Células de combustível microbianas despertaram interesse nos últimos anos devido à aplicação em tratamento de águas, biorremediação e geração de eletricidade. Um dos organismos que tem sido estudado a fundo para a aplicação em células de combustível microbianas é a Geobacter sulfurreducens. Esta espécie de Geobacter, que gera eletricidade pela oxidação de compostos, mostrou gerar uma quantidade significativa de energia devido a múltiplos mecanismos extracelulares de transferência de elétrons através de pilis ou citocromos do tipo C. Outra espécie de Geobacter que desperta grande interesse é a Geobacter metallireducens por ser capaz de oxidar compostos aromáticos e reduzir metais nocivos solúveis (até mesmo radioativos) à forma inofensiva insolúvel. Porém, o aumento na densidade de potência destes dispositivos é essencial para que sejam competitivos com outras fontes de energia renovável. Neste trabalho foi feito o estudo da melhor configuração visando a ausência de limitações catódicas para aumento da densidade de potência nas células, o que demostrou que medidas como diminuição do tamanho no ânodo, proximidade dos eletrodos e substituição do cátodo de oxigênio por ferricianeto melhoram a desempenho da célula. Também foram feitas comparações de densidade de potência em células de combustível microbianas de culturas puras de G. metalirreducens e G. sulfurreducens e uma cocultura das duas espécies. Essa comparação demonstrou que G. metallireducens além de poder ser utilizada para biorremediação apresenta uma densidade de potência elevada, podendo ser usada também como cultura pura em células de combustível microbianas, para a produção de eletricidade. Também se pode perceber uma relação direta entre a espessura do biofilme e a potência produzida nas três células. A espécie G. metallireducens demonstrou ainda ser útil na utilização de glicerol como fonte de carbono, podendo servir como espécie remediadora para este resíduo. / Microbial fuel cells aroused interest in recent years due to the application in water treatment, bioremediation and electricity generation. One of the microorganisms that has been studied thoroughly for application in microbial fuel cells is the Geobacter sulfurreducens. This specie of Geobacter, which generates electricity by oxidizing compounds, showed generate a significant amount of energy due to multiple mechanisms of extracellular electron transfer through Pilis or c type cytochromes. Another specie of Geobacter that arouses great interest is the Geobacter metallireducens by being able to oxidize aromatic compounds and soluble reducing harmful metals to insoluble harmless. However, the increased power density of these devices is essential to be competitive with other renewable energy sources. This present work studied the best configuration aiming the absence of cathodic limitations to increasing power density of the cells. Measurements have shown that reduced anode size, location of the electrodes and replacement of oxygen by ferricyanide, improves the performance of the cells. Comparisons of power density between pure cultures of G. sulfurreducens and G. metalirreducens and a coculture of the two species were also made. This comparison showed that G. metallireducens can be used for bioremediation and also in a microbial fuel cell to produce electricity due the high power density produced. Direct relationships between the thickness of the biofilm and the power produced in the three cells have been notice. The specie G. metallireducens also showed to use glycerol as a carbon source, which may be an alternative for glycerol consumption.

Made available in DSpace on 2015-12-06T22:55:09Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Ministério da Educação, Ciência e Tecnologia da Coreia do Sul (MEST) / Governo da província de Gyeonggi da Coreia do Sul / Instituto Coreano de Informação Científica e Tecnológica (KISTI) / Crescentes evidências mostram que a organização espacial da transcrição é um fator epigenético importante na regulação gênica em eucariotos. Em células de mamíferos, os genes são transcritos em estruturas nucleares discretas conhecidas como fábricas de transcrição, e genes com funções relacionadas e co-regulados compartilham as mesmas fábricas de transcrição. Plasmodium falciparum apresenta um padrão de expressão gênica bastante complexo durante o ciclo eritrocítico, contrastando paradoxalmente com o baixo número de putativos fatores de transcrição codificados pelo seu genoma. Por outro lado, mecanismos epigenéticos são importantes na regulação gênica neste parasita. Nesta tese, investigamos a organização da transcrição em P. falciparum visando determinar se a organização nuclear está relacionada com a expressão/regulação gênica ao longo do desenvolvimento do parasita. Com este objetivo, marcamos transcritos nascentes com BrUTP em formas eritrocíticas de P. falciparum. Assim como em mamíferos, a transcrição no parasita também está organizada em focos nucleoplásmicos discretos, chamados fábricas de transcrição. Análises automatizadas de imagens em 3D mostram que o número e a intensidade das fábricas de transcrição variam durante o ciclo eritrocítico, estando correlacionados com o número de genes expressos em cada estágio, mas não com o volume nuclear. O baixo número de fábricas indica que os genes ativos compartilham as fábricas enquanto estão sendo transcritos. Surpreendentemente, as fábricas são espacilamente redistribuídas durante o desenvolvimento de anéis para trofozoítas, com a periferia nuclear sendo a zona de transcrição favorita nos anéis, enquanto nos trofozoítas as fábricas estão igualmente distribuídas por todo o nucleoplasma. Também observamos que a transcrição por RNA polimerase I ocorre principalmente nas áreas centrais dos núcleos em trofozoítas, sugerindo que os componentes nucleolares podem ser dispersos devido à entrada na fase S. Assim como nos eucariotos superiores, as fábricas de transcrição em P. falciparum também se localizam em áreas nucleares com baixa densidade de cromatina. Análises de imunofluorescência combinando incorporação de BrUTP com marcadores nucleares mostram que as fábricas de transcrição formam um compartimento exclusivo, diferente do compartimento de silenciamento definido por PfSir2A ou do compartimento de cromatina ativa definido por H4ac ou H3K79me3. Para estudar a organização espacial da cromatina e entender como os genes co-regulados interagem com as fábricas de transcrição, decidimos realizar ensaios de hibridização fluorescente in situ (fluorescence in situ hybridization, FISH). Durante a realização de ensaios de FISH seguindo protocolos publicados, observamos uma grande variação na morfologia nuclear dos parasitas, o que nos moveu a otimizar esta técnica. Utilizando análises automatizadas de imagens, mostramos que os parasitas desidratados por secagem ao ar e fixados por curtos períodos de tempo à temperatura ambiente apresentam uma variação intra-populacional maior em relação à forma e ao volume nucleares após o ensaio de FISH, assim como valores de volume quase duas vezes maiores, do que núcleos de parasitas fixados em suspensão por longos períodos de tempo e em baixas temperaturas. Também observamos que a fixação em suspensão leva a uma melhor conservação da estrutura nuclear, e índices de colocalização mais altos para duas sondas de repetições adjacentes das extremidades cromossômicas, Rep20 e telômeros. Em resumo, nossos resultados mostram que o tipo de protocolo de fixação utilizado antes da realização do desenvolvimento de FISH é um fator crucial para a conservação apropriada da arquitetura nuclear. / Growing evidence points that transcription spatial organization is an important epigenetic factor for eukaryotes gene regulation. In mammalian cells, genes are transcribed in discrete nuclear structures known as transcription factories, and developmentally co-regulated, functionally related genes have been shown to share factories. Plasmodium falciparum shows a remarkably complex pattern of gene expression during the erythrocytic cycle, paradoxically contrasting with the low number of putative transcription factors encoded by its genome. However, epigenetic mechanisms are important for gene regulation in this parasite. In this thesis, we investigated transcription organization of P. falciparum in order to determine if nuclear architecture is related with developmentally regulated gene expression. To this aim, we have labeled nascent transcrips with BrUTP in P. falciparum erythrocytic forms. Transcription in organized in discrete nuceloplasmic foci, the transcription factories. Automated 3D analysis of confocal images shows the number and intensity of transcription factories change during the erythrocytic cycle, correlating with the number of genes expressed at each stage but not with the nuclear volume. The low number of factories indicates that active genes share factories while being transcribed. Unexpectedly, factories spatially redistribute from ring to trophozoites, being the nuclear periphery the preferential transcription zone in rings while in trophozoites factories are equally distributed throughout the nucleoplasm. We also observed that RNApolymerase I transcription occurs mostly at central nuclear areas in trophozoites, suggesting that nucleolar components may be dispersed upon S phase transition. Like in higher eukaryotes, in P. falciparum transcription factories occur on nuclear areas with low chromatin density. Immunofluorescence analysis of P. falciparum nuclear markers combined with BrUTP incorporation show that transcription factories are a novel and exclusive nuclear compartment, different from the silent compartment defined by PfSir2A or the active chromatin compartment defined by H4ac and H3K79me3. In order to study the spatial organization of chromatin, and how co-regulated, functionally related genes interact with transcription factories, we decided to perform fluorescence in situ hybridization (FISH). While performing FISH with published protocols, we observed great variation in the parasite nuclear morphology, prompting us to optimize this technique. Using automated image analysis, we show that parasites dehydrated by air-drying and fixed for short periods at room temperature present after FISH higher intra-population variation of nuclear shape and volume, as well as almost two-times higher relative volume values, than parasite nuclei fixed in suspension for long periods at low temperatures. We also observe that longer fixation in suspension leads to improved conservation of the nuclear structure, with chromosome end clusters preferentially locating at the nuclear periphery, and higher colocalization indexes for two adjacent chromosome end probes, Rep20 and telomere. Overall, our results show that the type of fixation protocol applied prior to FISH is crucial for the conservation of nuclear architecture. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Células de combustível microbianas despertaram interesse nos últimos anos devido à aplicação em tratamento de águas, biorremediação e geração de eletricidade. Um dos organismos que tem sido estudado a fundo para a aplicação em células de combustível microbianas é a Geobacter sulfurreducens. Esta espécie de Geobacter, que gera eletricidade pela oxidação de compostos, mostrou gerar uma quantidade significativa de energia devido a múltiplos mecanismos extracelulares de transferência de elétrons através de pilis ou citocromos do tipo C. Outra espécie de Geobacter que desperta grande interesse é a Geobacter metallireducens por ser capaz de oxidar compostos aromáticos e reduzir metais nocivos solúveis (até mesmo radioativos) à forma inofensiva insolúvel. Porém, o aumento na densidade de potência destes dispositivos é essencial para que sejam competitivos com outras fontes de energia renovável. Neste trabalho foi feito o estudo da melhor configuração visando a ausência de limitações catódicas para aumento da densidade de potência nas células, o que demostrou que medidas como diminuição do tamanho no ânodo, proximidade dos eletrodos e substituição do cátodo de oxigênio por ferricianeto melhoram a desempenho da célula. Também foram feitas comparações de densidade de potência em células de combustível microbianas de culturas puras de G. metalirreducens e G. sulfurreducens e uma cocultura das duas espécies. Essa comparação demonstrou que G. metallireducens além de poder ser utilizada para biorremediação apresenta uma densidade de potência elevada, podendo ser usada também como cultura pura em células de combustível microbianas, para a produção de eletricidade. Também se pode perceber uma relação direta entre a espessura do biofilme e a potência produzida nas três células. A espécie G. metallireducens demonstrou ainda ser útil na utilização de glicerol como fonte de carbono, podendo servir como espécie remediadora para este resíduo. / Microbial fuel cells aroused interest in recent years due to the application in water treatment, bioremediation and electricity generation. One of the microorganisms that has been studied thoroughly for application in microbial fuel cells is the Geobacter sulfurreducens. This specie of Geobacter, which generates electricity by oxidizing compounds, showed generate a significant amount of energy due to multiple mechanisms of extracellular electron transfer through Pilis or c type cytochromes. Another specie of Geobacter that arouses great interest is the Geobacter metallireducens by being able to oxidize aromatic compounds and soluble reducing harmful metals to insoluble harmless. However, the increased power density of these devices is essential to be competitive with other renewable energy sources. This present work studied the best configuration aiming the absence of cathodic limitations to increasing power density of the cells. Measurements have shown that reduced anode size, location of the electrodes and replacement of oxygen by ferricyanide, improves the performance of the cells. Comparisons of power density between pure cultures of G. sulfurreducens and G. metalirreducens and a coculture of the two species were also made. This comparison showed that G. metallireducens can be used for bioremediation and also in a microbial fuel cell to produce electricity due the high power density produced. Direct relationships between the thickness of the biofilm and the power produced in the three cells have been notice. The specie G. metallireducens also showed to use glycerol as a carbon source, which may be an alternative for glycerol consumption.

Células de combustível microbianas despertaram interesse nos últimos anos devido à aplicação em tratamento de águas, biorremediação e geração de eletricidade. Um dos organismos que tem sido estudado a fundo para a aplicação em células de combustível microbianas é a Geobacter sulfurreducens. Esta espécie de Geobacter, que gera eletricidade pela oxidação de compostos, mostrou gerar uma quantidade significativa de energia devido a múltiplos mecanismos extracelulares de transferência de elétrons através de pilis ou citocromos do tipo C. Outra espécie de Geobacter que desperta grande interesse é a Geobacter metallireducens por ser capaz de oxidar compostos aromáticos e reduzir metais nocivos solúveis (até mesmo radioativos) à forma inofensiva insolúvel. Porém, o aumento na densidade de potência destes dispositivos é essencial para que sejam competitivos com outras fontes de energia renovável. Neste trabalho foi feito o estudo da melhor configuração visando a ausência de limitações catódicas para aumento da densidade de potência nas células, o que demostrou que medidas como diminuição do tamanho no ânodo, proximidade dos eletrodos e substituição do cátodo de oxigênio por ferricianeto melhoram a desempenho da célula. Também foram feitas comparações de densidade de potência em células de combustível microbianas de culturas puras de G. metalirreducens e G. sulfurreducens e uma cocultura das duas espécies. Essa comparação demonstrou que G. metallireducens além de poder ser utilizada para biorremediação apresenta uma densidade de potência elevada, podendo ser usada também como cultura pura em células de combustível microbianas, para a produção de eletricidade. Também se pode perceber uma relação direta entre a espessura do biofilme e a potência produzida nas três células. A espécie G. metallireducens demonstrou ainda ser útil na utilização de glicerol como fonte de carbono, podendo servir como espécie remediadora para este resíduo. / Microbial fuel cells aroused interest in recent years due to the application in water treatment, bioremediation and electricity generation. One of the microorganisms that has been studied thoroughly for application in microbial fuel cells is the Geobacter sulfurreducens. This specie of Geobacter, which generates electricity by oxidizing compounds, showed generate a significant amount of energy due to multiple mechanisms of extracellular electron transfer through Pilis or c type cytochromes. Another specie of Geobacter that arouses great interest is the Geobacter metallireducens by being able to oxidize aromatic compounds and soluble reducing harmful metals to insoluble harmless. However, the increased power density of these devices is essential to be competitive with other renewable energy sources. This present work studied the best configuration aiming the absence of cathodic limitations to increasing power density of the cells. Measurements have shown that reduced anode size, location of the electrodes and replacement of oxygen by ferricyanide, improves the performance of the cells. Comparisons of power density between pure cultures of G. sulfurreducens and G. metalirreducens and a coculture of the two species were also made. This comparison showed that G. metallireducens can be used for bioremediation and also in a microbial fuel cell to produce electricity due the high power density produced. Direct relationships between the thickness of the biofilm and the power produced in the three cells have been notice. The specie G. metallireducens also showed to use glycerol as a carbon source, which may be an alternative for glycerol consumption.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:04Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-07-28 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Os cromossomos em anel geralmente resultam de quebras em seus braços curto e longo seguidas pela fusão das extremidades fraturadas, causando a perda de material genético. Atualmente, com o surgimento de técnicas moleculares mais sensíveis é possível definir os pontos de quebra com precisão e descrever o mecanismo de formação de cada anel. No presente trabalho, foram analisados 13 pacientes com cromossomos autossomos em anel. Para avaliação da instabilidade do cromossomo em anel foram avaliadas 300 metáfases de cada paciente, por meio de bandamento G e de FISH com sonda centromérica. Os pacientes portadores de r(14) e r(15) foram avaliados em dois períodos diferentes, com um intervalo de 19 anos, para a realização do estudo longitudinal. Somente os anéis dos cromossomos 4 (caso II) e 22 (casos XII e XIII) apresentaram-se estáveis de acordo com os critérios de Kosztolanyi (1987), enquanto os demais foram considerados instáveis. O estudo longitudinal mostrou que os r(14) e r(15) passaram de estáveis a instáveis no intervalo de tempo analisado. Apesar da instabilidade dos cromossomos em anel ter aumentado ao longo dos anos, esses dois pacientes não apresentaram agravamento no seu quadro clínico, tendo este se mantido estável. Através da técnica de SNP-array foram definidos os pontos de quebra e os mecanismos de formação dos anéis em 12 pacientes. Para os anéis nos quais não foram observadas perdas de material genético no braço curto e nem no braço longo foram utilizadas as técnicas de MLPA e de FISH com sondas subteloméricas e teloméricas, respectivamente. Assim, os cariótipos dos pacientes foram determinados como: 46,XY,r(3)(p26.1q29), 46,XX,r(4)(p16.3q35.2), 46,XY,r(10)(p15.3q26.2), 46,XX,r(10)(p15.3q26.13), 46,XY,r(13)(p13q31.1), 46,XY,r(14)(p13q32.33), 46,XX,r(15)(p13q26.2), 46,XY,r(18)(p11.32q22.2), 46,XX,r(18)(p11.32q21.33), 46,XX,r(18)(p11.21q23), 46,XY,r(22)(p13q13.33) e 46,XX,r(22)(p12q13.2). Verificamos que os anéis cromossômicos foram formados por meio de diferentes mecanismos: quebras em ambos os braços cromossômicos seguidas pela fusão das extremidades fraturadas (pacientes IV, VIII e X); quebra em um dos braços cromossômicos seguida pela fusão com região subtelomérica do outro braço (pacientes I, II, VII e XII); quebra em um dos braços cromossômicos seguida pela fusão com a região telomérica oposta (pacientes III e IX); fusão de regiões subteloméricas (paciente VI) e fusão de regiões teloméricas (paciente XI). Assim, os r(14) e um r(22) podem ser considerados anéis completos, uma vez que não houve perda de material genético relevante. O r(13) apresentou um mecanismo de formação mais complexo resultante da deleção de 11,1 Mb concomitante com uma duplicação intersticial de 1,5 Mb. Seu cariótipo foi definido como 46,XY,r(13)(p13q33.1).arr13q33.1(101,543,509-103,001,462)x3,13q33.1q34(103,003,268-114,142,980)x1 dn. Nós concluímos que o fenótipo dos pacientes portadores de cromossomos em anel podem estar relacionados a diferentes fatores, entre eles instabilidade do cromossomo em anel e a haploinsuficiência gênica. Além disso, fatores epigenéticos relacionados à configuração do cromossomo em anel poderiam alterar a expressão gênica, uma vez que os pacientes com r(14) e r(22) apresentam alterações fenotípicas apesar serem portadores de anéis completos. / Ring chromosomes usually result from breaks in their short and long arms followed by fusion of both ends causing genetic material loss. Nowadays with more sensible molecular techniques it is possible to better define the breakpoints and mechanism of ring chromosome formation. In this study we analyzed 13 patients with autosome ring chromosomes. We scored 300 metaphases from each patient lymphocyte cultures, using G banding and FISH with centromeric probes, in order to investigate the ring chromosome instability. A longitudinal study was done in patient VI with r(14) and in patient VII with r(15). They were investigated in two different periods with 19 years difference. Only the ring chromosomes 4 (case II) and 22 (cases XII and XIII) were considered stable since they present al lest 95% metaphases cells with only one monocentric ring, while the others were considered unstable. The longitudinal study showed that the r(14) and r(15) turned unstable during the period analyzed. In spite of the ring chromosomes instability had increased over the years, these patients did not present worse in clinical findings. Using the SNP-array technique, breakpoints and mechanisms of ring chromosome formation were determined in 12 patients. For the rings that we did not observe loss of genetic material in the short neither in the long arm MLPA and FISH techniques with subtelomeric and pantelomeric probes, respectively, were used. Thus, the patients´ karyotypes were determined as: 46,XY,r(3)(p26.1q29), 46,XX,r(4)(p16.3q35.2), 46,XY,r(10)(p15.3q26.2), 46,XX,r(10)(p15.3q26.13), 46,XY,r(13)(p13q31.1), 46,XY,r(14)(p13q32.33), 46,XX,r(15)(p13q26.2), 46,XY,r(18)(p11.32q22.2), 46,XX,r(18)(p11.32q21.33), 46,XX,r(18)(p11.21q23), 46,XY,r(22)(p13q13.33) and 46,XX,r(22)(p12q13.2). Different mechanisms were found to be involved in ring chromosome formation: from breaks in both chromosome arms, followed by end-to-end reunion (patients IV, VII-X and XII); from a break in one chromosome arm followed by fusion with the subtelomeric region of the other (patients I-II); from a break in one chromosome arm followed by fusion with the opposite telomeric region (patients III and IX); from fusion of two subtelomeric regions (patient VI); from telomere-telomere fusion (patient XI). Thus, the r(14) and one r(22) can be considered complete rings, since there was no loss of relevant genetic material. The r(13) showed a more complex mechanism of formation resulting in a deletion of 11.1 Mb concomitant with an interstitial duplication of 1.5 Mb with karyotype determined as 46,XY,r(13)(p13q33.1).arr13q33.1(101,543,509-103,001,462)x3,13q33.1q34(103,003,268-114,142,980)x1 dn. We concluded that the phenotypes of ring chromosome patients can be related with different factors, including gene haploinsufficiency, gene duplication and ring instability. Epigenetic factors related to gene expression changes due to the circular architecture of the ring chromosome must also be considered, since even patients with complete ring chromosomes can present associated phenotypic alterations, as observed in our patients with complete r(14) and r(22). / FAPESP: 2007/58735-5 / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Submitted by Haroudo Xavier Filho (haroudo.xavierfo@ufpe.br) on 2015-05-13T19:31:28Z No. of bitstreams: 1 Tese Artur Fonsêca.pdf: 1984525 bytes, checksum: 9550c1711540f45d9aa2bf5fb66e030e (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-13T19:31:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese Artur Fonsêca.pdf: 1984525 bytes, checksum: 9550c1711540f45d9aa2bf5fb66e030e (MD5) Previous issue date: 2014-02-28 / Capes; Facepe / O gênero Phaseolus L. tem como principal representante o feijão comum (P. vulgaris), mundialmente conhecido por sua importância econômica. A espécie possui 22 cromossomos pequenos (1,7 a 2,4 μm), contendo grandes blocos heterocromáticos pericentroméricos e subteloméricos. Além do feijão comum, o gênero possui outras quatro espécies de importância econômica, em um total de aproximadamente 75 espécies, todas neotropicais. Em sua maioria apresentam 2n = 22 cromossomos, entretanto, três espécies do grupo Leptostachyus apresentam 2n = 20. Com o objetivo de entender a organização da cromatina e a causa da disploidia descendente no gênero, o presente estudo utilizou imunocoloração e hibridização in situ fluorescente (FISH) em P. vulgaris e P. leptostachyus. As marcas epigenéticas para histonas modificadas e DNA revelaram que H3K4me3 e H4K5ac (trimetilação na lisina 4 da histona H3 e acetilação na lisina 5 da histona H4), em geral, foram associadas às regiões eucromáticas, enquanto H3K27me1, H3K9me2 (mono- e dimetilação das lisinas 27 e 9, respectivamente) e 5mC (5-metilcitosina) às heterocromáticas. Sítios de DNAr 45S, regiões centroméricas e a maioria dos blocos heterocromáticos terminais foram hipometilados, incluindo um associado a um cluster de genes de resistência à antracnose. Não foi encontrada associação entre a regulação da atividade dos genes de resistência e as modificações da cromatina ao nível cromossômico. Além disso, diferentes domínios heterocromáticos que variaram quanto ao padrão epigenético foram observados, revelando a complexidade e heterogeneidade da heterocromatina no gênero. Em outra abordagem, utilizando a FISH de BACs cópia única em P. leptostachyus (2n = 20), foi revelado que uma inserção do cromossomo 10 no centrômero do cromossomo 11, associada a uma translocação com o braço longo do cromossomo 6 foram responsáveis pela disploidia descendente em Phaseolus. Seis translocações, até então inéditas para o gênero, e duas novas inversões cromossômicas foram evidenciadas, aparentemente sem relação direta com essa disploidia. Apesar da estabilidade cariotípica, até então observada no gênero, esse grande número de rearranjo demonstra que a taxa de alterações cromossômicas pode ser bastante variável mesmo numa pequena escala de tempo evolutivo.

A história de domesticação da cana-de-açúcar (Saccharum spp.) é atípica. As variedades modernas derivam de um processo que inclui hibridações entre a espécie domesticada S. officinarum e a silvestre S. spontaneum, sucessivos retrocruzamentos, no sentido de recuperar o genoma de S. officinarum e a seleção de progênies superiores. Além disso, as genealogias contemplam cruzamentos entre genótipos e eventualmente espécies, todos com elevado grau de ploidia e número de cromossomos distintos, assim como aneuploidias. Frente ao exposto, este trabalho teve como objetivos estabelecer o número de cromossomos e avaliar o comportamento meiótico da cultivar IACSP93-3046, bem como, identificar as associações cromossômicas em meiose I dos genótipos IACSP93-3046, IACSP95-3018 e de um representante de S. officinarum, Caiana Fita, pela marcação dos centrômeros usando FISH. O número de cromossomos da cultivar IACSP93-3046 foi determinado a partir de preparações do meristema radicular, pré-tratado com 8-hidroxiquinolina (0,03%, 4h), e corado pelo método de Feulgen. As células metafásicas foram analisadas sob microscopia óptica, preferencialmente intactas e com o mínimo de sobreposição de cromossomos. Para a análise do comportamento meiótico utilizou-se a técnica de esmagamento, e as células foram coradas com carmim propiônico. Foram observadas as fases meióticas desde a metáfase I até a telófase II, bem como as tétrades. O pareamento cromossômico em meiose I foi analisado usando a técnica de hibridização in situ fluorescente (FISH). Para tanto, preparações dos genótipos IACSP93-3046, IACSP95-3018 e Caiana Fita foram realizadas pelo gotejamento de uma suspensão de células em diacinese. As sondas foram obtidas por PCR a partir da amplificação da região centromérica de cana-de-açúcar, marcadas com digoxigenina-11-dUTP, por nick translation, e detectadas com anti-digoxigenina-rodamina. As lâminas foram montadas em DAPI-Vectashield e analisadas sob microscopia de fluorescência. O número diplóide 2n = 112 foi observado para a cultivar IACSP93-3046, sendo caracterizado pela primeira vez neste estudo. A microsporogênese de IACSP93-3046 apresentou elevado percentual de irregularidades (68%). De modo geral, as anormalidades foram relativas à segregação dos cromossomos, e incluíram migração precoce para os polos em metáfase I e II, cromossomos retardatários em anáfase (I e II) e em telófase (I e II), cromossomos perdidos em prófase II, e micronúcleos nas tétrades. A análise dos sítios de hibridização permitiu comprovar que os cromossomos se associam predominantemente como bivalentes em IACSP93-3046, IACSP95-3018 e Caiana Fita. As irregularidades na segregação dos cromossomos conduzem a micrósporos aneuploides, como constatado em IACSP93-3046. Sugere-se que a assincronia do processo meiótico entre os genomas que compõem a cana-de-açúcar tem papel relevante na geração dessas irregularidades. / The history of the sugarcane domestication (Saccharum spp.) is atypical. Modern varieties are derived from a hybridization process between the domestic species S. officinarum and the wild species S. spontaneum, successive backcrossings to recover the genome of S. officinarum, and the selection of superior progenies. The genealogies include crossings among genotypes, and possibly Saccharum species, all with a high degree of ploidy and different numbers of chromosomes, as well as aneuploidies. The study aimed to establish the number of chromosomes and evaluate the meiotic behavior of cultivar IACSP93-3046, and identify chromosomal associations in meiosis I of genotypes IACSP93-3046, IACSP95-3018 and Caiana Fita (a representative of S. officinarum) by labeling centromeres using fluorescence in situ hybridization (FISH). The number of chromosomes in cultivar IACSP93-3046 was determined from the root meristem preparations, pretreated with 8-hydroxiquinoline and stained by the Feulgen method. Metaphasic cells, preferably intact and with minimum chromosome overlap, were analyzed under an optical microscope. Meiotic behavior was examined from the preparations by using squashing method and stained with propionic carmine. Meiotic phases were observed from metaphase I to telophase II, and tetrad stages. Chromosomal pairing in meiosis I was analyzed by using the FISH technique. The slides of genotypes IACSP93-3046, IACSP95-3018 and Caiana Fita were produced by dropping a suspension of meiocytes in diakinesis. The probes were obtained by PCR, with amplification of the centromere region, and labeled with digoxigenin-11-dUTP, by nick translation, and detected with anti-digoxigenin-rhodamine. The slides were mounted in DAPI-Vectashield and analyzed under a fluorescence microscope. The diploid number 2n = 112 was observed for cultivar IACSP93-3046 and characterized in this study for the first time. Microsporogenesis of IACSP93-3046 presented a high irregularity percentage regarding chromosome segregation, especially precocious migration to poles in metaphase I and II, laggard chromosomes in anaphase and telophase I and II, lost chromosomes in prophase II, and micronuclei in the tetrad stages. The analysis from the hybridization sites proved that the chromosomal pairing occurred predominantly as bivalents in IACSP93-3046, IACSP95-3018 and Caiana Fita. Chromosomal segregation irregularities led to aneuploid microspores, as confirmed in IACSP93-3046, suggesting the asynchrony in the meiotic process between the sugarcane genomes play an important role in producing these irregularities.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:05Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2002-06-26Bitstream added on 2014-06-13T19:12:54Z : No. of bitstreams: 1 marchesin_src_me_sjrp.pdf: 635247 bytes, checksum: b4432ae0de06265a064ac1eae2f6d35f (MD5) / Foram analisados citogenéticamente seis espécies de Vespertilionidae dos gêneros Myotis, Lasiurus, Histiotus e Eptesicus. As metáfases obtidas de culturas de fibroblastos foram analisadas em coloração convencional, Ag-NOR, bandamento C e G e hibridização in situ fluorescente com sonda de seqüências teloméricas (TTAGGG)n humana. As espécies Myotis nigricans, Myotis riparius (2n=44; NF=50), Eptesicus brasiliensis (2n=50; NF=48) e Histiotus velatus (2n=50; NF=48) foram as que apresentaram o maior número de cromossomos; Lasiurus ega (2n=28; NF=48) e Lasiurus cinereus (2n=28; NF=48) apresentaram o menor número de cromossomos, o que evidencia variabilidade cariotípica ao nível morfológico. A coloração Ag-NOR evidenciou variação no número de nucléolos interfásicos e nos cromossomos com RONs. Em M. nigricans e M. riparius as marcações nos cromossomos portadores de RONs variaram em distribuição, número e tamanho. Em M. nigricans o número de cromossomos marcados variou de 7 a 9 e em M. riparius de 6 a 10. Nas duas espécies, as RONs foram observadas nas extremidades dos braços curtos e longos de cromossomos acrocêntricos. A variação no número deve estar refletindo a ativação diferencial de RONs, o que resulta uma variação no número e no tamanho dos nucléolos. Em M. nigricans o número de nucléolos observados variou de 01 a 09 e em M. riparius de 01 a 10. Além da ativação diferencial, a fusão nucleolar resultante do movimento, crescimento e aproximação dos nucléolos podem ser responsáveis pela variação observada. Em L. cinereus e H. velatus as RONs foram coincidentes com as constrições secundárias dos pares heteromórficos 11 e 13 em L. cinereus, e 15 em H. velatus. O padrão de bandas G obtidos para as espécies M. nigricans e M. riparius evidenciou a ocorrência de homologias cromossômicas entre elas. / Six species of four vespertilionid genera (Myotis, Lasiurus, Histiotus and Eptesicus) were cytogenetically analyzed. The metaphases obtained from fibroblast cultures were analyzed in conventional staining, Ag-NOR, C and G banding and fluorescent in situ hybridization with probe of human telomeric sequence (TTAGGG)n. The species Myotis nigricans (2n=44, NF=48), Myotis riparius (2n=44; NF=50), Eptesicus brasiliensis (2n=50; NF=48) and Histiotus velatus (2n=50; NF=48) showed the highest number of chromosomes; Lasiurus ega (2n=28; NF=48) and Lasiurus cinereus (2n=28; NF=48) showed the lowest number, indicating karyotypic variability on the morphologic level. Ag-NOR staining evinced variation in the number of interphasic nucleoli and in chromosomes with NORs. In M. nigricans and M. riparius, the chromosomal Ag-stained regions varied in distribution, number and size. In M. nigricans, the number of marked chromosomes varied between 7 and 9, and in M. riparius, the number varied between 6 and 10. In both species, the NORs were observed on the extremities of the short and long arms of acrocentric chromosomes. The variation in number might be reflecting of NORs differential activation, resulting in variation in the number and size of nucleoli. In M. nigricans, the number of observed nucleoli has varied between 01 and 09, and in M. riparius, between 01 and 10. Besides differential activation, the nucleolar fusion resulting from the movement, growth and approximation of nucleoli might be responsible for the observed variation. In L. cinereus and H. velatus, the NORs were coincident with the secondary constrictions of heteromorphic pairs 11 and 13 in L. cinereus, and pair 15 in H. velatus. The pattern for G banding obtained for the species M. nigricans and M. riparius evinced the occurrence of chromosomal homologies between them.

Orientador: Estela Kaminagakura Tango / Banca: Ana Lia Anbinder / Banca: Silvana Pasetto / Resumo: O carcinoma de células escamosas (CEC) de boca é uma neoplasia incomum em pacientes jovens. Na literatura de língua inglesa não há relatos de estudos que investiguem a amplificação do EGFR e a expressão desta proteína neste grupo etário. O objetivo deste estudo foi investigar a amplificação do EGFR através da técnica de hibridização por fluorescência in situ (FISH) e correlacionar os resultados obtidos através da imunomarcação da proteína EGFR com a epidemiologia e com o prognóstico dos pacientes avaliados. Ao final dos testes de FISH e imunohistoquímicos, 21 amostras do grupo teste (pacientes ≤ 40 anos) e 39 amostras do grupo controle (pacientes ≥ 50 anos) foram consideradas adequadas para avaliação. As variáveis clínicas e anatomopatológicas foram comparadas pelos testes Qui-Quadrado ou exato de Fisher. A expressão do marcador EGFR e do método de FISH foi comparada entre os grupos por meio do teste não paramétrico de Mann-Whitney. As curvas de sobrevida foram calculadas utilizando o método de Kaplan-Meier e suas curvas foram comparadas através do teste de log-rank. Houve maior número de pacientes do sexo masculino, leucodermas, tabagistas e etilistas. A amplificação do EGFR foi maior no grupo teste (p = 0,018). A amplificação do EGFR associou-se estatisticamente com a variável estadiamento clínico avançado (p = 0,013), independente do grupo. A expressão da proteína EGFR correlacionou-se com tumores bem diferenciados (p = 0,011) e a presença de metástase (p = 0,035), independente da idade. A presença de amplificação foi mais frequente no grupo tese. Alguns casos de pacientes ≥40 anos de idade podem ser adequados ao emprego da terapia anti-EGFR, devido à amplificação do EGFR / Abstract: Oral squamous cell carcinoma (OSCC) is uncommon neoplasia in young patients. In the English literature, there are no reports of studies that investigate the amplification of EGFR and expression of this protein in this age group. The aim of this study was to investigate the amplification of EGFR by fluorescence in situ hybridization (FISH) and to correlate the results by immunostaining of EGFR protein with clinicopathological features and prognosis. After FISH and immunohistochemistry, 21 samples of the test group (≤ 40 years) and 39 samples of control group (≥ 50 years) were suitable for evaluating. Categorical variables were compared by the Pearson chi-square test or Fisher's exact test. Associations between protein levels and FISH results with clinicopathological characteristics of the patients were analyzed by Mann-Whitney U test. Survival rates were calculated using the Kaplan-Meier method and the curves were compared by the log-rank test. There was predominance for male patients, leucoderma, smoking and alcohol consumption. The EGFR amplification was higher in the test group (p = 0.018) and it was associated statistically with advanced clinical stage (p = 0.013), independent of the group. The expression of EGFR protein was correlated to well differentiated tumors (p = 0.011) and presence of metastasis (p = 0.035), regardless of age. Presence of EGFR amplification and/or expression. Some cases of patients ≥40 years old might be suitable for anti-EGFR therapy because of EGFR amplification / Mestre

Orientadores: Shirlei Maria Recco-Pimentel, Luciana Bolsoni Lourenço Morandini / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-16T17:27:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vittorazzi_StenioEder_M.pdf: 1698813 bytes, checksum: 820a78de37442254ed35e58e413de026 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: O gênero Physalaemus é atualmente constituído de 42 espécies, distribuídas em sete grupos. No grupo de Physalaemus cuvieri, além dessa, estão alocadas outras oito espécies. Estudos citogenéticos disponíveis até momento para algumas espécies do gênero nos mostram um número diplóide de 2n = 22, sendo a morfologia cromossômica similar entre elas. O objetivo desse trabalho foi desenvolver novos marcadores citogenéticos para o estudo do grupo de Physalaemus cuvieri. Foram estudadas três populações de P. cuvieri e duas outras espécies do grupo, P. albonotatus e P. centralis. Foram isoladas três sequências de DNA repetitivo, as quais foram denominadas PcP190EcoRI, PcP883EcoRI e PcP174PstI. A primeira sequência apresentou similaridade com os DNAr 5S disponíveis no GenBank e assim, adicionalmente, foi feito experimento para isolar o DNAr 5S de P. cuvieri. Foram obtidos dois fragmentos com cerca 201 e 690pb, localizados por double- FISH em cromossomos distintos. A sequência PcP190EcoRI mostrou similaridade de aproximadamente 70% com a região de transcrição de ambos os tipos de DNAr 5S, sugerindo a origem dessa sequência a partir do DNAr 5S. A hibridação in situ com sondas das três sequências de DNA repetitivo isoladas, nas três populações de P. cuvieri, em P. albonotatus e em P. centralis, mostrou que todas as regiões cromossômicas marcadas são coincidentes com regiões de banda C detectadas em estudo prévio. No entanto, as populações de P. cuvieri e as espécies estudadas diferem entre si pelo número e localização de marcações com sondas das três sequências. Essas sequências representam bons marcadores cromossômicos, já que permitiram demonstrar tanto variações interpopulacionais em P. cuvieri como também diferenças interespecíficas, corroborando a sugestão prévia de que as diferentes populações de P. cuvieri podem se tratar de um complexo de espécies crípticas. / Abstract: The genus Physalaemus is currently composed of 42 species, divided into seven groups. Within the Physalaemus cuvieri group are eight other species. Cytogenetic studies for some of the species within the genus show a diploid number of 2n = 22 and similar chromosome morphology. The aim of this research was to develop new cytogenetic markers to study the group of Physalaemus cuvieri. We studied three populations of P. cuvieri in addtion to two other species: P. albonotatus and P. centralis. We isolated three repetitive DNA sequences, which were named PcP190EcoRI, PcP883EcoRI and PcP174PstI. The former sequence showed similarities with the 5S rDNA available in GenBank and, therefore, an experiment was done to isolate the 5S rDNA of P. cuvieri. We obtained two fragments of about 201 bp and 690 bp, which were localized by double-FISH to distinct chromosomes. The PcP190EcoRI sequence showed approximately 70% similarity with the transcription regions of both types of 5S rDNA, suggesting the PcP190EcoRI sequence originated from the 5S rDNA. The three repetitive DNA sequences were detected by in situ hybridization to chromosomes from P. albonotatus, P. centralis and the three populations of P. cuvieri. These chromosome regions are coincident with C-bands detected in a previous study. Populations of P. cuvieri and others two species, however, differ by the number and location of the three sequences. These sequences seem to be good chromosomes markers since they were used to show interpopulational variation in P. cuvieri, as well interspecific differences. This supports the previous suggestion that different populations of P. cuvieri may be a complex of cryptic species. / Mestrado / Biologia Celular / Mestre em Biologia Celular e Estrutural