Common law in Canada recognizes the rights to self-determination and autonomy and the right of competent persons to decide for themselves on medical treatment which includes the right to refuse all treatment. The legal profession has caused Japanese law to begin to recognize these basic rights, however professional and societal factors combine to accord the Japanese physician a wide discretion to determine what information to disclose, especially in the case of cancer. This thesis examines the similarities and differences existing between Canada and Japan in the controversial area of informed consent and the patient's right to refuse treatment and as well as the current attitudes within the legal and medical professions in Japan toward recognition and enforcement of these rights.

The amphipathic helix structural motif is often found in biologically active peptides and proteins. On one side of the helix, polar residues are aligned, whereas the other side is composed of hydrophobic residues. Ideal Amphipathic Peptides (IAP) composed of only lysine and leucine residues, in a 1:2 ratio (KLLKLLL sequences) were developed in the 1990's as bacteriocidal agents. These peptides are helical, with a positively charged hydrophilic side composed of lysine residues, and a hydrophobic face composed of the leucine residues. / We demonstrate that a 22-mer IAP possesses procoagulant properties in vitro. Using factor Xa and thrombin generation assays, IAP accelerates factor IXa-mediated factor X turnover and factor Xa-mediated prothrombin turnover. IAP has procoagulant activities both when the peptide is free in solution and when it is attached to a surface. IAP also has antifibrinolytic activity in a simple in vitro assay with purified fibrinolytic proteins. Using fluorescence energy transfer (FRET) experiments as well as ELISA-based experiments, IAP binds directly to the γ-carboxyglutamic acid (Gla) domain of factor X. This behaviour is typical of a phospholipid membrane to which different coagulation factors can bind and exert their actions. / The above in vitro properties suggest that IAP could serve as a potential hemostatic agent. Its properties in vivo, when coupled to a surface, are shown in two bleeding models in rabbits (ear and liver bleeding models) as well as in two hemorrhage models in swine (liver and femoral artery bleeding models) to significantly reduce in vivo bleeding times. / Unexpectedly, IAP prolongs coagulation times of normal pooled plasma in standard coagulation assays using the full complement of coagulation factors including phospholipid membranes. Three different phospholipid-dependent assays show that IAP interacts with phospholipid membranes present in the coagulation cascade, prolonging coagulation times, thereby demonstrating anticoagulant potential in addition to its procoagulant activities in vivo. / In summary, the above findings show that IAP possesses different hemostatic properties. It is procoagulant in vivo when attached to a surface, and is anticoagulant in vitro when in solution with phospholipid membranes. / Plusieurs peptides et protéines biologiquement actifs se structurent en hélice amphipathique. Les acides aminés polaires sont alignés sur un côté de l'hélice, tandis que l'autre côté est composé des acides aminés hydrophobes. Des peptides amphipathiques idéals (IAP), composés uniquement de résidus de lysines et de leucines avec un ratio de 1:2 (séquences de KLLKLLL), ont été développés dans les années 1990 comme agents bactéricides. Ces peptides hélicaux offrent un côté hydrophile chargé positivement composé de résidus de lysines, et un côté hydrophobe où les résidus de leucines sont regroupés. / Nous démontrons que le peptide IAP composé de 22 résidus possède des propriétés procoagulantes in vitro. Lors de tests de génération du facteur Xa et de la thrombine, cet IAP accélère l'activation du facteur X en facteur Xa par le facteur IXa ainsi que l'activation de la prothrombine en thrombine par le facteur Xa. Le peptide IAP conserve ses propriétés procoagulantes qu'il soit en solution ou qu'il soit fixé à une surface. L'IAP possède aussi une activité antifibrinolytique. Ceci est démontré lors d'un test in vitro effectué dans un système purifié contenant les diverses protéines nécessaires à la fibrinolyse. À l'aide d'une expérience de fluorescence (FRET) ainsi que d'un test ELISA, nous avons démontré que le peptide IAP se lie directement au domaine Gla (acides γ-carboxyglutamiques) du facteur X. De cette manière, l'IAP se comporte d'une façon similaire à une membrane de phospholipides à laquelle différents facteurs de coagulation se lient pour exercer leurs actions. / Ces divers tests in vitro démontrent que l'IAP pourrait être utilisé comme agent hémostatique. Les propriétés procoagulantes du peptide, lorsque lié à une surface, ont été démontrées in vivo à l'aide de deux différents modèles d'hémorrhagie développés chez le lapin (lacération de l'oreille et du foie), ainsi que deux modèles chez le porc (lacération du foie et ponction de l'artère fémorale) / De façon surprenante, le peptide IAP prolonge les temps de coagulation lorsque ajouté au plasma humain lors de tests standards conduits sur divers facteurs de coagulations et des membranes de phospholipides. Trois différents tests dépendants des phospholipides démontrent que l'IAP interagit avec les membranes de phospholipides présentes à diverses étapes de la cascade de coagulation. Cette interaction, ayant pour résultat la prolongation des temps de coagulation, démontre que l'IAP possède un potentiel anticoagulant en plus de ses capacités procoagulantes in vivo. / En résumé, les résultats obtenus lors de ces études et mentionnés ci-haut démontrent que le peptide IAP possède diverses propriétés hémostatiques. Ce peptide est procoagulant in vivo lorsqu'il est lié à une surface, et est anticoagulant in vitro en solution avec des membranes phospholipides.

To the author's knowledge, no studies have included an analysis of foot or ankle kinematics during cross-sloped running, a condition frequently encountered in the runner's training environment. The goal of this thesis was to evaluate the kinematic adaptations induced at the level of the foot while running on a ten degree cross-slope. A three segment foot model that distinguished the hallux, forefoot and hindfoot was used for this purpose. Ten healthy male experienced runners volunteered to perform level and cross-slope trials, while running barefoot at a moderate speed. The angular excursion of the adjacent foot segments during running was analyzed in all three planes. Statistical analysis were made between the level and cross-sloped condition as well as across limb sides (up-slope and down-slope limb). Results showed that the slope created significant bi-lateral differences in both the hindfoot/tibia and forefoot/hindfoot coupling, most of which occurred in the frontal plane. / À l'heure actuelle, aucun article ne décrit une analyse cinématique du comportement du pied et de la cheville lors de la course sur terrain en pente transversale. Le principal objectifs de cette étude était d'évaluer l'effet d'une pente transversale de dix degrés sur les variables cinématiques au niveau du pied durant une activité de course. Un modèle représentant le pied en trois segments a permis d'évaluer l'exursion angulaire des segments adjacents dans les trois plans de l'espace. Dix coureurs masculins ont participé à cette expérience et ont couru pieds nuds à vitesse modérée pour réaliser les répétitions. L'analyse statistique a ensuite permis de comparer chaque jambe ( en haut de pente ou bas de pente) et chaque condition (terrain plat ou pente transversale). Les résultats ont souligné des différences bi-latérales significatives au niveau de la relation de couplage de l'arrière-pied/tibia et avant-pied/arrière-pied, la plupart desquelles survenaient dans le plan frontal.

Studies on congenital disorders of the pancreas have contributed to the identification of genes that are critical in beta-cell development and function. Transient neonatal diabetes mellitus (TNDM) is a rare congenital disorder of the pancreas. It involves severe insulin deficiency at birth that reverses over weeks or months but may relapse with diabetes in later life. PLAGL1 (pleiomorphic adenoma gene-like 1, also known as ZAC, zinc finger protein that regulates apoptosis and cell cycle arrest, and LOT1, Lost On Transformation 1) is one of the two possible genes at the TNDM locus and the multiple functions of PLAGL1/ZAC strongly suggest it as the causative gene of TNDM. We hypothesized that double dose expression of PLAGL1/ZAC impairs both beta-cell development and function. To test this hypothesis, we began with the study of ZAC ontogeny. In developing human pancreas, ZAC is expressed with considerable specificity in differentiated beta-cells, and its expression decreases dramatically from the second trimester to adult. These results imply a role of ZAC in a critical time window in beta-cell development, supporting its role in TNDM and explaining the transient nature of the TNDM. In vitro, effects of ZAC overexpression on beta-cell function was observed in INS-1 cells by using tetracycline regulatable system. Overexpression of ZAC inhibits glucose-stimulated insulin exocytosis and proinsulin biosynthesis. Glucose was found to be able to downregulate Lot1/Zac1 expression in INS-1 cells and mouse islets. These data suggest ZAC as a negative regulator in some glucose-regulated pathways whose abnormally high level impairs beta-cell function that explains the relapse of diabetes in TNDM. Finally, a gene expression profile study of INS-1 cells with or without induced ZAC expression identified STC1, IGF1R, SNAP25, GRP78, and P58IPK as possible targets of ZAC that mediate beta-cell dysfunctions. CRABP2, strongly upregulated by ZAC, together with G0S2, GADD45alpha, and FHL2, may mediate ZAC function in both normal beta-cell development and TNDM pathophysiology. In general, these studies suggest that tightly controlled expression level of ZAC is critical for beta-cell development and function. It provides strong evidence that ZAC overexpression causes TNDM. In addition, two previously unstudied genes, STC1 and CRABP2, are suggested to play potential important roles in beta-cell function and development. / Les études portant sur les désordres congénitaux du pancréas ont contribué à l'identification de gènes critiques pour le développement et la fonction des cellules bêta. Le diabète néonatal transitoire (DNNT) est une maladie héréditaire du pancréas. Elle est caractérisée par une déficience sévère en insuline à la naissance qui disparaît après quelques semaines/mois mais pouvant réapparaître plus tard au cours de la vie. PLAGL1 (pleiomorphic adenoma gene-like 1, aussi connu comme ZAC, zinc finger protein that regulates apoptosis and cell cycle arrest, et LOT1, Lost On Transformation 1) est un des deux gènes dans la région critique du DNNT et ses multiples fonctions en font le candidat causatif le plus probable. Notre hypothèse est que sa surexpression compromet la fonction et le développement des cellules bêta. Notre étude ontgénique de ZAC dans le pancréas en développement, démontre que ZAC était exprimé avec une spécificité considérable dans les cellules bêta, expression qui diminuait à partir du second trimestre. Ces résultats supportent l'existence d'une fenêtre temporelle critique pour la fonction de ZAC dans le développement des cellules bêta, compatible avec la nature transitoire du DNNT. In vitro, les effets de la surexpression de ZAC ont été observés dans les cellules bêta INS-1 en utilisant un système d'expréssion inductible par la tétracycline. L'exocytose glucose-dépendante de l'insuline et la biosynthèse de la proinsuline sont diminués par la surexpression de ZAC. Le glucose pouvait diminuer l'expression de Lot1/Zac1 dans les INS-1 et dans les îlots murins, une observation qui propose ZAC comme un régulateur négatif de voies métaboliques régulées par le glucose dont les niveaux anormalement élevés affectent la fonction des cellules bêta. Le profile d'expression génique sur les INS-1 après induction de ZAC a identifié STC1, IGF1R, SNAP25, GRP78 et P58IPK comme cibles potentielles de ZAC intervenant dans les dysfonctionnements des cellules bêta. CRABP2, qui est fortement augmenté, tout comme G0S2, GADD45alpha et FHL2, pourrait servir de médiateur de ZAC dans le développement des cellules bêta et dans le DNNT. Ces études indiquent qu'une expression minutieusement contrôlés de ZAC est critiques pour le développement et la fonction des cellules bêta et que sa surexpression peut causer le DNNT. Finalement, un rôle de STC1 et CRABP2 dans la fonction et le développement des cellules bêta est suggéré.

Over-expression of the human GPI-linked carcinoembryonic antigen (CEA) family members CEA and CEACAM6 is a common feature characteristic of about 70% of human cancers including colon, breast and lung. CEA and CEACAM6 belong to the CEA subfamily of cell surface intercellular adhesion molecules within the immunoglobulin superfamily. It has previously been demonstrated that its over-expression inhibits cellular differentiation, blocks cell polarization, distorts tissue architecture, and inhibits anoikis in vitro. Although our laboratory previously demonstrated the role of integrin alpha5beta1, the main receptor for the ECM component fibronectin, in the CEA-mediated inhibition of differentiation and anoikis in vitro, the molecular mechanism implicated in these inhibitory effects remained unclear. In this work, we established a model for CEA signaling in which clustering of CEA molecules in the cell surface induces membrane microdomain aggregation and subsequent co-clustering and activation of the integrin alpha5beta1 and associated integrin-signaling elements such as the P13-K and MAPKinase cascades. Further studies done in a transgenic mice harboring part of the human CEACAM family gene locus (CEABAC), with similar protein expression patterns as those found in humans, allowed us to extrapolate these in vitro observations to an in vivo system. At low to moderate expression levels of CEACAM6, we found transgene copy number-dependent increases in CEABAC colonocyte surface levels of integrin alpha5 and Akt activation. An increase in colonocyte proliferation, an inhibition of differentiation, and marked inhibition of colonocyte anoikis/apoptosis was also observed. At tumor-like expression levels, this phenotype was accentuated, CEABAC mice showed massively enlarged colons with dysplastic and serrated adenomatous morphology. Subsequent analysis of the molecular mechanism involved in the CEA-mediated anoikis inhibition, demonstrated that the CEAGP1 anchor and self-adhesive extracellular domains were crucial for the CEA inhibitory anoikis signal, implicating the intrinsic apoptotic pathway and the PI3-K cascade. In summary, the results presented in this thesis establish a potential molecular mechanism involved in CEA-mediated tumorigenic effects.

During the formation of skeletal muscle, muscle cell differentiation is induced by endogenous and exogenous stimuli which cause mononucleated cells committed to myogenic lineage called myoblasts to fuse into multinucleated myotubes. The molecular mechanisms underlying this process involve myogenic regulatory factors (MRFs) which are under tight regulation. Although transcriptional regulation plays an important role, it alone can not account for the high expression levels of MRFs. In this thesis, a facet of the post-trancriptional regulation of promyogenic factors, namely MyoD and Myogenin, through the RNA-Binding Protein HuR is investigated. The presented studies show that HuR, which specifically binds to the AU-rich elements (AREs) in the 3’UTR of the aforementioned messages and stabilizes them, is cleaved during myogenesis by caspases at the site D226 which is in the HNS region. This domain normally mediates the shuttling of HuR via the import receptor Transportin 2 (Trn2); however, during myogenesis HuR is translocated to the cytoplasm where it is cleaved to generate HuR-CP1. This cleavage product then competes with HuR for binding to Trn2 which in turn prevents HuR from relocating to the nucleus and results in its cytoplasmic accumulation where it can further stabilize of the promyogenic factors and allow for muscle differentiation to proceed. Since HuR-CP1 competes with HuR for Trn2, it was interesting to examine other ligands that HuR-CP1 and HuR-CP2, the complementary cleavage product, could bind to. To this end a pull-down experiment was performed with these isoforms and extensive lists of partner proteins obtained were then compared. A biotinylation experiment was also performed with MyoD and myogenin 3’UTRs to search for RNA-Binding Proteins that could be partners of HuR or its cleavage products. Due to the time restraint, the associations from these preliminary data have not yet been validated; however an analysis of the data, shows hnRNPK, which associates with Hu proteins and antagonizes their role in neurogenesis, to bind all three isoforms as well as MyoD and myogenin 3'UTR. It would therefore be interesting to investigate some of the proteins identified in these experiments, validate the associations, and assess the roles they play, if any, during myogenesis. / Durant la formation des muscles, des stimulis endogènes et exogènes induisent la différentiation de cellules mononuclées en cellules de la lignée myogénique qui vont ensuite fusionner pour former des fibres musculaires multinuclées. Les mécanismes moléculaires entourant ce processus mettent en jeu des facteurs régulateurs de la myogenèse, les MRFs, qui sont eux-mêmes très finement contrôlés. Bien que la transcription joue un rôle très important dans ce processus, seule, elle ne peut pas maintenir le niveau élevé d'expression des MRFs. Dans ce mémoire j'étudie un aspect de la régulation post-transcriptionnelle, notamment le rôle de HuR, une protéine qui se lie spécifiquement aux éléments riches en AU (ARE) dans les régions 3’non traduites (3’UTRs) des ARN messagers comme MyoD et myogenin. Mes expériences démontrent que durant la différentiation musculaire, HuR est clivée par les caspases au niveau de l'acide aminé aspartate (D) 226 qui se situe dans un domaine important pour le mouvement de HuR du noyau au cytoplasme et l'inverse, avec l'aide de l'importine Transportin 2 (Trn2). Le déclenchement de la différentiation suscite le mouvement de HuR vers le cytoplasme, un évènement suivi par son clivage qui génère deux produits HuR CP2 et HuR-CP1. Ce dernier ayant une affinité pour Trn2, rentre en compétition avec HuR et prévient ainsi son mouvement vers le noyau. L'accumulation de HuR dans le cytoplasme permet donc de stabiliser les ARNm pro-myogéniques plus longtemps et de favoriser la différentiation. L'association de HuR-CP1 avec Trn2 m'a aussi menée à étudier les partenaires potentiels des produits de clivage par rapport à HuR. Mes expériences de Pull down ont généré de longues listes que j'ai pu comparer. Dans le but de voir si les protéines qui s'associent aux messages MyoD et myogenin se lient à HuR ou aux produits de clivage j'ai fait une expérience de biotinylation du 3’UTR des messages mentionnés. Malgrès le fait de ne pas avoir eu le temps de vérifier ces associations, j'ai pu repérer une protéine hnRNPK qui a était étudiée dans la neurogenèse et qui antagonise l'effet de protéines Hu dans ce processus. Cette protéine semble s'associer à HuR, les produits de clivages et les messages. Cela étant donné, je pense que ce serait intéressant de valider cette association en plus des autres mentionnées dans mon mémoire et d'étudier leurs importances dans la myogenèse.

When standing, feedforward (FF) activity is produced in the supporting limbs prior to arm reaching movements and provides the biomechanical conditions required for reaching the target. When balance is unexpectedly perturbed, for example by a sudden support surface movement, short and long feedback-based (FB) postural responses are produced which restore body position to its pre-perturbation state. How these 2 modes (FF and FB) interact however, remains unclear. We investigated this relationship by examining if the FB-based automatic postural reactions (APR) evoked during reaching on a moving platform are modulated differently if the target moves with the body (an egocentric target, EGO), rather than moving independently of the body (EXO target). Furthermore, we varied the perturbation onset to occur either in the acceleration (RPa) or deceleration phase (RPd) of the reach. Analysis of EMG activity revealed that short latency APRs were reduced across both RP conditions with respect to P, and long latency APRs were significantly reduced. The reduction in the long-latency phase of the APRs was greater in RPd conditions than RPa, suggesting that perturbations during the acceleration phase of the reach are highly disruptive. Most importantly however, the EXO-RP condition produced significantly less long latency activity than did EGO-RP. This would suggest that when reaching to an exocentrically-placed target (static with respect to the moving platform), the long latency postural responses must be modulated to a greater extent than when the target moves with the moving body to ensure movement success. / En position debout, l'activité postural programmée en mode proactif est produite dans les membres de soutien avent des mouvements d'atteindre le bras, soit pour assurer la stabilité ou à induire le mouvement du corps entier nécessaire pour atteindre vers une cible. Alternativement, lorsque la posture est perturbée de manière inattendue, par exemple par un mouvement brusque de la surface d'appui, à la fois des réponses posturales à latence courte et à latence longue s'ensuivre. Comment ces deux modes (commandes prédictives et commandes en rétroaction) interagissent au cours de tâches posturales dynamiques reste incertaine. On a investigué cette interaction par examinant si les réactions posturales automatiques (APR) évoqués au cours d'atteindre une cible sur une plate-forme mobile sont modulés différemment si la cible se déplace avec le corps (une cible égocentrique, EGO), plutôt que si la cible se déplace indépendamment du corps (cible EXO). On a varié le début des perturbations de plate-forme de se produire soit dans la phase d'accélération (RPa) ou décélération de la portée (RPd). Analyse de l'activité EMG a révélé que les APRs de latences courtes ont étés réduits dans les conditions RP fois par rapport à P, et les APRs de latences longues ont étés significativement réduits. La réduction de la phase longue de latence de l'APR était supérieure dans les conditions de RPd que RPa, suggérant que les perturbations pendent la phase d'accélération de la portée sont plus perturbateur. Plus important cependant, la condition EXO produit des activités de latence longue significativement réduit en amplitude que EGO. Cela suggère que les réponses posturales de latence longue doivent être modulée à une plus grande mesure pour les portées à une cible exocentrique (statique par rapport a la plate-forme mobile), que si la cible se déplace avec le corps pour assurer le succès du mouvement.

Telomeres are repeated sequences of DNA at the ends of chromosomes that protect the cell from death. Telomerase is a ribonucleoprotein (RNP), consisting of a catalytic subunit, TERT, and an RNA component, TR, that synthesizes telomeres. Telomerase is active in 85% of cancers, including leukemias. Telomerase is thus a potential pharmacological drug target for cancer therapy, and it is important to understand this enzyme and its regulation by associated proteins. One goal of this thesis was to identify novel telomerase interacting partners that specifically regulate telomerase function and that could serve as potential anticancer targets. Additionally, it is important to understand how telomerase inhibition works in a cancer model. Telomere length is a prognostic factor in chronic lymphocytic leukemia (CLL). Previous reports have assessed Imetelstat, a telomerase inhibitor which targets the human telomerase RNA component hTR, in a phase I-II clinical trial in CLL patients. We further investigated Imetelstat in lymphocytes from CLL patients. We found that telomerase activity was present in 47% of lymphocyte samples from CLL patients and that treatment with Imetelstat alone did not affect the survival of primary CLL lymphocytes in vitro. Nonetheless, Imetelstat increased the sensitivity of CLL lymphocytes to fludarabine, independent of basal telomerase activity. Imetelstat inhibited fludarabine-induced DNA-PK autophosphorylation, a surrogate of DNA-PK activity in CLL lymphocytes, to the same extent as the DNA-PK inhibitor NU7026. The effect of Imetelstat on fludarabine sensitivity was associated with a lower basal expression of the DNA-PK subunit protein Ku80. Our results suggest that Imetelstat can inhibit fludarabine-induced DNA-PK activity in primary CLL lymphocytes. We conclude that there may be a functional interaction between hTR and DNA-PKcs in primary CLL lymphocytes and that Imetelstat in combination with fludarabine may be useful to decrease the tumour burden in CLL. To investigate other telomerase targets, we identified telomerase associated proteins via mass spectrometry. One potential target is NOP17, which could be involved in the early assembly of telomerase. We created a human cell line stably expressing NOP17 fused to a FLAG tag. Telomerase activity was coimmunoprecipitated using an antibody against FLAG. Moreover, downregulating the expression of this Box C/D SnoRNP protein resulted in decreased telomerase activity. Characterization of telomerase-associated proteins is vital to our understanding of how this enzyme contributes to tumorigenesis. Understanding the regulation of telomere length and telomerase function by associated proteins will be important for the discovery of targeted therapeutics in cancers. / La télomérase synthétise les séquences télomériques et se compose minimalement d'une sous-unité transcriptase inverse (TERT) et d'un fragment d'ARN (TR). La télomérase est active dans 85% des cancers, y compris la leucémie, elle représente donc une cible pour les thérapies du cancer. Afin de découvrir de meilleures cibles thérapeutiques, il est important de comprendre cette enzyme et sa régulation par des protéines associées. Un des buts de cette thèse est d'identifier de nouvelles protéines interagissant avec la télomérase, pouvant réguler ses fonctions de façon spécifique et ainsi potentiellement devenir des cibles anticancéreuses. De plus, il est important de bien comprendre l'effet de l'inhibition de la télomérase dans un modèle de cancer. Nous avons choisi la leucémie car la taille des télomères est un facteur pronostique de la leucémie lymphoïde chronique (LLC). De précédentes études ont conduit à l'évaluation d'Imetelstat, un inhibiteur de la télomérase qui cible la composant ARN de l'enzyme, présentement en essais cliniques de phases I-II. Nos résultats montrent qu'il y a activité de la télomérase dans 47% des échantillons de lymphocytes de patients atteints de LLC et que le traitement seul d'Imetelstat n'a aucun effet sur la survie des lymphocytes primaires de LLC in vitro. Cependant, Imetelstat augmente la sensibilisation des lymphocytes à la Fludarabine, et ce indépendamment de l'activité basale de la télomérase. Imetelstat inhibe l'autophosphorylation de DNA-PK (l'autophosphorylation de DNA-PK est corrélée à son activité enzymatique dans les lymphocytes de LLC) induite par la fludarabine au même niveau que l'inhibiteur de DNA-PK NU7026. L'effet d'Imetelstat sur la sensibilité à la fludarabine est associé à l'expression basale de la protéine Ku80. Nos résultats suggèrent que l'Imetelstat inhibe l'activité DNA-PK dans les lymphocytes de LLC primaire. Nous pouvons conclure qu'il peut s'agir d'une interaction fonctionnelle entre hTR et DNA-PKcs dans les lymphocytes de LLC et que la combinaison de la fludarabine et d'Imetelstat pourrait être utile afin de diminuer la masse tumorale dans la LLC. Afin de découvrir de nouvelles cibles contre la télomérase, nous avons purifié le complexe de la télomérase par spectrométrie de masse. Cela nous a permis d'identifié une nouvelle protéine associée à la télomerase, NOP17, qui pourrait être impliquée dans l'assemblage de la télomérase. Nous avons créé une lignée cellulaire humaine exprimant de façon stable la protéine NOP17 fusionnée à une étiquette FLAG. L'Immunoprecipitation de NOP17 montre une activité de la télomérase indiquant qu'elle est associée à un complexe actif. Par ailleurs, la régulation négative de l'expression de la boîte C/D SnoRNP de la protéine réduit l'expression et l'activité de la télomérase. La caractérisation des protéines associées à la télomérase est essentielle afin de mieux comprendre le fonctionnement de cette enzyme ainsi que sont implication dans la formation de cancers. De plus, ces protéines associées à la télomérase pourraient également servir de cibles potentielles dans les thérapies contre le cancer.

Iron is vital for all living organisms, but due to its ability to readily accept or donate electrons, it is also potentially toxic. Finely tuned mechanisms have evolved to control iron homeostasis at the systemic and cellular level. The peptide hormone hepcidin controls systemic iron homeostasis by binding to and degrading the iron exporter, ferroportin, leading to decreased iron efflux from duodenal enterocytes, macrophages and hepatocytes into the blood stream. Cellular iron homeostasis is regulated by the IRE / IRP system, which controls the levels of proteins involved in iron uptake, utilization, export and storage in a coordinated manner. Excess intracellular iron is stored and detoxified in ferritin. In this work, we study how an excess of iron is managed at the systemic and cellular level. In chapter II, we hypothesize that dietary and parenteral iron loading have differential effects on body iron status and hepcidin expression in mice. We perform time – course experiments and compare the effects of dietary and parenteral iron loading on circulating and tissue iron parameters. We show that dietary iron overload exceeds the capacity of hepcidin to lower body iron levels, and parenteral iron loading elicits a delayed hepcidin response. We provide evidence that circulating holo – transferrin and hepatocytic iron are the sole iron signals for hepcidin activation. In chapter III, we examine how an excess of iron is managed at the cellular level. We hypothesize that ferritin might benefit from an alternative, IRES - dependent mechanism of translation. We inhibit global or ferritin - specific cap – dependent translation initiation and challenge the cells with iron. We show that ferritin by – passes both the global and the specific inhibition of translation. We then test for the presence of an IRES in the 5'UTR of ferritin mRNA and further validate this sequence. / Le fer est vital pour tous les organismes vivants, cependant étant donné son habilité à donner ou accepter des électrons facilement, il a aussi le potentiel d'être toxique. Des mécanismes très précis ont évolué pour contrôler l'homéostasie du fer aux niveaux systémique et cellulaire. L'hormone peptidique, hepcidine, contrôle l'homéostasie du fer au niveau systémique par la dégradation de la ferroportine, l'exportateur cellulaire du fer. En conséquence, l'efflux du fer des entérocytes, des macrophages et des hépatocytes vers la circulation diminue. Au niveau cellulaire, le système IRE / IRP contrôle, d'une manière coordonnée, les niveaux des protéines impliquées dans l'acquisition, l'utilisation, l'exportation et le stockage du fer. L'excès de fer est stocké dans la ferritine. Dans ce travail, nous examinons comment l'excès de fer est géré aux niveaux systémique et cellulaire. Dans le chapitre II, nous émettons l'hypothèse que les surcharges orale et parentérale en fer ont des effets différents sur l'homéostasie systémique du fer et sur l'expression de l'hepcidine chez les souris. Nous comparons les effets des surcharges orale et parentérale en fer aux niveaux circulatoire et tissulaire. Nous démontrons que la surcharge orale en fer excède la capacité hypoferrémique de l'hepcidine alors que la surcharge parentérale en fer induit une réponse retardée de l'hepcidine. Nous apportons aussi la preuve que la holo – transferrine circulatoire et le fer hépatocytaire sont les signaux uniques de l'activation ferrique de l'hepcidine. Dans le chapitre III, nous examinons comment l'excès de fer est géré au niveau cellulaire. Nous émettons l'hypothèse que la ferritine bénéficie d'un mécanisme alternatif de traduction, dépendant d'une séquence IRES. Nous inhibons l'initiation de la traduction dépendante de la coiffe 5' globalement, ou spécifiquement pour la ferritine, et traitons les cellules avec une source de fer. Nous démontrons que la ferritine surpasse le blocage global ou spécifique de la traduction dépendante de la coiffe 5'. Nous testons la présence d'une séquence IRES dans l'extrémité 5' de l'ARNm et par la suite nous la validons.

Computational drug design methods have become increasingly invaluable in the drug discovery and development process. Throughout this thesis will be described the development and application of methods that are used at every stage of the drug discovery and development pipeline. In Chapter 2 will take a look at the use computational methods towards the understanding and development of two novel Bcl-2 inhibitors, Obatoclax and ABT-737, being developed for the treatment of Cancer. The study proposes certain mechanisms through which ABT-737 displays selectivity towards certain targets within the Bcl-2 family. Additionally, we propose a binding mode for Obatoclax which is in accordance with experimental data. The following Chapter addresses the use of virtual screening for the identification of novel lead compounds. Trypanosoma brucei RNA Editing Ligase 1 was chosen as the target for the development of treatments against Trypanosoma infections and C35, a potent novel inhibitor of the enzyme, was identified. Furthermore, our research shows that the action of C35 extends to inhibition of several critical enzyme activities required for the RNA editing process as well as compromising the integrity of the multiprotein complex which carries it out. The following Chapter takes a look at the use of mass spectrometry data in order to expedite discovery of bioactive compounds in natural products. We developed an algorithm which analyses MS/MS data in order to derive the Molecular Formula of the compound. The novel algorithm obtained a 95% success rate on a test set of 91 compounds. The last Chapter of the thesis explores the use of molecular dynamics to generate a conformational ensemble of targets for virtual screening. Conformational ensembles were generated for a target test set taken from the Directory for Useful Decoys. The results showed that molecular dynamics-based conformational ensembles provided remarkable improvements on 2 of the targets tested due to the enhanced capacity to properly dock compounds in otherwise restricted structures. The last Chapter of the thesis is a general discussion on the work of the thesis and a proposal on how all can be integrated within the drug discovery and development pipeline. / Les méthodes the modélisation sont devenues un outil inestimable dans le processus de découverte et de développement de nouveaux médicaments. Au cours de cette thèse va être décrit le développement et l'application de méthodes utilisés à chaque stage de la découverte et du développement de produits pharmaceutiques. Le Chapitre 2 est un aperçu sur l'utilisation de méthodes computationnelles vers le développement de deux nouveaux inhibiteurs des protéines Bcl-2, Obatoclax et ABT-737, en développement pour le traitement du Cancer. L'étude propose certains mécanismes d'ABT-737 qui expliquent ca sélectivité envers les membres de la famille Bcl-2. De plus, nous proposons un mécanisme d'attachement pour Obatoclax qui conforme aux données expérimentales. Le Chapitre suivant adresse l'utilisation du dépistage virtuel pour l'identification de nouvelles molécules mère. La Ligase de l'Edition d'ARN du Trypanosoma brucei a été choisie comme cible pour le développement de traitements contre des infections dû au Trypanosome et C35 a été identifié comme nouvel inhibiteur de l'enzyme. En outre, notre recherche démontre que l'action de C35 s'étends a l'inhibition de plusieurs enzymes nécessaires pour le mécanisme d'édition de l'ARN en plus de compromettre l'intégrité du complexe multi-protéinique qui l'effectue. Le Chapitre suivant prends regard a l'utilisation de donnes dérivant de la spectrométrie de masse pour but d'accélérer la découverte de molécules bioactives venant de sources naturelles. Nous avons développé un algorithme qui analyse les données MS/MS pour but de dériver la formule moléculaire du composé. Le nouvel algorithme a obtenu un taux de succès s'élevant à 95% sur un ensemble test de 91 molécules. Le dernier Chapitre de la thèse explore l'utilisation de simulations de dynamique moléculaire pour générer en ensemble conformationel de protéines cible pour son utilisation dans le dépistage virtuel. Les ensembles conformationel ont étés généré pour une série test obtenu d'un répertoire attitré 'Directory for Useful Decoys'. Les résultats démontrent que les ensembles conformationel dérivés de la dynamique moléculaire ont apporté des améliorations remarquables sur deux des cibles testées dû à une capacité accrue de placement approprié des molécules dans un site qui est autrement très restreint. Le dernier Chapitre de cette thèse est une discussion générale sur le travail accomplie et une proposition sur la manière dont tous les éléments sont intégrer dans un protocole de découverte et de développement de produits pharmaceutiques.