Submitted by Cássio da Cruz Nogueira (cassionogueirakk@gmail.com) on 2017-10-18T11:31:52Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_CorrelacaoAvaliacaoClinica.pdf: 1829106 bytes, checksum: 7ba96ddbed6e4d2842124bbea7406567 (MD5) / Approved for entry into archive by Irvana Coutinho (irvana@ufpa.br) on 2017-11-03T12:43:42Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_CorrelacaoAvaliacaoClinica.pdf: 1829106 bytes, checksum: 7ba96ddbed6e4d2842124bbea7406567 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-11-03T12:43:42Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_CorrelacaoAvaliacaoClinica.pdf: 1829106 bytes, checksum: 7ba96ddbed6e4d2842124bbea7406567 (MD5) Previous issue date: 2012 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O vírus linfotrópico de células T humanas do tipo 1 (HTLV-1) e um retrovírus endêmico em várias regiões do mundo infectando cerca de 10 a 20 milhões de pessoas. Está associado a duas principais manifestações clínicas: a leucemia/linfoma de células T do adulto (LLcTA) e a paraparesia espástica tropical/mielopatia associado ao HTLV-1 (PET/MAH). Apenas 2 a 5% dos indivíduos infectados desenvolvem doenças associadas ao vírus, enquanto a maioria permanece assintomática. A PET/MAH é a manifestação clínica associada ao vírus mais comum. É uma doença inflamatória do sistema nervoso central e o mecanismo pelo qual o HTLV-1 induz o surgimento da PET/MAH ainda não está totalmente esclarecido. Esse vírus infecta preferencialmente as células CD4+, que possuem uma participação importante na resposta imunológica. Essa interação vírus-hospedeiro pode levar a um desequilíbrio da resposta imunológica, com produção aumentada de citocinas inflamatórias. Essa alteração na produção dessas citocinas está relacionada ao desenvolvimento da PET/MAH. Tendo em vista compreender melhor a fisiopatologia da PET/MAH, este trabalho visa analisar a resposta imunológica periférica e correlacioná-la com os sintomas clínicos desenvolvidos por esses pacientes, como espasticidade e fraqueza muscular, e, consequentemente, necessidade de auxílio na marcha. No presente estudo, avaliou-se 28 pacientes infectados por HTLV-1, sendo 8 indivíduos com PET/MAH e 20 indivíduos sem PET/MAH. A expressão gênica relativa das citocinas IFN-γ, IL-4, IL-5 e IL-10 para esses pacientes foram realizadas através de PCR em tempo real. De cada paciente foi coletada amostra de sangue periférico para a separação de células linfomononucleares, para posterior extração de RNA total utilizando o reagente Trizol. Em seguida o mRNA foi submetido a transcrição reversa para obtenção do cDNA. A quantificação das citocinas foi realizada no StepOnePlus (Applied Biosystem) com o reagente SybrGreen (Applied Biosystem). O cálculo da expressão foi feita com a fórmula 2-ΔCT, onde ΔCT e CTgene – CTgene constitutivo, sendo os genes constitutivos utilizados o GAPDH e β-actina. Os pacientes também foram avaliados clinicamente para espasticidade muscular através da escala de Ashworth Modificada, além do grau de força muscular e do auxílio na marcha. Os pacientes com PET/MAH apresentaram maior expressão gênica de IFN-γ (Mediana: 2,9 x 10- 3) em relação aos pacientes sem PET/MAH (Mediana: 1,1 x 10-3), sendo o p = 0,0710. Essa expressão aumentada de IFN-γ está positivamente relacionada com espasticidade (r = 0,2795), grau de fraqueza muscular (r = 0,6580) e auxílio de marcha (r = 0,7216). Outro dado importante foi que os pacientes com PET/MAH que utilizam cadeira de rodas apresentaram maior expressão de IFN-γ quando comparados aos indivíduos com PET/MAH que não utilizam cadeira de rodas (p = 0,0371). Os pacientes infectados por HTLV-1 que desenvolvem PET/MAH apresentam aumento da resposta Th1 em relação aos pacientes que não desenvolveram PET/MAH, e esse aumento de expressão de IFN-γ está relacionado com o desenvolvimento e progressão da doença. / Human T lymphotropic virus type 1 (HTLV-1) is an exogenous retrovirus that persistently infects 20–30 million people worldwide. This virus is etiologically related to the development of adult T-cell leukemia (ATL) and HTLV-1-associated myelopathy/tropical spastic paraparesis (HAM/TSP) a chronic disease of the central nervous system. The majority of HTLV-1-infected individuals remain lifelong asymptomatic carriers (ACs) of the virus. However, about 3-5% can develop ATL or HAM/TSP. The virus preferentially infects CD4+ T cells – main host cell of HTLV-1 – and rapidly induces cell activation and proliferation and expression of many host genes, including IFN-γ. The exact mechanism underlying these immunological and clinical events still remains unknown. In the current study, we evaluated the peripheral immune response and correlated with clinical symptoms like spasticity and weakness of the lower extremities, and gait abnormalities. 28 HTLV-1 infected patients were studied. Eight of them developed HAM/TSP and 20 were ACs. Total RNA was extracted from peripheric limphomononuclear cells using the TrizolR reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). The quantitative real-time PCR was performed to quantify IFN-γ, IL-4, IL-5 and IL-10. Total RNA (1μg) of each sample was subjected to reverse transcription with Superscript III (Invitrogen). Real-time PCR was performed in StepOne Plus (Applied Biosystems, Foster City, CA) and signal detection was obtained with the Sybr Green reagent (Applied Biosystems). The amount of mRNA in the sample was expressed as the relative amount to the GAPDH and β-actin genes, according to the formula 2-ΔCT, where ΔCT is CTgene – CThousekeeping. The clinical symptoms of each patient were examined. Spasticity was assessed on the Modified Ashworth Scale, the weakness of the lower limb was measured using a manual scale, and the gait was given scores to the devices that assist in gait. The HAM/TSP patients showed higher expression of IFN-γ (Median: 2,9 x 10-3) than Acs (Median: 1,1 x 10-3), with p = 0,0710. The IFN-γ expression was positively correlated to spasticity (r = 0,2795), weakness (r = 0,6580) and gait (r = 0,7216). Interestingly, patients who need wheelchairs had a higher IFN-γ expression than those who don’t need wheelchair (p = 0,0371). The HAM/TSP patients showed higher Th1 response than ACs. The higher IFN-γ expression is correlated with the development and progression of the HAM/TSP.

Plus de 20 million de personnes à travers le monde sont infectées par le virus T-lymphotrope humain de type 1 (HTLV-1), causant des leucémies à cellules T dans ~5 % des individus infectés. Le virus de la leucémie bovine (BLV), structurellement et fonctionnellement proche de HTLV-1, induit des leucémies à cellules B dans des modèles animaux suite à une infection naturelle (bovin) ou expérimentale (mouton). Les mécanismes moléculaires responsables du potentiel oncogène de ces deux virus restent largement incompris. Dans les deux maladies, leucémies T chez l’homme, leucémies B chez l’animal, le site intégration du virus dans les cellules leucémiques est très variable. Il est donc généralement admis que le potentiel oncogène du provirus est principalement lié à l’activité de l’oncoprotéine virale Tax. De manière paradoxale cependant, ni HTLV-1 ni BLV n’expriment de protéines virales au stade tumoral. Dans ce travail, nous avons étudié le transcriptome non codant des leucémies induites par BLV et HTLV-1 par séquençage à haut débit. Dans la première partie, nous démontrons que le provirus BLV n’est en fait pas silencieux dans les cellules tumorales. BLV produit un ensemble de dix microARNs (miRNAs) très abondants et extrêmement conservés dans toutes les tumeurs. Cette observation constitue la première description de miRNAs encodés par un rétrovirus. Les microARNs encodés par BLV sont transcrits par la RNA Polymérase III, stratégie qui permet leur production de façon indépendante de celle des messagers viraux ainsi que leur expression abondante dans le contexte tumoral caractérisé par l’absence d’activité RNA Polymérase II. Nous avons ensuite montré que, comme HTLV-1, BLV produit des transcrits encodés par le brin négatif du provirus. L’analyse par séquençage ARN à haut débit (RNA-Seq) de tumeurs induites par BLV montre l’absence d’expression virale à partir du promoteur viral situé dans le LTR 5’. Cependant, elle révèle la présence de deux transcrits viraux anti-sens non codants (AS1 et AS2) produits par le LTR 3’. Nous avons identifié ces transcrits dans toutes les tumeurs BLV analysées. Enfin, l’analyse RNA-Seq de tumeurs induites par HTLV-1 et BLV a révélé la présence d’interactions transcriptionnelles virus-hôte. Les gènes hôtes affectés sont significativement enrichis en gènes liés au cancer. Ces résultats suggèrent que les transcrits HTLV hbz et BLV AS1 jouent un rôle essentiel dans la tumorigenèse en interagissant avec le génome de l’hôte. Nous avons également détecté ce type de perturbation à des temps précoces dans le modèle expérimental BLV chez le mouton. Ces observations suggèrent que ces interactions virus-hôte constituent des événements précoces qui procurent un avantage sélectif aux clones associés, mais que d’autres altérations -génétiques et/ou épigenetiques- sont nécessaires à l’établissement de la tumeur. En conclusion, nos travaux vont permettre de mieux comprendre le rôle des interactions virus-génome hôte dans l’oncogenèse ainsi que la fonction de transcrits non codants dans le développement des cancers qu’ils soient ou non d’étiologie virale.<p><p>More than 20 million people are infected by Human T-cell Lymphotropic Virus type 1 (HTLV-1) worldwide and this will cause T-cell leukemia in 5% of them. Yet the molecular mechanisms that underlie the oncogenic potential of this virus remain largely unknown. Bovine Leukemia Virus (BLV) is closely related to HTLV1 and causes a very similar B-cell leukemia in cattle and sheep. As for HTLV1, the oncogenic mechanisms underlying BLV-induced leukemia remain poorly understood. In both diseases, leukemic cells harbor mainly one integrated provirus, yet the integration sites are very variable. As a consequence, it is generally assumed that the oncogenic effect of the provirus is largely mediated by the virally encoded Tax protein. Paradoxically, however, both HTLV1 and BLV proviruses are found to be epigenetically silenced in tumor cells. Thus Tax, as any other virally encoded protein, is not expressed in leukemic cells suggesting that other factors are involved in tumorigenesis. In this study we made three observations that might dramatically change the prevalent dogma of HTLV1 and BLV-induced leukemia. First, we demonstrated that the BLV provirus is not silent at all in tumor cells. A cluster of BLV-encoded microRNAs (miRNAs) is highly expressed, accounting for 40% of the miRNAs present in leukemic cells. This finding is the first description of retroviral-encoded miRNAs. BLV miRNAs are transcribed from five independent RNA Pol III units and are exceedingly conserved across BLV isolates (more than the protein coding genes), strongly supporting an essential yet still unknown function. Next we showed that – as HTLV1 – BLV strongly expresses antisense RNAs. High-throughput sequencing of RNA libraries (RNA-seq) from BLV associated tumors, as expected, showed no expression of viral mRNA from the 5’ LTR. However, it did reveal the presence of two novel non-coding antisense transcripts originating in the 3’ LTR of BLV. Finally, RNA-Seq analysis of HTLV-1 and BLV-induced tumors revealed that the viral 3’ LTR-driven antisense RNAs produced by both viruses interact with host genes localized in the vicinity of proviral integration. Enrichment analysis of affected host genes suggests a significant bias towards cancer-related genes. Host gene perturbations were also found at early stages post-infection in the BLV experimental model in sheep, suggesting that provirus-dependent cancer driver gene perturbations trigger initial amplification of the corresponding clones, requiring additional genetic and/or epigenetic changes to develop full blown leukemia. Overall, our findings reveal an unexpected role for BLV and HTLV antisense transcripts and contribute to the understanding of non-coding RNA-mediated mechanisms in leukemogenesis. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La protéine Tax du virus HTLV-1 a les propriétés d'un oncogène viral et joue un rôle important dans l'induction de la transformation cellulaire menant à l'ATL. L'activité oncogène de Tax résulte d'effets pléiotropes sur divers mécanismes cellulaires y compris l'activation de l'expression de gènes cellulaires spécifiques par la voie NF-&61547;B et la dérégulation de la progression du cycle cellulaire. Dans ce travail, nous avons mis en évidence que Tax est une protéine hautement modifiée dans diverses lignées cellulaires y compris dans les lymphocytes T transformés par HTLV-1. L'ensemble des modifications post-traductionnelles de Tax forment une suite hiérarchisée qui contrôlent la localisation intracellulaire de Tax, sa capacité d'activer les kinases IKK et la voie de signalisation des facteurs NF-&61547;B et sa capacité d'induire un arrêt dans la progression de la mitose. En effet, la phosphorylation de Tax contrôle son ubiquitination et son passage dans le noyau où elle est sumoylée et acétylée. L’ubiquitination et la sumoylation de Tax agissent de manière concertée pour permettre l’activation de l’expression des gènes par la voie NF-& / Doctorat en Sciences agronomiques et ingénierie biologique / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Le virus humain T lymphotrope de type 1 (HTLV-1) est l’agent étiologique de la leucémie/lymphome T de l’adulte (ATLL) qui se développe après plusieurs décennies et pour laquelle il n’existe à ce jour pas de traitement efficace. Parmi les protéines virales de HTLV-1, Tax et HBZ jouent un rôle déterminant dans le développement de l’ATLL. Si Tax participe au processus leucémogène dès les étapes précoces, HBZ jouerait plutôt un rôle dans le maintien du phénotype tumoral dans les étapes tardives. Dans ce contexte, là nous nous sommes intéressés à la régulation de l’expression des protéines anti-apoptotiques Bfl-1 et Bcl-xL, par les protéines virales Tax et HBZ. Nous avons montré que Tax induit l’expression des protéines anti-apoptotiques Bfl-1 et Bcl-xL de la famille Bcl-2 via la voie NF-κB, alors que HBZ n’a aucun effet sur leur expression. De plus, Tax coopère avec les facteurs de transcription c-Jun et JunD de la voie AP-1 pour augmenter l’expression de ces gènes anti-apoptotiques. En revanche, HBZ module uniquement la trans-activation de bfl-1 induite par Tax. L’ensemble de nos résultats indique donc que Tax joue un rôle prépondérant dans l’activation de l’expression de Bfl-1 et de Bcl-xL et suggère que Bfl-1 et Bcl-xL sont exprimées au cours des étapes précoces et tardives du développement de l’ATLL. Par une stratégie d’ARN interférence, nous avons ensuite montré que Bfl-1 et/ou Bcl-xL sont impliquées dans la survie de lignées cellulaires T infectées par HTLV-1, suggérant que Bfl-1 et Bcl-xL représentent des cibles thérapeutiques potentielles pour traiter l’ATLL. Actuellement, il existe des petites molécules ciblant les membres anti-apoptotiques de la famille Bcl-2, mais aucune ne cible spécifiquement Bfl-1. En collaboration avec la société IMAXIO, nous avons identifié par deux cribles à haut débit 83 molécules capables d’inhiber l’activité anti-apoptotique de Bfl-1. L’une de ces molécules induit spécifiquement la mort de lignées cellulaires T infectées par HTLV-1 pour lesquelles Bfl-1 représente un gène de survie. Ainsi, ce travail doit permettre à terme de développer de futurs médicaments dirigés contre Bfl-1 et de proposer une nouvelle stratégie thérapeutique ciblée contre l’ATLL / Human T lymphotropic virus type 1 (HTLV-1) is the etiological agent of adult T-cell leukemia/lymphoma (ATLL) that develops after several decades and for which there is no effective treatment. Among the viral proteins of HTLV-1, Tax and HBZ play a major role in the development of ATLL. If Tax participates in the initiation of leukemogenesis from the early stages, HBZ rather plays a role in maintaining the tumor phenotype in the late stages. The aims of our study were to better understand the regulation of Bfl-1 and Bcl-xL anti-apoptotic protein expression by Tax and HBZ viral proteins, as well as their role in the survival of HTLV-1-infected T-cells to propose new therapeutic strategies. We showed that Tax induces Bfl-1 and Bcl-xL expression via the NF-κB pathway, whereas HBZ has no effect on their expression. Tax also cooperates with c-Jun and JunD transcription factors of AP-1 family to increase the expression of these anti-apoptotic genes. By contrast, HBZ modulates the Tax-induced bfl-1 trans-activation. Altogether, our data indicate that Tax plays a key role in activating Bfl-1 and Bcl-xL expression and suggests that Bfl-1 and Bcl-xL are potentially expressed during the early and the late stages of ATLL development. Using short hairpin RNA strategy, we then showed that Bfl-1 and/or Bcl-xL are involved in HTLV-1-infected T-cell line survival, indicating that Bfl-1 and Bcl-xL represent potential therapeutic targets in the case of ATLL. One approach currently being developed in anti-cancer drug discovery is to search for small inhibitory compounds targeting anti-apoptotic proteins of the Bcl-2 family. But so far, no drug specifically targeting Bfl-1 is available. In collaboration with the IMAXIO Company, we have identified 83 molecules able to inhibit Bfl-1 anti-apoptotic activity using two high-throughput screening. One of these molecules specifically induced the death of HTLV-1-infected T-cell for which Bfl-1 represents a survival gene. This work provides new insight for long-term development of future drugs directed against Bfl-1 and should allow us to propose new therapeutic strategy for ATLL treatment