Yes / Aims: The rapidly growing industrial and medical use of nanomaterials, especially zinc oxide and titanium dioxide, has led to growing concerns about their toxicity. Accordingly, the intrinsic genotoxic and cytotoxic potential of these nanoparticles have been evaluated. Materials & methods: Using a HEp-2 cell line, cytotoxicity was tested along with mitochondrial activity and neutral red uptake assays. The genotoxic potential was determined using the Comet and the cytokinesis-blocked micronucleus assays. In addition,tyrosine phosphorylation events were investigated. Results & conclusion: We found concentration- and time-dependent cytotoxicity and an increase in DNA and cytogenetic damage with increasing nanoparticle concentrations. Mainly for zinc oxide, genotoxicity was clearly associated with an increase in tyrosine phosphorylation. Our results suggest that both types of nanoparticles can be genotoxic over a range of concentrations without being cytotoxic.

Submitted by admin tede (tede@pucgoias.edu.br) on 2017-04-27T14:19:15Z No. of bitstreams: 1 GLAUCIELEN GOMES DA SILVA.pdf: 1992448 bytes, checksum: 7764de752332d80cd64fa3e7a9e1b7a1 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-27T14:19:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 GLAUCIELEN GOMES DA SILVA.pdf: 1992448 bytes, checksum: 7764de752332d80cd64fa3e7a9e1b7a1 (MD5) Previous issue date: 2017-03-08 / The search for autoantibodies in HEp-2 cells represents a relevant tool for diagnostic assistance in the investigation of autoimmune diseases, especially rheumatic diseases. This methodology, over the last years, underwent by intense process of improvement and standardization with the accomplishment of the Brazilian Consensus. The objective of this study was to evaluate the implantation of recommendations in the clinical laboratories that perform the methodology, 16 years after the accomplishment of the I Brazilian Consensus on ANA in HEp-2 cells. A research was conducted for the laboratories between February and October 2016. The laboratories were invited to answer questions that dealt with the guidelines of the Consensus, addressing technical aspects, quality control, reading of the slides, issuance of reports and educational programs. The study counted on the participation of 53 laboratories that jointly realize an estimate of 300,000 ANA by month. It has been identified that several medical specialties request the examination, and different professionals are responsible for the technical procedure and reading of the fluorescence slides. Consensus recommendations are being followed by all laboratories, in absolute by 58.5% of the laboratories. Regarding the technical procedure, 83.1% of the participants are screening at a 1:80 dilution and the title depletion, recommended by consensus, is being adopted by all participants. It was evidenced that 39.6% of the participants use more than one brand of kit and that 22.6% performs titration of the conjugate to each new kit and different lamp powers are used in laboratories with a predominance of 100 Watts. Regarding the reading of the slides, 94.3% stated that they observed the four cell compartments, 92.5% said to classify the chromosome metaphase plate negative or positive and 32.1% of the participants did not affirm to observe the cells in all phases of the cycle. In the issue of reports, 13.2% of the laboratories admitted to reporting only the name of the standard followed by the title, not presenting the descriptive report and 24.5% of the participants do not use education and quality control programs. Most laboratories were able to identify representative images of sets of patterns. The results presented here demonstrate consistent advances from the implementation of the ANA Consensus in Brazil, but also evidence the need for actions to implement continuing education programs. / A pesquisa de autoanticorpos em células HEp-2 tem auxiliado no diagnóstico na investigação de doenças autoimunes especialmente as reumáticas. Tal metodologia, ao longo dos últimos anos, passou por um intenso processo de aperfeiçoamento e padronização com a realização do Consenso Brasileiro. O presente trabalho teve como objetivo avaliar, 16 anos após a realização do I Consenso Brasileiro de FAN em Células HEp-2, a implantação das recomendações nos laboratórios clínicos que realizam a metodologia. Foi realizada uma pesquisa direcionada aos laboratórios entre fevereiro e outubro de 2016. Os laboratórios foram convidados a responder um questionário sobre as diretrizes do Consenso, abordando aspectos técnicos, controle de qualidade, leitura das lâminas, emissão de laudos e programas educativos. O estudo contou com a participação de 53 laboratórios que, em conjunto, realizam uma estimativa de 300.000 FAN/mês. Foi identificada uma heterogeneidade em especialidades médicas solicitantes do teste e profissionais responsáveis pelo procedimento técnico e leitura das lâminas de fluorescência. As recomendações do Consenso estão sendo seguidas em sua totalidade por 58,5% dos laboratórios. Em relação ao procedimento técnico, 83,1% dos participantes fazem triagem com diluição 1:80 e o esgotamento de título, recomendado pelo Consenso, está sendo adotado por todos os participantes. Evidenciou-se que 39,6% dos participantes utilizam mais de uma marca de kit e que 22,6% realiza a titulação do conjugado a cada nova kit, e diferentes potências de lâmpadas são utilizadas nos laboratórios com predomínio das de 100 Watts. Em relação à leitura das lâminas, 94,3% afirmam observar os quatro compartimentos celulares, 92,5% afirmam classificar a placa metafásica cromossômica em negativa ou positiva e 32,1% dos participantes não afirmaram observar as células em todas as fases do ciclo celular. Na emissão de laudos, 13,2% dos laboratórios admitiram relatar somente o nome do padrão seguido pelo título, não apresentando o laudo descritivo e 24,5% dos participantes não utilizam programas de educação e controle de qualidade. A maioria dos laboratórios foi capaz de identificar imagens representativas de grupos de padrões. Os resultados aqui apresentados demonstram consistentes avanços a partir da implantação do Consenso de FAN no Brasil, porém, evidenciam também a necessidade de ações para implementação dos programas de educação continuada.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:25:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese Jozelia rego.pdf: 289983 bytes, checksum: 81f90ad780122cbecb664ab66f6306c0 (MD5) Previous issue date: 2009-12-17 / Autoimmune diseases are a clinical syndrome caused by the activation of T and/or B cells. They are multifactorial in nature and characterized by the presence of autoantibodies directed against cellular components. These autoantibodies can act as diagnostic markers or as predictors for these diseases. The ANA test is a very useful tool in the investigation of autoimmune diseases. OBJECTIVES: a) establishing a correlation between clinical diagnoses and fluorescence patterns in ANA tests on HEp-2 cells; b) determining the frequency of fluorescence patterns; c) establishing a correlation between clinical diagnosis and fluorescence titers; d) establishing possible correlations of changes in fluorescence patterns. CASES AND METHODS: All the ANA requests sent to the Immunorheumatology Laboratory of the Teaching Hospital of the Federal University of Goias, from January / 2000 to December / 2007 were analyzed and those with positive results were selected. For the ANA research, the investigator used the IFI technique and HEp-2 cells as substrate. To classify the fluorescence patterns decision trees proposed by the Brazilian Consensus for Standardization of ANA in HEp-2 cells were used. RESULTS: Among the 8,631 ANA requests, 1,167 presented positive results (13,52%). These positive tests were divided into two groups: Group I (tests requested in one occasion) and Group II (tests requested in more than one occasion). In Group I, nuclear patterns were more prevalent (89,41%). Speckled nuclear patterns were seen more frequently (78,81%), with special notice to fine speckled nuclear patterns (32,74%), coarse speckled nuclear patterns (29,86%) and fine dense speckled nuclear patterns (9,79%). Among the clinical diagnoses, rheumatic autoimmune diseases were the most prevalent (59,87%) and they correlated mostly with speckled nuclear patterns. A positive ANA was noted in 216 cases (34,67%) of non-immune conditions and in 22 cases (3,53%) of undetermined diagnosis. Cases with moderate (1:160) and high (1:640 and > 1:640) titers presented a high association with autoimmune diseases (54,25%; 73,23%; 83,91%, respectively). In Group II, the analytic clinical diagnosis and fluorescence titer factors showed a significant association with the change in the fluorescence pattern. CONCLUSIONS: 1) ANA was found to be positive in autoimmune (61,80%) and in non-autoimmune diseases (34,67%). 2) The most frequently found positive ANA correlation was seen with a diagnosis of lupus erythematosus (38,04%), mainly with coarse speckled nuclear pattern (32,91%), fine speckled nuclear pattern (25,73%), homogeneous nuclear pattern (19,40%) and fine dense speckled nuclear pattern (10,12%). 3) Nuclear patterns were more frequently found (89,41%), and among them, speckled patterns were prevalent (78,81%). 4) Low titers can be found in rheumatic autoimmune diseases and, therefore, can not be interpreted as an exclusion criteria for autoimmune disease, as long as there are clinical indications. 5) High titers can be found in non-autoimmune diseases and, therefore, can not be interpreted as specific to autoimmune diseases. 6) When the ANA test was requested in more than one occasion for the same patient, the clinical diagnosis (especially SLE) and the fluorescence titer (1:40 and 1:160) showed an association with the change of the fluorescence pattern. 7) A correct valuation of the ANA test should associate information from positive results to the clinical history and the physical examination of the patient when they are suggestive of an autoimmune disease, most notably, of rheumatic autoimmune diseases / As doenças autoimunes são síndromes clínicas causadas pela ativação de células T e/ou B, de origem multifatorial, caracterizadas pela presença de autoanticorpos dirigidos contra componentes celulares. Os autoanticorpos podem atuar como marcadores diagnósticos ou como marcadores preditores destas doenças. O teste de FAN é um exame útil na investigação de doenças autoimunes. OBJETIVOS: a) verificar a correlação entre os diagnósticos clínicos e os padrões de fluorescência na pesquisa de FAN em células HEp-2; b) determinar a freqüência dos padrões de fluorescência; c) verificar a correlação entre os diagnósticos clínicos e os títulos de fluorescência; d) verificar as possíveis correlações da mudança dos padrões de fluorescência. CASUÍSTICA E MÉTODOS: Foram analisadas todas as solicitações de FAN encaminhadas ao Laboratório de Imuno-Reumatologia do Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Goiás, durante o período de jan./ 2000 a dez./ 2007, e selecionadas as solicitações com resultados positivos. A pesquisa do FAN foi realizada pela técnica de IFI, utilizando-se como substrato células HEp-2. Para a classificação dos padrões de fluorescência utilizou-se as árvores de classificação definidas pelo I Consenso Nacional para padronização dos laudos de FAN em células HEp-2. RESULTADOS: Das 8631 solicitações de FAN, 1167 apresentaram resultados positivos (13,52%). Os testes positivos foram divididos em dois grupos: Grupo I (exames solicitados em uma ocasião) e Grupo II (exames solicitados em mais de uma ocasião). No Grupo I, os padrões encontrados em maior freqüência foram os nucleares (89,41%). Os padrões nucleares pontilhados foram observados em maior freqüência (78,81%), destacando-se os padrões nuclear pontilhado fino (32,74%), nuclear pontilhado grosso (29,86%) e nuclear pontilhado fino denso (9,79%). Dentre os diagnósticos clínicos descritos, as doenças autoimunes reumáticas foram observadas em maior freqüência (59,87%) e correlacionaram-se, principalmente, com os padrões nucleares pontilhados. FAN positivo foi observado em 216 casos (34,67%) de situações não-autoimunes e em 22 casos (3,53%) de diagnóstico não definido. Os casos com títulos moderados (1:160) e elevados (1:640 e > 1:640) apresentaram maior associação com enfermidades autoimunes (54,25%; 73,23%; 83,91%, respectivamente). No Grupo II, os fatores analíticos diagnóstico clínico e título de fluorescência mostraram associação significativa com a mudança do padrão de fluorescência. CONCLUSÕES: 1) A positividade do teste de FAN foi observada em doenças autoimunes (61,80%) e em doenças não-autoimunes (34,67%). 2) A correlação mais freqüente do FAN positivo foi observada com o diagnóstico de lupus eritematoso (38,04%), principalmente com os padrões nuclear pontilhado grosso (32,91%), nuclear pontilhado fino (25,73%), nuclear homogêneo (19,40%) e nuclear pontilhado fino denso (10,12%). 3) Os padrões nucleares foram observados em maior freqüência (89,41%), sendo os pontilhados os mais comuns (78,81%). 4) Títulos baixos podem ser encontrados em doenças autoimunes reumáticas e, portanto, não devem ser interpretados como critério para exclusão de doença autoimune, desde que exista suspeita clínica. 5) Títulos altos podem ser encontrados em doenças não-autoimunes e, portanto, não devem ser interpretados como específicos de doença autoimune. 6) Quando o teste de FAN foi solicitado em mais de uma ocasião, para o mesmo paciente, o diagnóstico clínico (principalmente de LES) e o título de fluorescência (1:40 e 1:160) mostraram associação com a mudança do padrão de fluorescência. 7) A valorização correta do teste de FAN deve associar as informações fornecidas pelo resultado positivo à história clínica e exame físico do paciente, quando sugestivos de doença autoimune, principalmente de doenças autoimunes reumáticas.

Orientador: José Mauricio Sforcin / Resumo: Própolis e seus compostos fenólicos são conhecidos por apresentarem propriedades antioxidantes e anticâncer. Recentemente, os mecanismos de ação da propolis têm sido objeto de investigação. Este estudo teve como objetivo elucidar os efeitos da própolis e três compostos fenólicos (ácido cafeico - Caf, ácido dihidrocinâmico - Cin; ácido p-cumárico - Cou) na mesma proporção que são encontrados em nossa amostra de própolis, isoladamente ou em combinação, sobre células de carcinoma epidermóide de laringe humano (HEp-2). A viabilidade celular, tipo de morte e parada do ciclo celular, geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) e a possível capacidade da própolis em induzir o efluxo de doxorrubicina (DOX) via inibidor de glicoproteína-P (P-gp) foram avaliadas. A própolis exerceu um efeito citotóxico em células HEp-2 e apresentaram um valor de IC50 igual a 80 µg/mL, enquanto que os compostos isolados (isoladamente ou em combinação) não mostraram efeito sobre a viabilidade celular após 72 h. Assim, concentrações mais elevadas destes compostos foram testadas e Caf (IC50: 1.332 µM) induziu necrose em células HEp-2, enquanto que a própolis induziu apoptose em células HEp-2, ambos, provavelmente devido à geração de ROS. A amostra de própolis induziu parada do ciclo celular na fase G2/M e Caf na fase S. Própolis ou seus componentes, com exceção de Caf, pode agir como um potencial inibidor de P-gp por modulação da atividade da P-gp, inibindo o efluxo de DOX. Sendo assim, os dados sugerir... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Propolis and its phenolic compounds are known for their antioxidant and anticancer properties. Propolis mechanisms of action have been the subject of research recently. This study aimed to elucidate the effects of propolis and three phenolic compounds (caffeic acid – Caf; dihydrocinnamic acid – Cin; p-coumaric acid – Cou) in the same proportion they are found in our propolis sample, alone or in combination, towards human larynx epidermoid carcinoma (HEp-2) cell. Cell viability, apoptosis/necrosis and cell cycle arrest, generation of reactive oxygen species (ROS) and the ability of propolis to induce doxorubicin (DOX) efflux using a P-glycoprotein (P-gp) inhibitor (verapamil) were assayed. Propolis exerted a cytotoxic effect in HEp-2 cells and exhibited an IC50 value of 80 µg/mL, whereas the isolated compounds (alone or in combination) had no effect on cell viability after 72 h. Hence, higher concentrations of these compounds were tested and Caf (IC50: 1.332 µM) induced necrosis in HEp-2 cells, while propolis induced apoptosis, both, probably due to ROS generation. Propolis induced cell cycle arrest at G2/M phase and, Caf at S phase. Propolis or its components, except Caf, can act as a P-gp inhibitor by modulating P-gp activity and inhibiting the efflux of DOX. Altogether, data suggested that propolis exerted cytotoxic effects against HEp-2 cells and some mechanisms are discussed. Its potential as an antitumor drug should be investigated in further assays. / Mestre

Orientador: Sérgio Nascimento Stampar / Resumo: Acredita-se que o filo Cnidaria seja um dos mais antigos a se ter presença de toxina, devido a sinapomorfia do grupo: cnidoblastos. O composto de toxinas presente nos Cnidaria apresenta uma gama de efeitos nocivos aos humanos, porem demonstram um grande potencial para uso médico, principalmente pelas suas capacidades citoliticas. Neste trabalho analisamos a capacidade citotóxica do extrato bruto do tentáculo de três espécies de Cnidaria (Os ceriantos Ceriantheomorphe brasiliensis e Pachycerianthus multiplicatus e a anêmona de mar Actinia bermudensis) em células MCF-7 e HEP-2, através de ensaios de MTT e imagens, onde o extrato bruto de Ceriantheomorphe brasiliensis apresentou uma IC50 de 50 ug/ml para células MCF-7, e o de Actinia bermudensis com uma IC50 de 120 ug/ml a 60 ug/ml para células MCF-7 e de 120 ug/ml a 30 ug/ml para células HEP-2. Estes resultados corroboram com os estudos já realizados na área, onde a presença de citolisinas na peçonha de alguns cnidários atua em células cancerígenas provocando morte celular, despontando como potenciais candidatos de origem natural para a produção de agentes que atuam no combate ao câncer. Os extratos brutos de Ceriantheomorphe brasiliensis e Actinia bermudensis induziram morte celular nas linhagens celulares, mas são necessários mais estudos afim de aferir a extensão dessa capacidade e o real potencial de ambos os extratos. / Mestre

Primäres Ziel von ICAP (internationaler Konsens für antinukleäre Antikörpermuster) ist es, einen Konsens zu finden zur Beschreibung der Fluoreszenzmuster, die mit indirekter Immunfluoreszenztechnik auf HEp-2-Zellen erkannt werden können. 28 Muster (14 Kern-, 9 zytoplasmatische und 5 mitotische Muster) wurden bisher definiert. Neben der Musterbeschreibung wurden alle Muster auch mit AC-Nummern gekennzeichnet, um eine von der Sprache unabhängige Vergleichbarkeit zu gewährleisten. Alle ICAP-Ergebnisse können von der ICAP-Internetseite (www.anapatterns.org) abgerufen werden. ICAP ist ein fortlaufender Prozess. Das nächste und 4. ICAP-Treffen wird im September 2017 im Rahmen des 13. Autoantikörpersymposiums in Dresden stattfinden (www.gfid-ev.de). Anstehende ICAP-Aufgaben sind die Ergänzung der Fluoreszenzmuster, die Erweiterung der Bildersammlung und die genauere Beschreibung der klinischen Bedeutung einzelner Muster.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A ocorrência de fenótipos multirresistentes de Corynebacterium pseudodiphtheriticum e sua associação a infecções graves, com elevada mortalidade em pacientes imunocomprometidos, aliados ao escasso conhecimento da virulência e patogenia destas infecções, motivou esta pesquisa, que teve como objetivo investigar mecanismos de virulência e resistência microbiana deste agente entre pacientes de um hospital universitário brasileiro. Um total de 113 amostras de C. pseudodiphtheriticum identificadas por métodos bioquímicos convencionais e sistema API-Coryne isoladas de pacientes de diferentes grupos etários. Os micro-organismos eram, em sua maioria, relacionados a infecções no trato respiratório (27,45%), urinário (29,20%) e sitios intravenosos (18,60%) e cerca de 32,70% das amostras foram provenientes de pacientes com pelo menos uma das condições predisponentes: insuficiência renal; transplante renal, tuberculose em paciente HIV+, câncer, cirrose hepática, hemodiálise e uso de cateter. As amostras testadas revelaram-se multirresistentes sendo a maioria resistente à oxacilina, eritromicina e clindamicina. A adesão das cepas ao poliestireno e ao poliuretano indicou o envolvimento de hidrofobicidade da superfície celular na fase inicial da formação de biofilmes. O crescimento subsequente conduziu à formação de microcolônias, agregados bacterianos densos incorporados na matriz exopolimérica rodeada por espaços vazios, típica de biofilmes maduros. Adicionalmente, a interação do micro-organismo com fibrinogênio e fibronectina humana indica o envolvimento destes componentes séricos na formação de biofilme, sugerindo a participação de diferentes adesinas neste processo e a capacidade deste agente formar biofilme in vivo. A afinidade por esses componentes e a formação de biofilme podem contribuir para o estabelecimento e disseminação da infecção no hospedeiro. Adicionalmente, as cepas de C. pseudodiphtheriticum isoladas de pacientes com infecções localizadas (ATCC10700/Pharyngitis) e sistêmicas (HHC1507/Bacteremia) exibiram um padrão de aderência agregativa-like a células HEp-2, caracterizado por aglomerados de bactérias com aparência de um "empilhado de tijolos". Através do teste FAS e ensaios de interação na presença de inibidores de citoesqueleto, demonstramos o envolvimento da polimerização de actina na internalização das cepas testadas. A internalização bacteriana e rearranjo do citoesqueleto pareceu ser parcialmente desencadeado pela ativação da tirosina-quinase. Finalmente, C. pseudodiphtheriticum foi capaz de sobreviver no ambiente intracelular e embora não tenha demonstrado capacidade de replicar intracelularmente, células HEp-2 foram incapazes de eliminar o patógeno completamente no ambiente extracelular no período de 24 horas. Todas as cepas estudadas foram capazes de induzir apoptose em células epiteliais 24 horas pós-infecção evidenciada pelo aumento significativo no número de células mortas e pela ocorrência de alterações nucleares reveladas através dos métodos de coloração pelo azul Trypan, pelo DAPI e microscopia electrônica de transmissão. Alterações morfológicas incluindo a vacuolização, a fragmentação nuclear e a formação de corpos apoptóticos foram observadas neste período. A citometria de fluxo demonstrou ainda uma diminuição significativa no tamanho das células infectadas e a utilização de dupla marcação (iodeto de propídio / anexina V) permitiu a detecção da ocorrência de necrose e apoptose tardia. Em conclusão, o conhecimento de tais características contribuiu para a compreensão de mecanismos envolvidos no aumento da frequência de infecções graves com elevada mortalidade em pacientes no ambiente hospitalar, por C. pseudodiphtheriticum, um patógeno rotineiramente subestimado em países em desenvolvimento. / The occurrence of multiresistant phenotypes and associated with severe infections, with high mortality in immunocompromised hosts due to Corynebacterium pseudodiphtheriticum, allied to little known about virulence and pathogenesis these infections, led to present investigation. The investigation aims to examine the virulence mechanisms and resistance to antimicrobial agents of C. pseudodiphtheriticum among patients with bacterial infections at a Brazilian teaching hospital. A total of 113 C. pseudodiphtheriticum strains identified by conventional biochemical methods and API-Coryne System were recovered from patients from different age groups. Micro-organisms were mostly related to infections in the respiratory tracts (27.45%), urinary (29.20%) and intravenous sites (18.60%) and approximately 32.70% samples were obtained of patients presenting at least one of the pre-disposing conditions: end-stage renal disease; renal transplant; AIDS and Mycobacterium tuberculosis infection; cancer, hepatic cirrhosis; haemodialysis and catheter use. Antimicrobial susceptibility tests identified multiresistant phenotypes. Most strains were resistant to oxacillin, erythromycin and clindamycin. Adherence to polystyrene and polyurethane indicated the involvement of cell surface hydrophobicity in the initial stage of biofilm formation. Further growth led to the formation of dense bacterial aggregates embedded in the exopolymeric matrix surrounded by voids, typical of mature biofilms. Data also showed C. pseudodiphtheriticum recognizing human fibrinogen (Fbg) and fibronectin (Fn) and involvement of these sera components in biofilm formation in conditioning films. These findings suggest that biofilm formation may be associated with the expression of different adhesins. C. pseudodiphtheriticum may form biofilm in vivo possibly by an adherent biofilm mode of growth in vitro currently demonstrated on hydrophilic and hydrophobic abiotic surfaces. The affinity to Fbg and Fn and the biofilm-forming ability may contribute to the establishment and dissemination of infection caused by C. pseudodiphtheriticum. Additionally, C. pseudodiphtheriticum strains isolated from patients with localized (ATCC10700/Pharyngitis) and systemic (HHC1507/Bacteremia) infections exhibited an aggregative adherence-like pattern to HEp-2 cells characterized by clumps of bacteria with a stacked-brick appearance. The fluorescent actin staining test demonstrated that actin polymerization is involved in the internalization of the C. pseudodiphtheriticum strains. Bacterial internalization and cytoskeletal rearrangement seemed to be partially triggered by the activation of tyrosine kinase activity. Although C. pseudodiphtheriticum strains did not demonstrate an ability to replicate intracellularly, HEp-2 cells were unable to fully clear the pathogen within 24 hours. All samples were able to induce apoptosis in HEp-2 cells 24 h post-infection, evidenced by significant increase in the number of dead cells and nuclear alterations were observed by the Trypan blue assay, DAPI and transmission electron microscopy. Morphological changes in HEp-2 cells observed 24 h post-infection included vacuolization, nuclear fragmentation and the formation of apoptotic bodies. Flow cytometry revealed an significant decrease in cell size of infected HEp-2 cells. Furthermore, a double-staining assay using Propidium Iodide/Annexin V gave information about the numbers of vital vs. early apoptotic cells and late apoptotic or secondary necrotic cells. In conclusion, these characteristics may contribute to understanding of mechanisms involved on increase of severe infection, with high mortality in nosocomial enviroment patients by C. pseudodiphtheriticum, a pathogen usually overlooked in emerging countries.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A ocorrência de fenótipos multirresistentes de Corynebacterium pseudodiphtheriticum e sua associação a infecções graves, com elevada mortalidade em pacientes imunocomprometidos, aliados ao escasso conhecimento da virulência e patogenia destas infecções, motivou esta pesquisa, que teve como objetivo investigar mecanismos de virulência e resistência microbiana deste agente entre pacientes de um hospital universitário brasileiro. Um total de 113 amostras de C. pseudodiphtheriticum identificadas por métodos bioquímicos convencionais e sistema API-Coryne isoladas de pacientes de diferentes grupos etários. Os micro-organismos eram, em sua maioria, relacionados a infecções no trato respiratório (27,45%), urinário (29,20%) e sitios intravenosos (18,60%) e cerca de 32,70% das amostras foram provenientes de pacientes com pelo menos uma das condições predisponentes: insuficiência renal; transplante renal, tuberculose em paciente HIV+, câncer, cirrose hepática, hemodiálise e uso de cateter. As amostras testadas revelaram-se multirresistentes sendo a maioria resistente à oxacilina, eritromicina e clindamicina. A adesão das cepas ao poliestireno e ao poliuretano indicou o envolvimento de hidrofobicidade da superfície celular na fase inicial da formação de biofilmes. O crescimento subsequente conduziu à formação de microcolônias, agregados bacterianos densos incorporados na matriz exopolimérica rodeada por espaços vazios, típica de biofilmes maduros. Adicionalmente, a interação do micro-organismo com fibrinogênio e fibronectina humana indica o envolvimento destes componentes séricos na formação de biofilme, sugerindo a participação de diferentes adesinas neste processo e a capacidade deste agente formar biofilme in vivo. A afinidade por esses componentes e a formação de biofilme podem contribuir para o estabelecimento e disseminação da infecção no hospedeiro. Adicionalmente, as cepas de C. pseudodiphtheriticum isoladas de pacientes com infecções localizadas (ATCC10700/Pharyngitis) e sistêmicas (HHC1507/Bacteremia) exibiram um padrão de aderência agregativa-like a células HEp-2, caracterizado por aglomerados de bactérias com aparência de um "empilhado de tijolos". Através do teste FAS e ensaios de interação na presença de inibidores de citoesqueleto, demonstramos o envolvimento da polimerização de actina na internalização das cepas testadas. A internalização bacteriana e rearranjo do citoesqueleto pareceu ser parcialmente desencadeado pela ativação da tirosina-quinase. Finalmente, C. pseudodiphtheriticum foi capaz de sobreviver no ambiente intracelular e embora não tenha demonstrado capacidade de replicar intracelularmente, células HEp-2 foram incapazes de eliminar o patógeno completamente no ambiente extracelular no período de 24 horas. Todas as cepas estudadas foram capazes de induzir apoptose em células epiteliais 24 horas pós-infecção evidenciada pelo aumento significativo no número de células mortas e pela ocorrência de alterações nucleares reveladas através dos métodos de coloração pelo azul Trypan, pelo DAPI e microscopia electrônica de transmissão. Alterações morfológicas incluindo a vacuolização, a fragmentação nuclear e a formação de corpos apoptóticos foram observadas neste período. A citometria de fluxo demonstrou ainda uma diminuição significativa no tamanho das células infectadas e a utilização de dupla marcação (iodeto de propídio / anexina V) permitiu a detecção da ocorrência de necrose e apoptose tardia. Em conclusão, o conhecimento de tais características contribuiu para a compreensão de mecanismos envolvidos no aumento da frequência de infecções graves com elevada mortalidade em pacientes no ambiente hospitalar, por C. pseudodiphtheriticum, um patógeno rotineiramente subestimado em países em desenvolvimento. / The occurrence of multiresistant phenotypes and associated with severe infections, with high mortality in immunocompromised hosts due to Corynebacterium pseudodiphtheriticum, allied to little known about virulence and pathogenesis these infections, led to present investigation. The investigation aims to examine the virulence mechanisms and resistance to antimicrobial agents of C. pseudodiphtheriticum among patients with bacterial infections at a Brazilian teaching hospital. A total of 113 C. pseudodiphtheriticum strains identified by conventional biochemical methods and API-Coryne System were recovered from patients from different age groups. Micro-organisms were mostly related to infections in the respiratory tracts (27.45%), urinary (29.20%) and intravenous sites (18.60%) and approximately 32.70% samples were obtained of patients presenting at least one of the pre-disposing conditions: end-stage renal disease; renal transplant; AIDS and Mycobacterium tuberculosis infection; cancer, hepatic cirrhosis; haemodialysis and catheter use. Antimicrobial susceptibility tests identified multiresistant phenotypes. Most strains were resistant to oxacillin, erythromycin and clindamycin. Adherence to polystyrene and polyurethane indicated the involvement of cell surface hydrophobicity in the initial stage of biofilm formation. Further growth led to the formation of dense bacterial aggregates embedded in the exopolymeric matrix surrounded by voids, typical of mature biofilms. Data also showed C. pseudodiphtheriticum recognizing human fibrinogen (Fbg) and fibronectin (Fn) and involvement of these sera components in biofilm formation in conditioning films. These findings suggest that biofilm formation may be associated with the expression of different adhesins. C. pseudodiphtheriticum may form biofilm in vivo possibly by an adherent biofilm mode of growth in vitro currently demonstrated on hydrophilic and hydrophobic abiotic surfaces. The affinity to Fbg and Fn and the biofilm-forming ability may contribute to the establishment and dissemination of infection caused by C. pseudodiphtheriticum. Additionally, C. pseudodiphtheriticum strains isolated from patients with localized (ATCC10700/Pharyngitis) and systemic (HHC1507/Bacteremia) infections exhibited an aggregative adherence-like pattern to HEp-2 cells characterized by clumps of bacteria with a stacked-brick appearance. The fluorescent actin staining test demonstrated that actin polymerization is involved in the internalization of the C. pseudodiphtheriticum strains. Bacterial internalization and cytoskeletal rearrangement seemed to be partially triggered by the activation of tyrosine kinase activity. Although C. pseudodiphtheriticum strains did not demonstrate an ability to replicate intracellularly, HEp-2 cells were unable to fully clear the pathogen within 24 hours. All samples were able to induce apoptosis in HEp-2 cells 24 h post-infection, evidenced by significant increase in the number of dead cells and nuclear alterations were observed by the Trypan blue assay, DAPI and transmission electron microscopy. Morphological changes in HEp-2 cells observed 24 h post-infection included vacuolization, nuclear fragmentation and the formation of apoptotic bodies. Flow cytometry revealed an significant decrease in cell size of infected HEp-2 cells. Furthermore, a double-staining assay using Propidium Iodide/Annexin V gave information about the numbers of vital vs. early apoptotic cells and late apoptotic or secondary necrotic cells. In conclusion, these characteristics may contribute to understanding of mechanisms involved on increase of severe infection, with high mortality in nosocomial enviroment patients by C. pseudodiphtheriticum, a pathogen usually overlooked in emerging countries.

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Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Corynebacterium diphtheriae pode ser isolado tanto de quadros de difteria clássica, quanto de infecções sistêmicas, como endocardite. O fibrinogênio (Fbn) e a fibronectina (Fn) são glicoproteínas presentes na matriz extracelular de tecidos conjuntivos. A influência destas proteínas na patogênese das infecções locais e invasivas causadas por C. diphtheriae é objeto de estudo devido ao fato do bacilo diftérico poder ser encontrado em lesões nas quais o Fbn e a Fn são predominantes, incluindo a pseudomembrana diftérica e vegetações cardíacas presentes na endocardite infecciosa. São crescentes as evidências de que o C. diphtheriae pode, além de aderir, ser internalizado por células em cultura. No presente estudo, investigou-se a participação de C. diphtheriae e das proteínas de superfície 67-72p na aderência à Fn e ao Fbn de plasma humano e a eritrócitos. A aderência às células HEp-2 e internalização também foram analisadas. A participação de 67-72p nos mecanismos de morte celular foi avaliada através das colorações por Azul de Tripan e 46-diamidino-2-fenil indol (DAPI), pelo ensaio de redução utilizando dimetil-tiazol-difenil tetrazólio (MTT) e por citometria de fluxo. As 67-72p foram extraídas da superfície da amostra toxigênica C. diphtheriae subsp. mitis CDC-E8392 através de processos mecânicos e precipitação com sulfato de amônio saturado. Análises por SDS-PAGE e immunoblotting detectaram a presença das bandas protéicas de 67 e 72kDa nas amostras toxinogênicas e atoxinogênicas analisadas, as quais pertenciam aos biotipos fermentador e não fermentador de sacarose. C. diphtheriae foi capazes não só de formar agregados na presença de plasma de coelho, mas também de converter Fbn em fibrina independentemente da presença do gene tox. No entanto, a amostra atoxinogênica ATCC 27010 (tox-) foi menos aderente ao Fbn do que a homóloga ATCC 27012 (tox+). A interação bacteriana com eritrócitos foi inibida somente pela Fn. Ligações entre Fn e/ou Fbn com 67-72p foram demonstradas por dot blotting, ELISA e/ou ensaios utilizando fluorescência. As 67-72p foram capazes de inibir as interações bacterianas com o Fbn, indicando que 67-72p podem participar do processo de aderência do patógeno aos tecidos do hospedeiro. Através da microscopia óptica, demonstrou-se a ligação de 67-72p adsorvidas em microesferas de látex com células HEp-2. Anticorpos de coelho do tipo IgG anti 67-72p interferiram somente com a expressão do padrão de aderência do tipo difuso, normalmente apresentado pela amostra CDC-E8392. A Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) e a inibição da internalização bacteriana pela IgG anti 67-72p ou por 67-72p indicaram o papel de 67-72p como invasina. Alterações do citoesqueleto de células HEp-2 com acumulação de actina polimerizada, induzida por microesferas sensibilizadas com 67-72p, foi observada pelo fluorescent actin staining (FAS) test. Foi visualizado um aumento no número de bactérias viáveis no compartimento intracelular após tratamento de células HEp-2 ou dos microrganismos com Fn. A presença de partículas de látex adsorvidas com 67-72p no interior de vacúolos frouxos em células HEp-2 sugeriu que estas proteínas podem causar efeito citotóxico. A avaliação através das colorações com Azul de Tripan, DAPI e os ensaios de redução utilizando MTT demonstraram um decréscimo na viabilidade de células tratadas com 67-72p. As mudanças morfológicas observadas 3 horas após o início do tratamento com 67-72p incluíram vacuolização, fragmentação nuclear e formação de corpúsculos apoptóticos. A citometria de fluxo revelou um decréscimo de 15,13% no volume/tamanho de células tratadas com 67-72p. Além disso, o ensaio utilizando Iodeto de Propídio (IP) e Anexina V (AV)-FITIC demonstrou que havia 66,1% de células vivas (IP-/AV-), 16,6% de células em apoptose inicial (IP-/AV+) e 13,8% de células em apoptose tardia ou necrose secundária. Em conclusão, as 67-72p estão diretamente envolvidas na interação com Fn e Fbn. As proteínas não fimbriais 67-72p são hemaglutininas implicadas na aderência a células respiratórias e na internalização. Além disso, estas proteínas podem atuar como fatores de virulência em potencial para induzir apoptose de células epiteliais nos estágios iniciais da difteria e nas infecções invasivas causadas pelo C. diphtheriae / Corynebacterium diphtheriae have been isolated from classical diphtheria and systemic infections such as endocarditis. Fibrinogen (Fbn) and fibronectin (Fn) are high molecular-weight glycoproteins that may be found in extracellular matrix of connective tissues. Their influence in the pathogenesis of local and in invasive C. diphtheriae infection is object of interest due to the fact that diphtheria bacilli is recovered from lesions where such proteins are predominant, including pharyngeal pseudomembrane and valve heart vegetations in infectious endocarditis. There is growing evidence that C. diphtheriae may adhere to and be internalized by cells in culture. The present study investigated the participation of C. diphtheriae strains and 67-72p, a surface protein, in adherence to human plasma Fn, Fbn, erythrocytes, adherence to and internalization by HEp-2 cells. The participation of 67-72p in promoting cell death was evaluated by the Trypan blue, DAPI staining methods, methylthiazole tetrazolium (MTT) reduction assay and flow cytometry. The 67-72p was extracted from C. diphtheriae subsp. mitis CDC-E8392 toxigenic strain, by mechanical process and ammonium sulfate fractionation. SDS-PAGE and immunoblotting analysis detected the polypeptide bands of 67 and 72 kDa in all toxigenic and nontoxigenic strains from both sucrose-fermenting and non-fermenting biotypes. Diphtheria bacilli were capable to both form bacterial aggregates in rabbit plasma and to convert Fbn to fibrin independently to the presence of tox gene, albeit the ATCC 27010 (tox-) strain was less adherent to Fbn than the parental strain ATCC 27012 (tox+). Bacteria-erythrocytes interaction was inhibited only by Fn. Interactions of Fn and/or Fbn with 67-72p were demonstrated by dot blotting, ELISA and/or fluorescence assays. Bacteria-Fbn interaction was inhibited by 67-72p, indicating that 67-72p may participate in the adhesion of the pathogen to host tissues. The interaction of HEp-2 cells with 67-72p-adsorbed latex microspheres was demonstrated by light microscopy. Rabbit IgG anti 67-72p was shown to interfere with diffuse adherence phenotype to HEp-2 cells displayed by CDC-E8392, but not by other phenotypes. Transmission electron microscopy (TEM) and the inhibition of bacterial internalization by anti 67-72p IgG and 67-72p indicated the role of 67-72p as invasin. Cytoskeletal accumulation of polymerized actin in HEp-2 cells induced by 67-72p-microspheres was observed by the fluorescent actin staining (FAS) test. Fn enhanced the intracellular viability of all strains tested. The presence of 67-72p-latex particles inside spacious vacuoles (SV) in HEp-2 cells, suggested a citotoxic effect of these proteins. Evaluation by the Trypan blue staining method, 4,6-Diamidine-2-phenylindole dihydrochloride DAPI and the 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) reduction assay showed a significant decrease in viability of HEp-2 cells treated with 0.2 mg/ml 67-72p. Morphological changes in HEp-2 cells (vacuolization, nuclear fragmentation, and the formation of apoptotic bodies) was observed after 3 h post-treatment with 67-72p. Flow cytometry revealed a 15.13% reduction apoptotic volume of HEp-2 cells treated with 0.2 mg/ml 67-72p. Moreover, a double-staining assay using Propidium Iodide (PI)/Annexin V (AV) demonstrated the numbers of vital (PI-/AV-) (66.1%) vs. early apoptotic (PI-/AV+) (16.6%) cells and late apoptotic or secondary necrotic cells (PI+/AV+) (13.8%). In conclusion, the 67-72p are directly implicated in C. diphtheriae interaction with Fn and Fbn. The non-fimbrial Fn/Fbn binding 67-72p are hemagglutinins directly implicated in adherence to and internalization by respiratory epithelial cells. Moreover, 67-72p may act as a potential virulence factor to induce apoptosis of epithelial cells in the early stages of diphtheria and C. diphtheriae invasive infection