipos de alfafa num Kandiudalfic Eutrudox. Um experimento do tipo "mob-grazing" foi realizado em área do Departamento de Zootecnia da ESALQ/USP, em Piracicaba, SP. O delineamento experimental foi o de blocos completos casualizados, com parcelas subdivididas (split-plot), com 10 tratamentos e 6 repetições, totalizando 60 unidades experimentais. Nas parcelas foram alocados o fator de tratamento relativo ao método de pastejo ("lotação contínua", simulada por desfolhas semanais, e "lotação rotacionada" com desfolha a cada 4 semanas na primavera-verão e a cada 6 semanas no outono-inverno). Nas sub-parcelas foram alocados os cinco genótipos de alfafa com diferentes aptidões agronômicas em termos de dormência, adaptação local e tolerância ao pastejo (ABT-805, Alfagraze, Crioula, CUF-101 e Pioneer 5432), submetidos a 295 dias de pastejo e sob irrigação. ABT-805 foi o cultivar mais produtivo sob lotação contínua (26,6 Mg MS ha -1 ano -1 ) e no pastejo rotacionado (18 Mg MS ha -1 ano -1 ) e quem teve o maior IAF médio (2,1) e o máximo valor de IL médio (53%) ao longo do experimento, sob pastejo rotacionado. Alfagraze, apesar de ser um dos menos produtivos no pastejo rotacionado (13,3 Mg MS ha -1 ano -1 ) foi semelhante em produção com o ABT-805, no pastejo com lotação contínua (26,3 Mg MS ha -1 ano -1 ), com um IL médio de 47% e valores médios de IAF de 1,1 e 1,8 para o pastejo com lotação contínua e rotacionado, respectivamente. Pioneer 5432, situou-se numa condição intermediária, com um IL médio de 49%, produção total de forragem de 24,3 e 15,3 Mg MS ha -1 ano -1 e valores médios de IAF (0.98 e 1,76) para a lotação contínua e rotacionada, respectivamente. O cultivar com melhor persistência, sob lotação contínua foi o Alfagraze com 26% de sobrevivência, enquanto sob lotação rotacionada foi o ABT-805 com 44,9%. Dos cultivares dormentes não adaptados ao pastejo, CUF-101 foi o que revelou menor persistência. Duzentos e dez dias após o inicio do pastejo, sob lotação contínua, havia somente 9,6% de alfafa na massa de forragem pré-pastejo, indicando nessa data o que aconteceria com o estande de plantas ao final do experimento. Trezentos e vinte e cinco dias após o início do pastejo, Alfagraze, ABT-805 e Pioneer 5432 apresentaram valores médios de teores e estoques de CNE em raízes e coroas, em torno de 221 e 112,9 g kg -1 MO e de 406 e 210,7 g m -2 , respectivamente. Sob lotação contínua, os estoques de CNE sofreram drástica redução nas raízes (79,8%) e coroas (84,7%) de alfafa, e em torno de 46 e 59%, respectivamente quando foi sob lotação rotacionada. Cultivares tolerantes ao pastejo tiveram valores médios de teores e estoques de nitrogênio total, nas raízes e coroas, em torno de 168,9 e 231,2 g kg -1 MO e de 331,6 e 326,9 g m -2 , respectivamente. ABT-805 e Alfagraze parecem ser produtivas e moderadamente adaptadas ao pastejo nas latitudes tropicais do Brasil Central, mas o seu uso bem sucedido dependerá das condições climáticas e do método do manejo do pastejo. / With the stabilization of the Brazilian economy in the 1990s, the establishment of competitive free markets has pushed most activities toward the need for professionalization and increased efficiency. The demand for technology is growing and despite the ever rising intensification in the livestock industry, it is likely that grazed forages will continue to be main component of ruminant diets and key to the system as a whole, as it represents a low-cost feeding alternative. The adoption and the efficient utilization of forage species with both high yield potential and high nutritive value, such as alfalfa (Medicago sativa L.) may enhance animal performance and productivity. From March 2001 through February 2002, the impact of grazing method was studied on plots of five alfalfa genotypes on a Kandiudalfic Eutrudox in Piracicaba, SP. Responses measured included total and seasonal herbage accumulation, leaf area index (LAI), light interception by the canopy (LI), plant survival, weed encroachment, stand counts and reserve status (concentrations and pools of total non-structural carbohydrates, TNC, and nitrogen, N) in plant roots and crowns. An irrigated mob-grazing study was conducted in a randomized complete block design with six replications and a split-plot arrangement. Treatments included all possible combinations among two grazing methods as whole plot factor (continuous stocking, simulated by weekly grazing of plots year-round; and rotational stocking, simulated by grazing plots every four weeks during the "wet/wam" season and every six weeks during the "dry/cool" season; plots were grazed down to 7 cm each time) and five alfalfa genotypes (sub-plot factors), represented by commercial cultivars with varying agronomic characteristics regarding dormancy class, origin, and grazing tolerance (ABT-805, Alfagraze, Crioula, CUF-101, and Pioneer 5432). Plots were grazed for 295 days. ABT-805 was the highest yielding genotype both under continuous (26.6 Mg DM ha -1 yr -1 ) and rotational (18 Mg DM ha -1 yr -1 ) stocking. It also had the highest mean LAI (2.1) and mean LI (53%) throughout the experikental period under rotational stocking. Alfagraze, although among the lowest yielding genotypes under rotational stocking (13.3 Mg DM ha -1 yr -1 ) sustained similar total forage accumulation to that of ABT-805 under continuous stocking (26.3 Mg DM ha -1 yr -1 ), with a mean 47% LI and mean LAI between 1.1 and 1.8 for continuous and rotational stocking, respectively. Pioneer 5432 responded with a mean 49% LI, total seasonal herbage accumulation of 24.3 and 15.3 Mg DM ha -1 yr -1 and mean LAI of 0.98 and 1.76 under continuous and rotational stocking, respectively. Genotype performance was variable regarding the final stand counts, plant survival, percent alfalfa in pregraze forage mass, and in the concentration and pool of total non-structural carbohydrates (TNC) and total nitrogen (N) in roots and crowns of alfalfa plants. Crioula and CUF-101 did not survive through the end of the trial, under either grazing method. Alfagraze showed the highest persistence under continuous stocking, with stand counts falling from 245.7 to 63.9 plants m -2 (26% survival). Under rotational stocking, ABT-805 had the highest persistence, with plot stands declining from 250 to 112.3 plants m -2 , a 44,9% survival rate. Among the dormant, non grazing tolerant cultivars, CUF-101 showed the poorest persistence. Two hundred and ten days after initiation of grazing, there was a mean 9.6% alfalfa in the total pregraze forage mass, a harbinger of the general degradation of the plot stands which materialized at the end of the experimental period. Three hundred twenty five days after the trial started, Alfagraze, ABT-805 and Pioneer 5432 stored TNC, in roots and crowns, respectively, with concentrations of 221 and 112.9 g kg -1 OM and pools of 406 and 210,7 g m -2, respectively. Mean TNC pools were reduced by 79.8% in roots and by 84.7% in plant crowns when plots were under continuous stocking and by 46 and 59%, respectively, under rotational stocking. Grazing tolerant cultivars accumulated N reserves in roots (168.9 g kg -1 OM, for pools of 331.6 g m -2 ) and crowns (231.2 g kg -1 OM, for pools of 326.9 g m -2 ). ABT-805 and Alfagraze seem to be productive and moderately adapted to grazing in the tropical latitudes of central Brazil, but their successful use will depend on climate and choice of grazing management method.

Orientador: Márcio Garcia Ribeiro / Resumo: As infecções mamárias por Prototheca têm sido registradas, de modo crescente, em todo o mundo, como um dos agentes mais patogênicos de origem ambiental na mastite bovina. Estas algas provocam lesões graves no tecido mamário e, até o momento, não existe protocolo efetivo de tratamento. O objetivo do presente estudo foi investigar o efeito algicida “in vitro” da guanidina em 75 isolados de Prototheca zopfii identificados de 60 casos de mastite clínica bovina (80,0%), 14 (18,7%) casos de mastite subclínica e um (1,3%) caso sem o diagnóstico de mastite clínica ou subclínica. Os 75 isolados foram submetidas a testes fenotípicos convencionais e caracterização genotípica por PCR multiplex, permitindo a identificação de todas as estirpes como P. zopfii genótipo 2. O efeito “in vitro” da guanidina revelou que todas os isolados mostraram variações na concentração algicida mínima que variaram de 0,001% a 0,035%. A guanidina tem alto efeito microbicida e é considerado um antisséptico/desinfetante da nova geração de microbicidas. O composto não é tóxico para as membranas mucosas e conjuntivas de humanos em baixas concentrações. É utilizado como desinfetante de piscinas e na desinfecção de superfícies, bem como antisséptico em feridas humanas. A ação algicida da guanidina em baixas concentrações indica que poderia ser usada na higienização de ambiente, utensílios e equipamentos de ordenha, no pré e pós-dipping em propriedades com casos de prototecose mamária, assim como na ablação química ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Prototheca species have increasingly been reported as the most common opportunistic pathogens causing mastitis worldwide. The protothecal mastitis poses a major health and economic problem in dairy herds. To date, there is any effective therapy against protothecal mastitis. The aim of the present study was to investigate in vitro algaecide effect of guanidine on 75 Prototheca zopfii genotype 2 strains isolated from 75 cases of clinical and subclinical bovine mastitis cases. In vitro effect of guanidine revealed that all strains were susceptible to the compound with minimal algaecide concentration ranging from 0.001% to 0.035%. Guanidine has high microbicidal effect and is considered a new-generation microbicidal compound. It is non-toxic to human mucous membranes and conjunctivas at low concentrations; it has been used as a disinfectant of surfaces and in swimming pools, as well as antiseptic on human wounds. The algaecide action of guanidine at low concentrations indicates that it could be an alternative disinfectant or antiseptic to clean the environment and milking dairy equipment, in pre- and post-dipping solutions, in the chemical dry therapy of bovine teats, and even in intramammary therapy of P. zopfii infections. This is the first report of the in vitro algaecide effect of guanidine on P. zopfii strains from animal origin. / Doutor