O presente trabalho teve por objetivo investigar a microbiota de canais radiculares relacionadas ao insucesso do tratamento endodôntico, buscando a identificação e a quantificação destes micro-organismos. Foram selecionados 36 dentes com infecção endodôntica persistente. O material obturador foi removido do canal radicular e amostras microbiológicas foram coletadas dos canais com o auxílio de limas tipo Hedströen e cones de papel absorvente estéril. A técnica do Checkerboard DNA-DNA hybridization foi utilizada para detecção de até 79 espécies bacterianas em cada amostra, utilizando sondas de DNA específicas. Os dados microbiológicos foram expressos em percentagem média (prevalência), proporção e nível médio de cada espécie em cada amostra. Os testes t independente e de correlação de Pearson foram usados para correlacionar a contagem das bactérias testadas com os dados clínicos (p&#8804; 0,05). Foi encontrada uma média de 11 espécies por amostra. E. faecium (36%), S. epidermidis (36%), E. saburreum (28%), P. micra (28%), S. sanguis (28%), C. sputigena (28%), L. buccalis (28%), E. faecalis (28%) e S. warneri (28%) foram as espécies mais prevalentes, e as espécies encontradas em níveis médios mais altos foram E. faecium, D. pneumosintes, S. epidermidis, H. pylori e C. sputigena. T. socranskii (3%), F. periodonticum (3%), C. gingivalis (3%), S. ixodetis (3%) apresentaram prevalências mais baixas. E. faecium e S. epidermidis apresentaram os maiores valores de prevalência, níveis médios e proporção. Não houve correlação entre a microbiota detectada nas amostras com os sinais e sintomas clínicos apresentados pelos pacientes, porém nas lesões periapicais de maior área foi detectada contagem significativamente maior de bacilos e espécies Gram-negativas (p<0,05). Baseado nos resultados obtidos é possível concluir que a microbiota presente em dentes com periodontite apical persistente possui perfil misto e complexo, e que uma maior área de lesão perirradicular pode estar associada a contagem elevada de bacilos e de espécies Gram-negativas. / The present study investigated the composition of the root canal microbiota in endodontic failures, aiming to identify and quantify these microorganisms. Thirty six teeth with persistent endodontic infection were selected. The root-filling materials were removed and microbiological samples were taken from the root canals with a Hedströen-type file and sterile paper points. The Checkerboard DNA-DNA hybridization technique was used for the detection of 79 bacterial species in each sample, using specific DNA probes. Microbiological data were express in mean prevalence, proportions and levels of each species in each sample. t independent test and Pearson correlation test were use to correlate bacterial counts and clinical conditions (p&#8804; 0,05). There were found a mean of 11 different species per sample. E. faecium (36%), S. epidermidis (36%), E. saburreum (28%), P. micra (28%), S. sanguis (28%), C. sputigena (28%), L. buccalis (28%), E. faecalis (28%) and S. warneri (28%) were the most prevalent species, and the species found in highest mean levels were E. faecium, D. pneumosintes, S. epidermidis, H. pylori and C. sputigena. T. socranskii (3%), F. periodonticum (3%), C. gingivalis (3%) and S. ixodetis (3%) were found in low prevalence. E. faecium and S. epidermidis presented the highest values of prevalence, means levels and proportions. No correlation was found between the detected microbiota and clinical findings; however in periapical lesions with highest areas, higher levels of rods and Gram-negative species were detected (p<0.05). Based on these results it may be concluded that the microbiota in teeth with persistent apical periodontitis presents a mixed and complex profile, and periapical lesions with larger area might be high associated with higher counts of rods and Gram-negative species.

O presente trabalho teve por objetivo investigar a microbiota de canais radiculares relacionadas ao insucesso do tratamento endodôntico, buscando a identificação e a quantificação destes micro-organismos. Foram selecionados 36 dentes com infecção endodôntica persistente. O material obturador foi removido do canal radicular e amostras microbiológicas foram coletadas dos canais com o auxílio de limas tipo Hedströen e cones de papel absorvente estéril. A técnica do Checkerboard DNA-DNA hybridization foi utilizada para detecção de até 79 espécies bacterianas em cada amostra, utilizando sondas de DNA específicas. Os dados microbiológicos foram expressos em percentagem média (prevalência), proporção e nível médio de cada espécie em cada amostra. Os testes t independente e de correlação de Pearson foram usados para correlacionar a contagem das bactérias testadas com os dados clínicos (p&#8804; 0,05). Foi encontrada uma média de 11 espécies por amostra. E. faecium (36%), S. epidermidis (36%), E. saburreum (28%), P. micra (28%), S. sanguis (28%), C. sputigena (28%), L. buccalis (28%), E. faecalis (28%) e S. warneri (28%) foram as espécies mais prevalentes, e as espécies encontradas em níveis médios mais altos foram E. faecium, D. pneumosintes, S. epidermidis, H. pylori e C. sputigena. T. socranskii (3%), F. periodonticum (3%), C. gingivalis (3%), S. ixodetis (3%) apresentaram prevalências mais baixas. E. faecium e S. epidermidis apresentaram os maiores valores de prevalência, níveis médios e proporção. Não houve correlação entre a microbiota detectada nas amostras com os sinais e sintomas clínicos apresentados pelos pacientes, porém nas lesões periapicais de maior área foi detectada contagem significativamente maior de bacilos e espécies Gram-negativas (p<0,05). Baseado nos resultados obtidos é possível concluir que a microbiota presente em dentes com periodontite apical persistente possui perfil misto e complexo, e que uma maior área de lesão perirradicular pode estar associada a contagem elevada de bacilos e de espécies Gram-negativas. / The present study investigated the composition of the root canal microbiota in endodontic failures, aiming to identify and quantify these microorganisms. Thirty six teeth with persistent endodontic infection were selected. The root-filling materials were removed and microbiological samples were taken from the root canals with a Hedströen-type file and sterile paper points. The Checkerboard DNA-DNA hybridization technique was used for the detection of 79 bacterial species in each sample, using specific DNA probes. Microbiological data were express in mean prevalence, proportions and levels of each species in each sample. t independent test and Pearson correlation test were use to correlate bacterial counts and clinical conditions (p&#8804; 0,05). There were found a mean of 11 different species per sample. E. faecium (36%), S. epidermidis (36%), E. saburreum (28%), P. micra (28%), S. sanguis (28%), C. sputigena (28%), L. buccalis (28%), E. faecalis (28%) and S. warneri (28%) were the most prevalent species, and the species found in highest mean levels were E. faecium, D. pneumosintes, S. epidermidis, H. pylori and C. sputigena. T. socranskii (3%), F. periodonticum (3%), C. gingivalis (3%) and S. ixodetis (3%) were found in low prevalence. E. faecium and S. epidermidis presented the highest values of prevalence, means levels and proportions. No correlation was found between the detected microbiota and clinical findings; however in periapical lesions with highest areas, higher levels of rods and Gram-negative species were detected (p<0.05). Based on these results it may be concluded that the microbiota in teeth with persistent apical periodontitis presents a mixed and complex profile, and periapical lesions with larger area might be high associated with higher counts of rods and Gram-negative species.

Hybridization is an important phenomenon in plant evolution because it is one of the sources of new genetic variability. Hybridization is the merging of genomes of formerly isolated evolutionary lineages. In many taxonomic groups, the detection of plants of hybrid origin is challenging. A wide spectrum of methods for their detection has been employed since the beginning of botanical research. The introduction of genomic in situ hybridization has had a great impact on the study plants of hybrid origin. This molecular cytogenetic approach allows to reveal the genomic contributions of particular parental species to hybrid taxa. The tribe Triticeae is a prime example of a group whose present-day diversity has been strongly influenced by hybridization (together with polyploidy). The majority of its species are allopolyploids resulting from frequent interspecific and intergeneric hybridization. The structure of relationships within the tribe is therefore highly reticulate. This thesis includes three papers dealing with the hybrid complex of Elytrigia repens - E. ×mucronata - E. intermedia: (1) The representatives of this hybrid complex are morphologically poorly differentiated, and only two morphological characters are used to their distinguishing. Among anatomical characters on the leaf blade, some...

Paracoccidioides brasiliensis, um fungo termodimórfico, é o agente causador da paracoccidioidomicose (PCM), a micose sistêmica prevalente da América Latina. A patogenicidade aparenta estar intimamente relacionada com a transição dimórfica da forma de micélio para a de levedura, que é induzida pela mudança da temperatura do ambiente pela temperatura do hospedeiro mamífero. Há poucas informações disponíveis sobre genes de P. brasiliensis que são necessários durante a fase patogênica. Nós, então, realizamos as técnicas de SSH (“Suppression Subtraction Hybridization") e de “Macroarray" com o objetivo de identificar genes que sejam preferencialmente expressos na fase leveduriforme do isolado Pb18. Genes identificados em ambos os procedimentos estão mais expressos na fase leveduriforme e estão envolvidos em metabolismo básico, transdução de sinal, crescimento e morfogênese e metabolismo do enxofre. Para testar se as mudanças observadas na expressão gênica refletem as diferenças entre as condições de crescimento usadas para obter as duas formas morfológicas preferivelmente às diferenças intrínsecas dos tipos celulares, nós realizamos experimentos com RT-PCR em tempo real utilizando preparações de RNA derivadas de ambas as fases, micélio e levedura, crescidas a 26°C e 37°C nos meios de cultura completos (YPD e Sabouraud) e meio mínimo. Vinte genes, incluindo AGS1 ( -1,3-glucan synthase) e TSA1 (thiol-specific antioxidant), foram mostrados como mais expressos na levedura patogênica em relação ao micélio. Embora a expressão de RNA mensageiro foi bastante diferente em relação aos meios completos e meio mínimo, mostramos uma tendência geral para que esses genes serem mais expressos nas células leveduriformes patogênicas de P.x brasiliensis. Além disso, mostramos a complementação dos genes METR e SCONC de P. brasiliensis e uma cepa com estes genes deletados de Aspergillus nidulans, sugerindo uma possível homologia entre eles. Mostramos também a análise de genes da via do metabolismo do enxofre foram mais expressos na levedura patogênica de P. brasiliensis em relação ao micélio saprofítico. / Paracoccidioides brasiliensis, a thermodimorphic fungus, is the causative agent of paracoccidioidomycosis (PCM), a prevalent systemic mycosis in Latin America. Pathogenicity appears to be intimately related to the dimorphic transition from the hyphal to the yeast form, which is induced by a shift from environmental temperature to the temperature of the mammalian host. Little information is available on the P. brasiliensis genes necessary during the pathogenic phase. We have therefore undertaken Suppression Subtraction Hybridization (SSH) and macroarray analyses with the aim of identifying genes that are preferentially expressed in the yeast phase. Genes identified by both procedures as being more highly expressed in the yeast phase are involved in basic metabolism, signal transduction, growth and morphogenesis, and sulfur metabolism. In order to test whether the observed changes in gene expression reflect the differences between the growth conditions used to obtain the two morphological forms rather than differences intrinsic to the cell types, we performed real-time RT-PCR experiments using RNA derived from both yeast cells and mycelia that had been cultured at 37 and 26°C in either complete medium (YPD or Sabouraud) or minimal medium. Twenty genes, including AGS1 ( 1,3-glucan synthase) and TSA1 (thiol-specific antioxidant), were shown to be more highly expressed in the yeast cells than in the hyphae. Although their levels of expression could be different in rich and minimal media, there was a general tendency for these genes to be more highly expressed in the yeast cells. Moreover, complementation of P. brasiliensis METR and SCONC genes in strains of Aspergillus nidulans with these genes deleted suggested a possible homology between them. We show the analyses of genes involved in the xii sulphur metabolism pathway and these genes were more expressed in the pathogenic yeast than saprophytic mycelia of P. brasiliensis.

O objetivo do presente estudo clínico randomizado foi avaliar in vivo, por meio da técnica de biologia molecular Checkerboard DNA-DNA Hybridization: 1) A contaminação de aparelhos ortodônticos removíveis por 40 espécies bacterianas; 2) A eficácia da utilização do gluconato de clorexidina a 0,12% (Periogard®) sobre microrganismos cariogênicos; e 3) A eficácia da utilização do gluconato de clorexidina a 0,12% (Periogard®) sobre microrganismos periodontopatogênicos dos complexos laranja e vermelho. Participaram do estudo 20 pacientes de 7 a 11 anos de idade, em tratamento com aparelhos ortodônticos removíveis. O estudo constou de 2 etapas, com intervalo de 15 dias entre cada uma, de forma que todos os pacientes participassem tanto do grupo controle, quanto do grupo experimental. Em cada etapa os pacientes receberam um novo aparelho (totalizando 2 aparelhos por indivíduo) e um frasco plástico contendo a solução a ser borrifada sobre os aparelhos, porém os indivíduos não sabiam qual solução estavam utilizando. Os aparelhos foram utilizados em período integral, inclusive à noite, sendo removidos apenas durante as refeições Os pacientes do Grupo Controle foram orientados a usar solução placebo, sob a forma de spray, 2 vezes por semana, por 7 dias. Os pacientes do Grupo Experimental foram orientados a usar solução à base de gluconato de clorexidina a 0,12% (Periogard®) sob a forma de spray, da mesma forma que o grupo Controle. Decorridos 7 dias, os aparelhos de cada etapa foram removidos e processados para detecção de 40 espécies bacterianas, incluindo microrganismos cariogênicos e periodontopatogênicos, pela técnica Checkerboard DNA-DNA Hybridization. Os resultados obtidos foram analisados por meio do teste não-paramétrico de Wilcoxon, utilizando o software SAS (Statistical Analysis System). O nível de significância adotado foi de 5%. De acordo com os resultados obtidos observou-se que os aparelhos ortodônticos removíveis dos pacientes do grupo controle estavam densamente contaminados pelos microrganismos avaliados. A maioria das sondas utilizadas estava presente nas amostras desse grupo, sendo que S. sanguinis, S. oralis, S. gordonii e E. corrodens ocorreram em 100% dos aparelhos. Dentre os microrganismos cariogênicos, S. mutans e S. sobrinus foram encontrados em maiores quantidades que L. acidophilus e L. casei. As bactérias periodontopatogênicas pertencentes ao complexo vermelho foram evidenciadas em maiores quantidades que as pertencentes ao complexo laranja. Dentre os demais complexos não associados com patologias específicas, o complexo roxo apresentou-se em maiores quantidades, estando presente em 34% das amostras. Após o uso de spray com gluconato de clorexidina a 0,12%, observou-se uma diminuição significante dos microrganismos cariogênicos (S.mutans e S. sobrinus e L. acidophilus) nos aparelhos ortodônticos removíveis (p<0,05). Observou-se também uma diminuição significante de todos os microrganismos periodontopatogênicos dos complexos laranja e vermelho (p<0,05), em relação ao grupo controle, com exceção apenas do T. socranskii. Conclui-se que os aparelhos ortodônticos removíveis encontraram-se multicolonizados por diversas espécies bacterianas e que a clorexidina, utilizada duas vezes por semana sob a forma de spray, foi eficaz na redução dos níveis de microrganismos cariogênicos e periodontopatogênicos dos complexos laranja e vermelho, nesses aparelhos. / Using the Checkerboard DNA-DNA Hybridization biomolecular technique, this randomized clinical study evaluated: 1) the contamination of removable orthodontic appliances by 40 bacterial species; 2) the efficacy of 0.12% chlorhexidine gluconate (Periogard®) spray against cariogenic microorganisms;and 3) the efficacy of 0.12% chlorhexidine gluconate spray against periodontopathogenic microorganisms of the orange and red complexes. Twenty 7-11-year-old patients under treatment with removable orthodontic appliances were enrolled. The study had two phases, with a 15-day interval between them, in such a way that patients participated both in the control and in the experimental group. In each phase, the patients received a new appliance (total of 2 appliances per patient) and a bottle containing a solution to be sprayed onto the appliances, but they were blinded to whether it was a placebo solution or an antimicrobial agent. The patients were instructed to wear the appliances full-time, even at night, removing only at meals. The patients in the control and experimental groups were instructed to spray the placebo or the 0.12% chlorhexidine gluconate-based solution (Periogard®), respectively, onto the appliances twice a week during 7 days. After this period, the appliances of each phase were collected and processed for detection of 40 bacterial species, including cariogenic and periodontopathogenic microorganisms by the Checkerboard DNA-DNA Hybridization technique. Data were analyzed statistically by the non-parametric Wilcoxon test using the SAS software (Statistical Analysis System) at 5% significance level. The results showed that the removable orthodontic appliances of the patients in the control group were heavily contaminated by the target microorganisms. Most bacterial probes used were present in the control samples, S. sanguinis, S. oralis, S. gordonii and E. corrodens being detected in 100% of the appliances. Among the cariogenic microorganisms, S. mutans and S. sobrinus were found in larger numbers than L. acidophilus and L. casei. The number of red complex periodontopathogenic bacteria was larger than that of orange complex periodontopathogenic bacteria. Among the other bacterial complexes not associated with specific pathologies, purple complex bactéria were present in larger numbers, being detected in 34% of the samples. After use of the 0.12% chlorhexidine gluconate spray, the number of the cariogenic microorganisms (S.mutans, S. sobrinus and L. acidophilus) decreased significantly in the removable orthodontic appliances (p<0,05). There was also a significant decrease in the numbers of all periodontopathogenic microorganisms of the orange and red complexes (p<0,05), compared to the control group, except for T. socranskii. In conclusion, the removable orthodontic appliances were multicolonized by several bacterial species, and the use of chlorhexidine spray twice a week was effective in reducing the levels of cariogenic and periodontopathogenic microorganisms of the orange and red complexes.

Flowers from members of the genus Leucadendron have colourful bracts and long vase life that make them highly desirable cut-flowers. Breeding programs based on interspecific hybridization would encounter difficulty if pre- or post-fertilization barriers exist in the distant crosses. Embryo rescue is one of the commonly used approaches to overcome post-fertilization barriers in wide hybridization. In this study, intersectional and intersubsectional hybridization of Leucadendron was attempted. Observation of pollen-pistil interactions revealed that post-zygotic rejection was the main reason for the incompatibility of the crosses, therefore embryo rescue was adopted and a protocol was developed to raise the hybrids. To better understand the genome structure in the genus, karyotypes of selected species were analyzed. Chromosome examination indicated that all (27) Leucadendron species examined were diploid and had a chromosome number of 2n = 26. The chromosomes were small in size and had predominantly median to submedian centromeres. The karyotypes of the species were rather symmetrical and seemed to be primitive according to Stebbins' karyotype classification. DNA based PCR-RFLP and RAMP markers were developed to identify Leucadendron hybrids at an early age. RAMP analysis showed more discrimination in identifying Leucadendron hybrids than did PCR-RFLP. The occurrence of PCR recombination also proved to be a troublesome issue when using the PCR-RFLP method, whereas the clarity of the interpretion of the RAMP method was not influenced by PCR recombination. Interspecific hybridization in a breeding program can provide valuable information on grouping of the species for systematic purposes. Regression analysis between cross success rate and cpDNA character difference revealed that there was a highly significant correlation between them. Patterns of success for intersectional hybridizations in Leucadendron were generally consistent with current taxonomic hypotheses regarding the sectional division of the genus. Success was generally lower for intersectional crosses than for intrasectional crosses.

Paracoccidioides brasiliensis, um fungo termodimórfico, é o agente causador da paracoccidioidomicose (PCM), a micose sistêmica prevalente da América Latina. A patogenicidade aparenta estar intimamente relacionada com a transição dimórfica da forma de micélio para a de levedura, que é induzida pela mudança da temperatura do ambiente pela temperatura do hospedeiro mamífero. Há poucas informações disponíveis sobre genes de P. brasiliensis que são necessários durante a fase patogênica. Nós, então, realizamos as técnicas de SSH (“Suppression Subtraction Hybridization”) e de “Macroarray” com o objetivo de identificar genes que sejam preferencialmente expressos na fase leveduriforme do isolado Pb18. Genes identificados em ambos os procedimentos estão mais expressos na fase leveduriforme e estão envolvidos em metabolismo básico, transdução de sinal, crescimento e morfogênese e metabolismo do enxofre. Para testar se as mudanças observadas na expressão gênica refletem as diferenças entre as condições de crescimento usadas para obter as duas formas morfológicas preferivelmente às diferenças intrínsecas dos tipos celulares, nós realizamos experimentos com RT-PCR em tempo real utilizando preparações de RNA derivadas de ambas as fases, micélio e levedura, crescidas a 26°C e 37°C nos meios de cultura completos (YPD e Sabouraud) e meio mínimo. Vinte genes, incluindo AGS1 ( -1,3-glucan synthase) e TSA1 (thiol-specific antioxidant), foram mostrados como mais expressos na levedura patogênica em relação ao micélio. Embora a expressão de RNA mensageiro foi bastante diferente em relação aos meios completos e meio mínimo, mostramos uma tendência geral para que esses genes serem mais expressos nas células leveduriformes patogênicas de P.x brasiliensis. Além disso, mostramos a complementação dos genes METR e SCONC de P. brasiliensis e uma cepa com estes genes deletados de Aspergillus nidulans, sugerindo uma possível homologia entre eles. Mostramos também a análise de genes da via do metabolismo do enxofre foram mais expressos na levedura patogênica de P. brasiliensis em relação ao micélio saprofítico. / Paracoccidioides brasiliensis, a thermodimorphic fungus, is the causative agent of paracoccidioidomycosis (PCM), a prevalent systemic mycosis in Latin America. Pathogenicity appears to be intimately related to the dimorphic transition from the hyphal to the yeast form, which is induced by a shift from environmental temperature to the temperature of the mammalian host. Little information is available on the P. brasiliensis genes necessary during the pathogenic phase. We have therefore undertaken Suppression Subtraction Hybridization (SSH) and macroarray analyses with the aim of identifying genes that are preferentially expressed in the yeast phase. Genes identified by both procedures as being more highly expressed in the yeast phase are involved in basic metabolism, signal transduction, growth and morphogenesis, and sulfur metabolism. In order to test whether the observed changes in gene expression reflect the differences between the growth conditions used to obtain the two morphological forms rather than differences intrinsic to the cell types, we performed real-time RT-PCR experiments using RNA derived from both yeast cells and mycelia that had been cultured at 37 and 26°C in either complete medium (YPD or Sabouraud) or minimal medium. Twenty genes, including AGS1 ( 1,3-glucan synthase) and TSA1 (thiol-specific antioxidant), were shown to be more highly expressed in the yeast cells than in the hyphae. Although their levels of expression could be different in rich and minimal media, there was a general tendency for these genes to be more highly expressed in the yeast cells. Moreover, complementation of P. brasiliensis METR and SCONC genes in strains of Aspergillus nidulans with these genes deleted suggested a possible homology between them. We show the analyses of genes involved in the xii sulphur metabolism pathway and these genes were more expressed in the pathogenic yeast than saprophytic mycelia of P. brasiliensis.

O objetivo do presente estudo clínico randomizado foi avaliar in vivo, por meio da técnica de biologia molecular Checkerboard DNA-DNA Hybridization: 1) A contaminação de aparelhos ortodônticos removíveis por 40 espécies bacterianas; 2) A eficácia da utilização do gluconato de clorexidina a 0,12% (Periogard®) sobre microrganismos cariogênicos; e 3) A eficácia da utilização do gluconato de clorexidina a 0,12% (Periogard®) sobre microrganismos periodontopatogênicos dos complexos laranja e vermelho. Participaram do estudo 20 pacientes de 7 a 11 anos de idade, em tratamento com aparelhos ortodônticos removíveis. O estudo constou de 2 etapas, com intervalo de 15 dias entre cada uma, de forma que todos os pacientes participassem tanto do grupo controle, quanto do grupo experimental. Em cada etapa os pacientes receberam um novo aparelho (totalizando 2 aparelhos por indivíduo) e um frasco plástico contendo a solução a ser borrifada sobre os aparelhos, porém os indivíduos não sabiam qual solução estavam utilizando. Os aparelhos foram utilizados em período integral, inclusive à noite, sendo removidos apenas durante as refeições Os pacientes do Grupo Controle foram orientados a usar solução placebo, sob a forma de spray, 2 vezes por semana, por 7 dias. Os pacientes do Grupo Experimental foram orientados a usar solução à base de gluconato de clorexidina a 0,12% (Periogard®) sob a forma de spray, da mesma forma que o grupo Controle. Decorridos 7 dias, os aparelhos de cada etapa foram removidos e processados para detecção de 40 espécies bacterianas, incluindo microrganismos cariogênicos e periodontopatogênicos, pela técnica Checkerboard DNA-DNA Hybridization. Os resultados obtidos foram analisados por meio do teste não-paramétrico de Wilcoxon, utilizando o software SAS (Statistical Analysis System). O nível de significância adotado foi de 5%. De acordo com os resultados obtidos observou-se que os aparelhos ortodônticos removíveis dos pacientes do grupo controle estavam densamente contaminados pelos microrganismos avaliados. A maioria das sondas utilizadas estava presente nas amostras desse grupo, sendo que S. sanguinis, S. oralis, S. gordonii e E. corrodens ocorreram em 100% dos aparelhos. Dentre os microrganismos cariogênicos, S. mutans e S. sobrinus foram encontrados em maiores quantidades que L. acidophilus e L. casei. As bactérias periodontopatogênicas pertencentes ao complexo vermelho foram evidenciadas em maiores quantidades que as pertencentes ao complexo laranja. Dentre os demais complexos não associados com patologias específicas, o complexo roxo apresentou-se em maiores quantidades, estando presente em 34% das amostras. Após o uso de spray com gluconato de clorexidina a 0,12%, observou-se uma diminuição significante dos microrganismos cariogênicos (S.mutans e S. sobrinus e L. acidophilus) nos aparelhos ortodônticos removíveis (p<0,05). Observou-se também uma diminuição significante de todos os microrganismos periodontopatogênicos dos complexos laranja e vermelho (p<0,05), em relação ao grupo controle, com exceção apenas do T. socranskii. Conclui-se que os aparelhos ortodônticos removíveis encontraram-se multicolonizados por diversas espécies bacterianas e que a clorexidina, utilizada duas vezes por semana sob a forma de spray, foi eficaz na redução dos níveis de microrganismos cariogênicos e periodontopatogênicos dos complexos laranja e vermelho, nesses aparelhos. / Using the Checkerboard DNA-DNA Hybridization biomolecular technique, this randomized clinical study evaluated: 1) the contamination of removable orthodontic appliances by 40 bacterial species; 2) the efficacy of 0.12% chlorhexidine gluconate (Periogard®) spray against cariogenic microorganisms;and 3) the efficacy of 0.12% chlorhexidine gluconate spray against periodontopathogenic microorganisms of the orange and red complexes. Twenty 7-11-year-old patients under treatment with removable orthodontic appliances were enrolled. The study had two phases, with a 15-day interval between them, in such a way that patients participated both in the control and in the experimental group. In each phase, the patients received a new appliance (total of 2 appliances per patient) and a bottle containing a solution to be sprayed onto the appliances, but they were blinded to whether it was a placebo solution or an antimicrobial agent. The patients were instructed to wear the appliances full-time, even at night, removing only at meals. The patients in the control and experimental groups were instructed to spray the placebo or the 0.12% chlorhexidine gluconate-based solution (Periogard®), respectively, onto the appliances twice a week during 7 days. After this period, the appliances of each phase were collected and processed for detection of 40 bacterial species, including cariogenic and periodontopathogenic microorganisms by the Checkerboard DNA-DNA Hybridization technique. Data were analyzed statistically by the non-parametric Wilcoxon test using the SAS software (Statistical Analysis System) at 5% significance level. The results showed that the removable orthodontic appliances of the patients in the control group were heavily contaminated by the target microorganisms. Most bacterial probes used were present in the control samples, S. sanguinis, S. oralis, S. gordonii and E. corrodens being detected in 100% of the appliances. Among the cariogenic microorganisms, S. mutans and S. sobrinus were found in larger numbers than L. acidophilus and L. casei. The number of red complex periodontopathogenic bacteria was larger than that of orange complex periodontopathogenic bacteria. Among the other bacterial complexes not associated with specific pathologies, purple complex bactéria were present in larger numbers, being detected in 34% of the samples. After use of the 0.12% chlorhexidine gluconate spray, the number of the cariogenic microorganisms (S.mutans, S. sobrinus and L. acidophilus) decreased significantly in the removable orthodontic appliances (p<0,05). There was also a significant decrease in the numbers of all periodontopathogenic microorganisms of the orange and red complexes (p<0,05), compared to the control group, except for T. socranskii. In conclusion, the removable orthodontic appliances were multicolonized by several bacterial species, and the use of chlorhexidine spray twice a week was effective in reducing the levels of cariogenic and periodontopathogenic microorganisms of the orange and red complexes.

Fluorescenční in situ hybridizace (FISH) je široce používaná metoda pro detekci určité sekvence DNA na chromozomech. Cílem práce je porovnání tří různých chemických sloučenin (formamidu, ethylenkarbonátu a sodných kationtů) používaných ve směsích pro in situ hybridizaci. Složení těchto směsí ovlivňuje renaturaci DNA a je důležité porovnat jejich fyzikální vlastnosti. Práce je rozdělena do dvou hlavních částí. První část se zabývá otázkou termodynamických parametrů používaných pro experimenty FISH, jako je teplota tání, entalpie přechodu DNA ze dvoušroubovice na vlákno nám dává přehled o energii potřebné k tomto přechodu a interakcích mezi bázemi a každou složkou směsi. Kromě toho hodnoty entropie určují poř uvnitř směsi - systém DNA. Druhá část porovnává intenzitu fluorescenčního signálu při optimalizovaných teplotách tání sondy použité pro in situ hybridizaci. Jako sonda byla použita sub-telomerní repetice X43.1, která je umístěna na Y chromozomu rostlinného modelového organismu Silene latifolia. Směs obsahující formamid má nejlepší výkon při delším postupu hybridizace, zatímco ethylenkarbonát poskytuje vyšší intenzitu signálu, a proto je vhodnější pro rychlé FISH protokoly.

Indiana University Purdue University Indianapolis / Human papillomaviruses (HPV) are the etiologic agents of most cervical dysplasia and all cervical carcinoma. Integration of high risk HPV into the human genome is thought to be a critical event in the progression from cervical dysplasia to invasive cervical carcinoma. The ability to use molecular assays in the detection and evaluation of HPV integration is essential in informing clinical models for early intervention and therapies. We therefore sought to determine the feasibility of real time-PCR (RT-PCR) as a molecular tool in detecting the physical state, episomal versus integration of HPV 16 and 18 DNA in cervical cancers. Tyramide amplified fluorescent DNA in situ hybridization (FISH) was used to look for evidence of HPV 16/18 integration using formalin-fixed, paraffin-embedded sections of cervical carcinomas. RT-PCR used the ratio of the E2 and E6 genes as a surrogate for determining the physical state of HPV 16 and 18 in 35 infected tissues. Results of RT-PCR showed that 16 cervical specimens (45.7%) contained episomal HPV, 17 cervical samples (48.6%) harbored the integrated form of HPV DNA, and 2 samples (5.7 %) contained both integrated and episomal forms of HPV. Results of the two assays were compared in 25 cervical carcinomas. For 13 of the 25 cervical samples there was an agreement in determining the physical state of HPV. RT-PCR, using the E2/E6 ratio as an assay for HPV integration appears to be promising and may prove to be an essential clinical method in the future.