O cultivo da cana-de-açúcar é uma das atividades agrícolas mais importantes no Brasil, produzindo após a moagem o caldo, utilizado para a produção de açúcar e etanol, e o bagaço, resíduo lignocelulósico. O bagaço é recalcitrante à hidrólise enzimática, em parte pela baixa porosidade, resultante do recobrimento das fibrilas de celulose com lignina e hemicelulose. Neste estudo, o bagaço foi pré-tratado com sulfito alcalino nas concentrações de 2,5% de NaOH e 5% de Na2SO3 versus 5% de NaOH e 10% de Na2SO3 para produzir substratos para hidrólise enzimática. Ambos pré-tratamentos produziram substratos com teor de hemicelulose, grupos ácidos, grau de retenção de água e área superficial semelhantes. O conteúdo de lignina foi bem diferente nos bagaços pré-tratados com 5% de sulfito (21% de lignina) e 10% de sulfito (13% de lignina). A hidrólise da celulose e hemicelulose do bagaço com alto teor de lignina, utilizando a carga enzimática de 40 FPU/g e 80 U/g de ?-glicosidase foram próximas a 50% em 48 horas e, mesmo no bagaço com pouca lignina a conversão dos polissacarídeos não foi completa (90%). Considerando a importância do tipo de enzimas para a conversão dos polissacarídeos dos bagaços pré-tratados, realizou-se um planejamento experimental 24 com 6 pontos centrais ampliado em estrela, para avaliar uma mistura de enzimas partindo de 5 FPU/g do extrato comercial de Trichoderma reesei (celluclast) combinado com enzimas purificadas comerciais: xilanase de Neocallimastix patriciarum (família 10), xilanase de Thermotoga maritima (família 11), ?-xilosidase de Selelomonas ruminantium e ?-glicosidase de Aspergillus niger. A aplicação da mistura de enzimas otimizada no bagaço pré-tratado com alta carga de sulfito aumentou a conversão de celulose e hemicelulose em 6,6% e 15% respectivamente, comparado com a mistura de referência (5FPU de celluclast e 10UI de Novozyme 188 por grama de bagaço). A suplementação da celluclast com ?-xilosidase e ?- glicosidase foi estatisticamente significativa em 24 horas de hidrólise a um nível de 95% de confiança e a interação da xilanase 10 e 11 foi significativa com um nível de confiança de 90%. Quando foram realizados os mesmos ensaios do planejamento com o substrato com alto teor de lignina, as hidrólises da celulose e hemicelulose com a mistura de enzimas foram inferiores à obtida com a referência. A suplementação com xilanases e ?-xilosidase aumentou a conversão enzimática da hemicelulose apenas do substrato com pouca lignina, entretanto nos hidrolisados de ambos os substratos foi detectada a presença de xilooligossacarídeos, indicando a necessidade de adição de mais ?-xilosidase à mistura enzimática. As velocidades iniciais de hidrólise da celulose e hemicelulose foram pouco alteradas quando a lignina do bagaço reduziu de 21% para 13%, porém a conversão em 48 h de reação foi o dobro. Este estudo mostrou que o acesso das enzimas à hemicelulose foi limitado pelo alto teor de lignina do substrato, e que o benefício do uso de xilanases para a conversão de celulose foi obtido no substrato pré-tratado com alta carga de sulfito. / The cultivation of sugarcane is one of the most important agricultural activities in Brazil. The juice obtained from the crushed stalks of sugarcane is used to produce sugar and ethanol and the dry, fibrous residue remaining is the bagasse. Bagasse is recalcitrant to enzymatic hydrolysis, in part by low porosity due to the partial filling of space between the cellulose microfibrils by lignin and hemicelluloses. In this study, bagasses were pretreated with alkaline sulfite at concentrations of 2.5% NaOH and 5% Na2SO3 NaOH versus 5% and 10% Na2SO3 to produce substrates for enzymatic hydrolysis. Both substrates presented similar hemicellulose content, acid groups, water retention and specific surface area. Lignin content differed between pretreated bagasse with 5% sulfite (21%) and 10% sulfite (13%). The hydrolysis of cellulose and hemicellulose of bagasse with high lignin content, using 40 FPU/g and 80 U/g of ?-glucosidase was aproximately 50% in 48 hours and even on bagasse with low lignin content, the polysaccharides conversion was not complete (90%). Considering the importance of the type of enzymes for the conversion of polysaccharides of pretreated bagasses, a 24 full factorial experimental design with six central points was performed to evaluate a mixture of enzymes. A load of 5 FPU/g of Trichoderma reesei extract (celluclast) was combined with purified commercial enzymes: Neocallimastix patriciarum xylanase (family 10), Thermotoga maritima xylanase (family 11), Selelomonas ruminantium ?-xylosidase and ?-glucosidase from Aspergillus niger. The optimized mixture improved the conversion of cellulose and hemicellulose of the substrate with low lignin content in 6.6% and 15% respectively, when compared to the reference mixture (5FPU of celluclast and 10 IU of novozyme 188 per gram of bagasse). Supplementation with ?-xylosidase and ?-glucosidase was statistically significant at 24 hours of reaction and also the interaction of xylanases 10 and 11. When the same assays were performed with the substrate with low lignin, hydrolysis of the cellulose and hemicellulose with a mixture of purified enzymes was inferior to that obtained by the reference. Supplementation with xylanase and ?-xylosidase improved the enzymatic conversion only for substrate with low lignin content, however in supernatants of both substrates was detected the presence of xylo-oligosaccharides, suggesting the need for further addition of ?-xylosidase to the enzyme mixture. Initial rate of cellulose and hemicellulose hydrolysis changed very little when the lignin in the bagasse was reduced from 21% to 13%, but the conversion at 48 h conversion time was twice higher. This study showed that access of enzymes to the hemicellulose was limited by the high lignin content of the substrate, and that the benefit of using xylanases for the conversion of cellulose was obtained on the substrate pretreated with high sulfite load.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:26:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese Wagner Rodrigues de Carvalho.pdf: 2607795 bytes, checksum: 19e8481b5eb319af71b9e1f22666f1d9 (MD5) Previous issue date: 2008-06-30 / Xylanases have been used in the biobleaching of paper pulps, in bioconversion of plant biomass, for food and feed industries, among others. For successful selection of xylanases suitable for specific industrial applications it is important to characterize enzymes isolated from different sources. The thermophilic fungus Humicola grisea var. thermoidea is described as a good producer of extracellular endoxylanases and the Hxyn2 gene from this fungus was isolated and expressed in yeast Pichia pastoris. The aim of this project was focused on the production, purification and biochemical characterization of the recombinant HXYN2 (HXYN2r) enzyme and application on enzymatic hydrolysis of lignocellulosics substrates. The culture conditions of P. pastoris in flasks, using the 12.3 transformant and BMMY-U medium, were optimized and the best xylanolytic activity was 478.2 U/mL after 96 h, with a protein concentration of 100 mg/L, using 2.34% (w/v) of nitrogen sources (yeast extract plus urea 1.34:1.0% - w/v), 1% (v/v) of methanol, and OD600 of 10. The HXYN2r enzyme was purified by gel filtration chromatography with a yield of 6.4% and showed optimum pH and temperature values of 6.5 and 60ºC, respectively, maintaining 100% of initial activity after 4 h of incubation at pH 5.5, 6.5 and 7.5. The half-life time was 18 min at 60ºC and the enzyme was 100% stable after 3 h of incubation at 50ºC. Km and Vmax values were 7.9 mg/mL e 235.4 μmol/(mL.min), respectively. The HXYN2r enzyme were used on the enzymatic hydrolysis of sugarcane bagasse (SCB), corn cob (CC) and foliar sample of sugarcane (FSC) alone or with the enzymes of xylanolytic and cellulolytic system produced by H. grisea fungus. For enzymatic hydrolysis experiments, the substrates were milled and pretreated with 0.25% (w/v) of H2SO4 by 30 min. On the enzymatic hydrolysis the best conversion yield of hemicellulosic fractions were obtained using PpHXYN2r supplemented with EHg: 42.8% to CC, 9.6% to SCB and, a mean of 20% to foliar samples. / As endoxilanases têm sido utilizadas no biobranqueamento da polpa de papel, na bioconversão da biomassa de plantas, nas indústrias alimentícias e de ração animal, entre outras. Para a seleção de endoxilanases que possam ser empregadas em processos industriais específicos é importante caracterizar enzimas isoladas de diferentes fontes. O fungo termofílico Humicola grisea var. thermoidea é um bom produtor de endoxilanases extracelulares e o gene que codifica uma das endoxilanases (HXYN2) deste fungo foi isolado e expresso na levedura Pichia pastoris. O presente trabalho se concentrou na produção, purificação e caracterização bioquímica da endoxilanase recombinante HXYN2 e na sua aplicação na hidrólise enzimática de substratos lignocelulósicos. As condições de cultivo da levedura P. pastoris em frascos, utilizando o transformante 12.3 e o meio BMMY-U foram otimizadas e obteve-se uma atividade xilanolítica de 478,2 U/mL após 96 h de cultivo, com uma concentração de 100 mg/L de proteínas, utilizando 2,34% (p/v) de fontes de nitrogênio (extrato de levedura e urea 1,34:1,0% - p/v), 1% (v/v) de metanol e DO600 de 10. A enzima HXYN2r foi purificada por cromatografia de filtração em gel com um rendimento de 6,4% e apresentou pH e temperatura ótimos de 6,5 e 60ºC, respectivamente, mantendo 100% da atividade inicial após 4 h de incubação nos pH s 5,5, 6,5 e 7,5. O tempo de meia-vida foi de 18 min a 60ºC e a enzima manteve 100% da atividade após 3 h de incubação a 50ºC. Os valores de Km e Vmáx foram 7,9 mg/mL e 235,4 μmol/(mL.min), respectivamente. A enzima HXYN2r foi aplicada na hidrólise enzimática de sabugo de milho (SM), bagaço de cana-de-açúcar (BCA) e palha de cana-de-açúcar (PCA) sozinha ou em conjunto com as enzimas do sistema xilanolítico e celulolítico produzidas pelo fungo H. grisea. Para os experimentos de hidrólise enzimática os substratos testados foram moídos e submetidos a uma etapa de pré-tratamento com 0,25% (p/v) de H2SO4 por 30 min. Nos ensaios de hidrólise enzimática as melhores taxas de conversão da fração hemicelulósica dos substratos foram obtidas utilizando-se a PpHXYN2r suplementado com o EHg: 42,8% para o SM; 9,6% para o BCA e, em média 20% para as amostras foliares.

Celulases têm atraído muito interesse nos últimos anos devido a sua habilidade na bioconversão de material lignocelulolítico em glucose, a qual pode, então, ser convertida a etanol por fermentação. O complexo celulolítico capaz de degradar a celulose consiste de várias enzimas (principalmente celulases e β-glucosidases) e proteínas auxiliadoras, que atuam em sinergismo para eficientemente hidrolizar a biomassa. Nesse estudo, investigou-se a hidrólise enzimática do bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado utilizando enzimas produzidas por T. harzianum e enzima comerial. O rendimento de hidrólise foi avaliado quanto a diferentes níveis de deslignificação de biomassa, graus de cristalinidade da celulose, composição dos coquetéis enzimáticos e adição de BSA. Estudos de difração de raios-X mostraram que a cristalinidade da lignocelulose não é um fator determinante na recalcitrância ao ataque enzimático. Além disso, a adição de BSA não teve qualquer efeito no rendimento da hidrólise. O mais eficiente coquetel enzimático foi obtido misturando o preparado comercial com o produzido pelo T. harzianum (rendimento acima de 97%). Esse desempenho está, provavelmente, relacionado com níveis adequados de β-glucosidases e xilanases no coquetel. Devido a essa eficiente atividade celulolítica, o fungo T. harzianum tem um grande potencial em aplicação para hidrólise de biomassa. A celobiohidrolase I, uma exoglucanase, é a principal enzima secretada por esse fungo (cerca de 60% do total) e nesse estudo ela foi expressa em bioreator, purificada por cromatografia de troca iônica seguida de gel filtração e caracterizada bioquímica, biofísica e estruturalmente. Conforme confirmado por SAXS, tanto a CBHI inteira quanto seu domínio catalítico, obtido por digestão parcial com papaína, são monoméricos em solução e apresentam distância máxima (DMax) de 110 e 60 Å, e raio de giro (Rg) de 20 e 27 Å, respectivamente. Os resultados indicam que o linker é flexível em solução e confirmam o formato de girino da enzima. A CBHI possui atividade máxima em pH 5.0 e temperatura de 50 °C, com atividade específica contra Avicel &reg e pNPC de 0,28 and 1,53 U/mg, respectivamente. Outras celulases de interesse foram também expressas para caracterização, no entanto, para essas, foi utilizado o sistema de expressão heteróloga em Aspergillus Níger ou Pichia pastoris. O domínio catalítico da endoglucanase I de T. harzianum foi expresso em A. Níger. A proteína tem atividade específica contra CMC de 15,8 U/mg e pH e temperatura ótima de 3 e 50 °C, respectivamente. A proteína é estável nessas condições em até 3 dias de incubação (dados de ensaios de atividade residual). Estudos biofísicos de deslocamento térmico e dicroísmo circular apresentaram alguns parâmetros de estabilidade de estrutura terciária e secundária, respectivamente. A proteína perde estrutura terciária regular, em pH 5, em torno de 30 °C mas sua estrutura secundária é desordenada somente em pH 9 (quando a 25 °C). Experimentos de dicroísmo circular também indicaram a composição de estrutura secundária do domínio catalítico da EGLI de 6% de α-hélice e 42% de folhas- β. / Cellulases have attracted an outstanding interest in the recent years because of its ability in the bioconversion of cellulose-containing raw materials into glucose, which can then be converted into ethanol by fermentation. The cellulase complex able to degrade cellulose consists of several enzymes (mainly cellulases and β-glucosidases) and auxiliary proteins, which act in synergism to efficiently solubilize the biomass. In this study, we investigated the enzymatic hydrolysis of pretreated sugarcane bagasse using crude enzyme extracts produced by Trichoderma harzianum as well as from the extract in combination with a commercial cocktail. The influence of different levels of biomass delignification, degree of crystallinity of lignicellulose, composition of enzymatic activities and BSA on enzymatic hydrolysis yields was evaluated. Our X-ray diffraction studies showed that crystallinity of lignocellulose is not a key determinant of its recalcitrance toward enzymatic hydrolysis. In fact, under the experimental conditions, an increase in crystallinity of lignocellulosic samples resulted in increased glucose release by enzymatic hydrolysis. Furthermore, under the same conditions, the addition of BSA had no significant effect on enzymatic hydrolysis. The most efficient enzyme blends were obtained by mixing a commercial enzymatic cocktail with T. harzianum cellulase preparations (above 97%). Increased hydrolytic efficiencies appeared to correlate with having an adequate level of both β-glucosidase and xylanase activities in the blends. Due to its elevated cellulolytic activity, the filamentous fungus T. harzianum has a considerable potential in biomass hydrolysis applications. The cellobiohydrolase I, an exoglucanase, is the main enzyme secreted by this fungus (about 60% of total) and in this study we have expressed, purified and performed an initial biochemical, biophysical and structural characterization. As confirmed by small angle X-ray scattering (SAXS) both full-length CBHI and its catalytic core domain (CCD), obtained by partial digestion with papain, are monomeric in solution and they have Dmax of 110 and 60 Å, and Rg of 20 and 27 Å, respectively. The results indicate that the linker is flexible in solution and confirmed the tadpole shape of the enzyme. CBHI displays maximum activity at pH 5.0 and temperature of 50 °C, with specific activities against Avicel &reg and pNPC of 0,28 and 1.53 U/mg, respectively. Other celulases were also expressed, however, for them we have used the heterologous expression system in Aspergillus niger and Pichia pastoris. The catalytic domain of endoglucanase I from T. harzianum was expressed in A. niger and partially characterized. The protein has specific activity against CMC of 15.8 U/mg and optimum pH and temperature of 3 and 50 °C, respectively. The protein is stable in these conditions until 3 days of incubation. Biophysical studies of termal shift and circular dichroism (CD) assays have showed some parameters of stability of tertiary and secondary structure of the protein. It loses regulary terciary structure in pH 5 around 30 °C but the secondary structure is desordened only in pH 9 at 25 °C. CD experiments also indicated the secondary structure compsition of the catalytic domain of EGLI: 6% de α-helices and 42% de β-sheet.

No Brasil o etanol é considerado a melhor escolha para reduzir as dependências dos combustíveis fósseis. Para atender as metas de produção desse combustível renovável, fontes de materiais lignocelulósicos podem ser utilizadas com o intuito de se aproveitar a fração celulósica para obtenção de açúcar fermentável. Contudo, é preciso desenvolver métodos de pré-tratamento eficientes e economicamente viáveis custo para reduzir a recalcitrância da biomassa vegetal in natura, aumentando dessa forma a eficiência da etapa de hidrólise enzimática. Este trabalho teve como objetivo avaliar o efeito do pré-tratamento por explosão a vapor e do pré-tratamento com ácido diluído, seguidos ou não de uma etapa de deslignificação alcalina, na hidrólise enzimática da palha de cana-de-açúcar. O pré-tratamento por explosão a vapor foi realizado em reator de 2,5 m3 sob temperaturas de 180 °C, 190 °C e 200 °C, por 15 min. O pré-tratamento com ácido diluído (1% m:m) foi feito em reator rotatório de 20 L a 180 °C, 185 °C, 190 °C e 195 °C, por 10 min. A etapa de deslignificação com NaOH (1% m:v) foi feita a 100 °C, por 1 h, em reator de 350 L para a palha pré-tratada por explosão a vapor e em ampolas de 500 mL para a palha de cana pré-tratada com ácido diluído. Amostras de todos os tratamentos foram analisadas por FTIR e MEV. Foram feitos ensaios de hidrólise enzimática utilizando Celluclast 1.5L (15 FPU/g de amostra) e β-Glucosidase (10 UI/g de amostra). Os hidrolisados enzimáticos foram usados em testes de fermentabilidade conduzidos a 30 °C por 48 h utilizando S. cerevisiae UFPEDA 1238. Através de ambos pré-tratamentos foi possível remover mais de 90% de hemicelulose. O pré-tratamento com ácido diluído provocou uma maior degradação da celulose em relação ao pré-tratamento por explosão a vapor, bem como uma maior solubilização da lignina. A etapa de deslignificação alcalina somada ao pré-tratamento contribuiu para a remoção de até 80% da lignina. Análises de FTIR e MEV revelaram alterações das bandas de vibração dos grupamentos químicos e mudanças morfológicas das amostras tratadas em relação à palha in natura. O pré-tratamento por explosão a vapor a 200 °C promoveu a maior conversão enzimática (80%) e esse percentual foi aumentado para 85% pela aplicação da deslignificação alcalina. A fermentação dos hidrolisados enzimáticos se mostrou satisfatória, apresentando percentuais de eficiência acima de 70%. / In Brazil, ethanol is considered the best alternative to reduce dependence on fossil fuels. In order to enhance the production of this renewable fuel, lignocellulosic materials must be used with the goal of harnessing the cellulosic fraction to obtain fermentable sugar. However, an efficient pretreatment method to reduce recalcitrance of raw material is required for increasing the efficiency of enzymatic hydrolysis. This study aimed to evaluate the effect of two pretreatments, steam explosion and dilute acid, followed or not by an alkaline delignification, on enzymatic hydrolysis of sugarcane straw. Steam explosion was conducted in 2.5 m3 reactor at temperatures of 180 °C, 190 °C and 200 °C for 15 min. Dilute acid pretreatment was carried out in 20 L reactor at 180 °C, 185 °C, 190 °C and 195 °C for 10 min, using H2SO4 (1% w:w). Alkaline delignification was made with NaOH (1% w:v) at 100 °C for 1 h. Samples of all treatments were analyzed by FTIR and SEM. Enzymatic hydrolysis was performed with commercial cellulase Celluclast 1.5L (15 FPU/w of sample) and β-Glucosidase (10 IU/w of sample). Alcoholic fermentation by S. cerevisiae UFPEDA 1238 was conducted at 30 °C for 48 h. The pretreatments studied were able to remove over 90% of hemicellulose fraction. Higher degradation of cellulose and lignin fractions was observed during diluted acid pretreatment. Alkaline delignification contributed to the removal of more than 80% of lignin. FTIR and SEM analysis revealed changes in the vibration bands of chemical groups and morphological variation of the treated samples compared to raw material. Steam explosion at 200 °C promoted the higher enzymatic conversion (80%) and this percentage was increased to 85% by application of alkaline delignification. Fermentation tests efficiency was above than 70%.

Fitoestrógenos são compostos naturais de origem vegetal com atividade estrogênica. Estão sendo amplamente investigados para a prevenção de doenças crônicas, coronarianas, câncer de próstata e mama, na redução de riscos de osteoporose e alívio nos sintomas da menopausa. Entre os fitoestrógenos já utilizados encontram-se a daidzeína, genisteína e gliciteína em matrizes complexas como drogas e extratos vegetais, cápsulas e comprimidos, requerendo desenvolvimento e validação de metodologias para a determinação das isoflavonas. As metodologias propostas foram a cromatografia em camada delgada de alta eficiência (CCDAE) e a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). A fase móvel acetato de etila:hexano (8:2 v/v) foi utilizada para determinação do perfil cromatográfico das isoflavonas agliconas daidzeína, gliciteína e genisteína e a fase móvel acetato de etila:tolueno:ácido fórmico (8: 1: 1 v/v/v) para isoflavonas glicosiladas e não glicosiladas por CCDAE. Para a determinação quantitativa das isoflavonas glicosiladas por CLAE foi proposta uma hidrólise ácida com HCl 3M e aquecimento em banho-maria durante uma hora, como tratamento prévio. A determinação analítica das isoflavonas daidzeína, genisteína, formononetina e biochanina A por CLAE, em modo isocrático foi realizada utilizando coluna cromatográfica monolítica Chromolith® RP-18, 100-4,6mm, fase móvel constituída por água:acetonitrila (6:4 v/v), vazão 0,6mL/min e detecção a 260nm. Os resultados obtidos mostraram linearidade com coeficiente de correlação de 0,9995 para daidzeína, 0,9996 para genisteína, 0,9997 para formononetina e 0.9999 para biochanina A. A precisão e a exatidão apresentaram resultados satisfatórios. Boa resolução e rápida separação dos fármacos em formulações farmacêuticas também foram obtidas. Portanto, pode ser usado nas análises de rotina nos laboratórios de controle de qualidade de fitoterápicos. / Phytoestrogens are natural compounds of plants with estrogenic activity. They are being widely investigated in the prevention of chronic coronary diseases, in prostate and breast cancer, in the reduction of osteoporosis risk and relief of menopause symptoms. Among phytoestrogens already in use are daidzein, genistein and glycitein and they are present in complex matrix such as phytopharmaceuticals, plant extracts, capsules and tablets. These preparations require development and validation of methodologies for quantitative determination of isoflavones. The proposed methodologies include high performance thin layer chromatography (HPTLC) and high performance liquid chromatography (HPLC). The HPTLC coupled with densitometry can be used for quantitative analysis. The mobile phase constituted of ethyl acetate:hexane (8:2 v/v) was used to determine chromatographic profiles of isoflavone aglycones, daidzein, glycitein and genistein. The mobile phase constituted of ethyl acetate:toluene:formic acid (8:1:1 v/v/v) was used for determination of isoflavones glycosides and non-glycosides. For the quantitative determination of isoflavone glycosides with HPLC, an acid hydrolysis with 3M HCl and heating in water-bath for an hour was proposed as sample pretreatment step. The analytic determination of isoflavones daidzein, genistein, formononetin and biochanin A using HPLC was accomplished. The chromatography was carried out in isocratic mode with Chromolith®, a monolithic RP-18 column, (100x4.6mm) with mobile phase constituted of water:acetonitrile (6:4 v/v) operated at a flow rate of 0.6mL/min and detection was made at 260nm. The results showed method linearity with correlation coefficient of 0.9995 to daidzein, 0.9996 for genistein, 0.9997 for formononetin and 0.9999 for biochanin A. The precision and accuracy data presented satisfactory results. Good resolution and faster separation of compounds in pharmaceutical formulations were also obtained. The proposed method can be used in the routine analyses of phytopharmaceuticals in quality control laboratories.

Atualmente os processos biotecnológicos têm conquistado um lugar de destaque no desenvolvimento tecnológico mundial, tendo as enzimas como as celulases, grande importância econômica e diferentes aplicações industriais. O objetivo deste trabalho foi à obtenção de fungos isolados e selecionados do ambiente agroindustrial, com a capacidade de hidrolisar a fração celulósica do bagaço de cana-de-açúcar. Um total de 46 isolados foram obtidos de bagaço de cana coletados em 3 destilarias. Quinze apresentaram a formação de halo pela coloração com vermelho Congo, os quais foram avaliados quanto a atividade celulolítica (F1 a F15), tendo como referência o fungo Trichoderma ressei 9414. Os isolados foram cultivados em bagaço de canade- açúcar 1% e conduziu-se a determinação da atividade de endoglucanase (CMCase) empregando-se carboximetilcelulose (CMC) como substrato, e da atividade da celulase total (FPase) empregando papel de filtro como substrato. Após 21 dias de cultivo em bagaço de canade- açúcar nenhum dos isolados apresentou atividade da celulase total maior que T. ressei QM9414. Destes isolados, F9 apresentou maior valor para a atividade da celulase total após 7 dias de cultivo. Com relação a atividade da endoglucanase, no sétimo dia de cultivo o isolado F27 obteve melhor resultado que T. ressei QM 9414. Quanto à cinética da atividade de endoglucanase os isolados 9, 23 e 27 apresentaram atividades enzimáticas muito próximas do fungo referência (QM9414). Os resultados mostram o grande potencial da biodiversidade existente em nichos industriais, na busca de linhagens com potencialidade na hidrólise enzimática de substrato lignocelulósico, como o bagaço de cana- de-açúcar. / Biotechnological processes are achieving increased relevance in today\'s technological development, being enzymes such as celullases, of great economical importance in different industrial applications. The objective of this work was the isolation and selection of fungi from agroindustrial environment, with capacity of hydrolysing the cellulosic fraction of sugar cane bagasse. Forty six isolates were evatuated for their cellulolytic activity using CMC as carbon source and Cong Red as staining indicator . Fifteen isolates showed halo formation by red Congo staining, and they were evaluated for cellulolytic activity (F1 to F15), using Trichoderma ressei 9414 as a reference. The isolates were cultivated in 1% sugar cane bagasse and the cellulolytic activities were assessed by the determination of endoglucanase activity (CMCase) using carboximetilcelulose (CMC) as substrate, and the total celullase activity (FPase) applying filter paper as substrate. After 21 days of cultivation in sugar cane bagasse neither of the isolates showed total cellulase activity higher than T. ressei QM9414. From these isolates, F9 showed higher total cellulase activity after 7 cultivation days. For endoglucanase activity, the isolate F27 showed better result than T. ressei QM 9414 in the seventh cultivation day. For the endoglucanase activity kinetics, the isolates 9, 23 and 27 showed enzymatic activities very close to the reference fungus (QM9414). These results allow to suggest a great biotechnological potential for the biodiversity found in industrial niches, regarding the enzymatic hydrolysis of lignocellulosics substrates, namely the sugar cane bagasse.

O presente estudo teve como objetivo avaliar o potencial de diferentes espécies de fungos filamentosos do gênero Penicillium, possuindo elevada expressão de atividade lipolítica (glicerol éster hidrolase - EC 3.1.1.3), para utilização na hidrólise de óleos vegetais. Na primeira etapa foi avaliado o crescimento de dez espécies isoladas de diferentes habitats empregando meio de cultura líquido sintético, contendo azeite de oliva como principal fonte de carbono. Os parâmetros de resposta adotados foram: crescimento de biomassa celular e atividade hidrolítica no micélio e no filtrado (extracelular) e por meio destes ensaios foi possível selecionar três espécies produtoras de lipase retida no micélio com elevada atividade (> 150 U/g), P. italicum AT4421, P. janthinellum CCT3162 e P. purpurogenum AT2008. A atividade ligada ao micélio mais elevada foi obtida para P. italicum (199,3±9,5 U/g) o qual também apresentou a menor atividade no filtrado, resultando em uma relação entre as atividades ligadas ao micélio e extracelular da ordem de 10 vezes. As lipases das outras duas espécies também apresentaram baixas atividades no filtrado, correspondendo a proporções de atividades micélio/extracelular entre 9 a 7, a saber: P. purpurogenum (8,7), P. janthinellum (7,8). A determinação das propriedades bioquímicas e cinéticas das lipases dos fungos selecionados revelou valores similares de atividades máximas, abrangendo a faixa de temperatura e pH de 35-45 °C e 7-7,5, respectivamente. Os valores de Km variaram de 123,6 a 151,3 mM e os valores de Vmax entre 387,6 e 539,1 ?mol/min. Quanto à estabilidade térmica verificou-se que lipase de P. janthinellum foi a menos estável a 50 °C (t1/2 = 0,92 h) e a P. purpurogenum a mais estável (t1/2 = 1,21 h). Testes de hidrólise de óleos vegetais com diferentes composições em ácidos graxos foram efetuados para determinar a especificidade de cada lipase por ácido graxo. Para a lipase da espécie P. purpurogenum a maior porcentagem de hidrólise foi obtida quando utilizado óleo de coco, resultando em 60,6±0,6% em ácidos graxos livres. Ambas as lipases de P. italicum e P. janthinellum, revelaram elevada especificidade para óleos vegetais contendo ácido oleico como componente majoritário, como o óleo de canola, resultando em graus de hidrólise de 77,1±1,9% e 60,3±1,9% respectivamente. Para todas as lipases testadas, a concentração adequada do substrato foi estabelecida em 25% m/m (3:1 razão água/óleo) e a utilização de ondas ultrassonoras forneceu incrementos de pelo menos 1,2 vezes no grau de hidrólise em curto período de tempo (5 a 8 h). A composição dos hidrolisados por cromatografia gasosa indicam que as lipases das três espécies selecionadas foram capazes de enriquecer o meio com ácidos graxos obedecendo a composição de suas respectivas matérias-primas lipídicas. Para as lipases de P. italicum e P. janthinellum utilizando o óleo de canola, os ácidos graxos liberados foram basicamente insaturados, sendo que aproximadamente 50% desse material foi composto por ácido oleico (C18:1). Para a lipase de P. purpurogenum utilizando o óleo de coco, a composição de seu hidrolisado foi aproximadamente 50% de ácido láurico (C12:0). Potenciais aplicações deste procedimento são as reações de hidrólises de óleos vegetais para obtenção de concentrados de ácidos graxos de alto valor agregado (ômega 6), pré-tratamento de efluentes da indústria alimentícia e uma excelente alternativa na utilização em reações de hidroesterificação para produção de biocombustíveis utilizando matérias-primas de baixa qualidade. / The aim of this study was to evaluate the potential of different species from filamentous fungi the genus Penicillium, with high expression in lipolytic activity (glycerol ester hidrolase EC 3.1.1.3), for using in the hydrolysis of vegetable oils. Ten species of Penicillium genus, isolated from different habitats, were growth in synthetic liquid medium containing olive oil as main carbon source, and the selection was based on the following parameters: biomass growth and hydrolytic activities attained in the mycelium bound and filtrate (extracellular). Under these conditions, three lipases producing species (P. italicum AT4421, P. janthinellum CCT3162 and P. purpurogenum AT2008) were selected by retaining high activity in the mycelium (> 150 U/g) and lower activity in the filtrate. P. italicum was found to have the highest lipase mycelium-bound activity (199.3±9.5 U/g) lower filtrate activity (mycelium-bound and extracellular activity ratio of 10-fold). The other species also showed low filtrate lipolytic with mycelium-bound and extracellular activity ratios of 8.7 and 7.8-fold for P. purpurogenum and P. janthinellum, respectively. The determination of biochemical and kinetic properties of the lipases resulted in similar maximum activities at pH and temperature range of 35-45ºC and 7-7.5, respectively. Values for Km varied from 123.6 to 151.3 mM and Vmax values between 387.6 and 539.1 ?mol/min. The thermal stability assays showed that lipase of P. janthinellum was less stable at 50 °C (t1/2=0.92h) and P. purpurogenum was the most stable (t1/2=1.21h). The selected mycelium-bound lipases were assayed in the hydrolyis of vegetable oils having different fatty acids composition. This allowed determining for each lipase its selectivity for fatty acids. According to the results, P.purpurogenum lipase was found to have the highest hydrolysis percentage with saturated vegetable oils, such as coconut oil attaining 60.6±0.6% of free fatty acids. Both P. italicum and P. janthinellum lipases showed high selectivity for vegetable oil rich in oleic acid, such as canola oil, resulting in hydrolysis degrees of 77.1 ± 1.9% and 60.3±1.9%, respectively. For all tested lipases suitable substrate concentration was established at 25% w/w (3:1 water/oil ratio) and the use of ultrasound irradiations provided increments in the degree of hydrolysis of at least 1.2 fold in short period of time (5 to 8 h). The hydrolysate composition determined by gas chromatography indicated that all the three selected lipases were able to enrich the medium with fatty acids according to their respective lipid raw materials. For the lipase from P. italicum and P. janthinellum using canola oil, the fatty acids released were basically unsaturated, and approximately 50% of this material was composed of oleic acid (C18:1). For the lipase from P. purpurogenum using coconut oil, its composition was approximately 50% hydrolysate of lauric acid (C12:0). Potential applications of this procedure are the hydrolysis of vegetable oils for obtaining high valuable fatty acids (omega 6), pretreatment of wastewater from food industries and an excellent alternative in hidroesterification reactions to biofuel production using low-quality raw materials.

Com o crescente aumento da demanda energética e a redução dos recursos fósseis, os biocombustíveis obtidos a partir de biomassa lignocelulósica emergem como uma importante fonte de energia alternativa e sustentável. A biomassa lignocelulósica é formada basicamente por celulose, hemicelulose e lignina, cujo agrupamento compõem a complexa matriz da parede vegetal. A celulose é o principal composto de interesse presente na biomassa, uma vez que pode ser quebrada em glicose e usada no metabolismo de microrganismos para a posterior produção de etanol combustível. No entanto, diversos fatores tornam a biomassa recalcitrante ao processo de conversão, o que eleva o custo de produção dos biocombustíveis. Nesse contexto, proteínas aditivas, como as Expansinas vegetais vêm ganhando grande destaque devido à sua capacidade de afrouxar a parede celular por meio do enfraquecimento da ligação entre os polissacarídeos de forma não covalente, o que diminuí o estresse da parede celular e facilita assim a quebra da celulose por enzimas específicas. Assim, o presente trabalho teve como objetivo identificar genes da superfamília das Expansinas em quatro espécies de gramíneas (Zea mays, Sorghum bicolor, Brachypodium distachyon e Saccharum spp.). As sequências nucleotídicas obtidas a partir de bancos transcriptômicos de cana-deaçúcar foram usados na construção de árvores filogenéticas, por meio das quais pode se inferir as relações de ortologia entre espécies e selecionar sequências com potencial aplicação biotecnológica na promoção da sacarificação enzimática, aumento de biomassa e resistência vegetal à estresse abiótico, sendo estes ShEXPA14, ShEXPA24, ShEXPB22, ShEXPL3, ShEXPA1- zm, ShEXPA33, ShEXPB28, ShEXPB3, ShEXPB21, ShEXPB25 e ShEXPB4. Adicionalmente, os genes de sorgo e cana-de-açúcar foram caracterizados quanto aos domínios e motivos conservados das Expansinas de plantas, identificando as diferenças estre as subfamílias que podem contribuir para a maior especificidade das ?-expansinas em parede celular de gramíneas. / With increasing energy demand and the reduction of fossil resources, biofuels obtained from lignocellulosic biomass emerge as an important source of alternative and sustainable energy. The lignocellulosic biomass is basically formed by cellulose, hemicellulose and lignin, whose grouping makes up the complex matrix of the vegetal cell wall. Cellulose is the main compound of interest present in biomass since it can be broken down into glucose and used in the metabolism of microorganisms for the subsequent production of fuel ethanol. However, several factors make the biomass recalcitrant to the conversion process, which raises the biofuel production cost. In this context, additive proteins, such as vegetable Expansins have been gaining prominence due to their ability to loosen the cell wall by weakening the bond between the polysaccharides in a non-covalent way, which decreases the stress of the cell wall and thus facilitates the break of cellulose by specific enzymes. Thus, the present work aimed to identify nucleotide sequences of the Expansinas superfamily in four species of grasses (Zea mays, Sorghum bicolor, Brachypodium distachyon and Saccharum spp.). Sugarcane transcripts were used in the construction of phylogenetic trees, through which one can infer the relations of orthology between species and obtain sequences with potential biotechnological application in the promotion of enzymatic saccharification, biomass increase and plant resistance to abiotic stress, these being ShEXPA14, ShEXPA24, ShEXPB22, ShEXPL3, ShEXPA1-zm, ShEXPA33, ShEXPB28, ShEXPB3, ShEXPB21, ShEXPB25 and ShEXPB4. In addition, sorghum and sugarcane genes were characterized by the conserved domains and motifs of plant Expansins, identifying the differences between the subfamilies that may contribute to the greater specificity of the EXPB in the cell wall of grasses.

O bagaço de cana de açúcar é uma fonte de energia renovável e matéria prima promissora na produção de biocombustível, pois representa cerca de 30% de glicose contida na planta com potencial de ser hidrolisado e convertido em etanol. Os principais constituintes do bagaço de cana são a celulose, formada por cadeia linear de glicose, a hemicelulose, um polímero amorfo constituído de xilose, arabinose, galactose e manose e a lignina, um polímero complexo formado por unidades de fenilpropanos que atuam como revestimento impermeabilizante nas fibras, difícil de ser removido por sua característica recalcitrante. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a eficiência da irradiação com feixe de elétrons como pré-tratamento do bagaço de cana para hidrólise enzimática da celulose. O pré-tratamento do bagaço de cana é uma das etapas mais importante para torná-lo economicamente viável e competitivo na produção de energia. Como pré-tratamento o processamento por feixe de elétrons pode fragilizar a estrutura da hemicelulose e lignina, pela ação de radicais altamente reativos que quebram as ligações químicas, reduzindo o grau de polimerização das fibras. Foram avaliados os efeitos da radiação na estrutura e composição do bagaço, assim como a combinação do processamento por feixe de elétrons com o pré-tratamento de esplosão à vapor. Para hidrólise enzimática utilizou-se enzimas comerciais fornecidas pela Novozymes. O processamento por feixe de elétrons levou a alterações na estrutura e composição do bagaço de cana aumentando a solubilidade pela degradação de celulose alfa e hemicelulose e aumentando também o rendimento da hidrólise enzimática. No caso do bagaço explodido, não houve alteração no rendimento da hidrólise enzimática, mas o processamento por feixe de elétrons promoveu uma redução de 67% no furfural, que é formado no processo de explosão a vapor. / The sugar cane bagasse is a renewable energy source and a raw material promise in the biofuel production, once represents about 30% of glucose contained in the plant with the potential to be hydrolyzed and then converted to ethanol. The bagasse is composed of cellulose, straight chain of glucose, of hemicellulose, an amorphous polymer consisting of xylose, arabinose, galactose, and mannose, and of lignin, a complex polymer consisting of fenilpropans units that acts as waterproof coating on the fibers, which is hard to remove due its recalcitrant nature. The aim of this work was to study the electron beam processing as a pretreatment of sugarcane bagasse to enzymatic hydrolysis of cellulose. The pretreatment of sugarcane bagasse is one of the most importante steps to make this material economically viable and competitive on the energy production. As a pretreatment the electron beam processing can weak the hemicellulose and lignin structures by the action highly reactive radicals that breaks the links, reducing the degree of polymerization fibers. It was evaluated the chemical and structural modifications on fibers caused by the irradiation, the enzymatic hydrolysis of electron beam as the only pretreatment and combined to steam explosion. For enzymatic hydrolysis it was used the commercial enzymes from Novozymes. The radiation processing promotes changes in structure and composition of sugarcane bagasse, increasing the solubility, that is related to hemicellulose and cellulose cleavage, and also increasing the enzymatic conversion yield. In the case of exploded bagasse there is no changes in the enzymatic hydrolysis yield, however the electron beam processing promoted a 67% reduction of furfural, that is formed in the steam explosion process.

As lipases (triacilglicerol éster hidrolases E.C. 3.1.1.3) são importantes biocatalisadores devido à sua afinidade por vários substratos e à sua quimio, régio e enantiosseletividade. Elas atuam na hidrólise de triacilgliceróis para produção de ácidos graxos livres e na reação inversa (esterificação) em meios não aquosos. Uma lipase produzida por Geotrichum candidum (G. candidum) possui seletividade para a hidrólise das ligações ésteres de ácidos graxos insaturados de cadeia longa, como os ácidos oleico e linoleico, presentes em diversos triacilgliceróis. Esse tipo de seletividade permite que essas ligações sejam rapidamente hidrolisadas aumentando a velocidade e consequentemente a eficiência do processo de hidrolise de óleos vegetais. Entretanto, o alto custo das enzimas ainda é um fator limitante para sua ampla utilização. A imobilização, em suportes sólidos, pode ser uma alternativa para viabilizar o emprego das enzimas em processos industriais, permitindo seu reuso e ainda melhorarando sua estabilidade e/ou seletividade. Nesse contexto, o presente trabalho avaliou diferentes estratégias de imobilização, bem como a caracterização das propriedades catalíticas e a determinação dos parâmetros termodinâmicos da lipase produzida por G. candidum (LGC) via fermentação submersa, para a produção de ácidos graxos concentrados pela hidrólise de diferentes óleos vegetais (oliva, algodão e palmiste). Ensaios preliminares de imobilização da LGC em suportes hidrofóbicos (octil-agarose e octil-sílica) mostraram que estes não foram capazes de realizar a purificação da enzima do caldo de fermentação tão eficientemente quanto polihidroxibutirato (PHB) via imobilização, devido às diversas impurezas presentes no caldo de fermentação. Assim, a LGC bruta foi purificada via precipitação por solvente orgânico para melhor analisar a imobilização em diferentes tipos de suporte e por distintos métodos de imobilização, como a adsorção física e a iônica e a ligação covalente multipontual. Dentre estes métodos, a máxima atividade hidrolítica (45,4 ± 0,2 U/ g de biocatalisador) e a maior porcentagem de atividade recuperada (22,8 %) foram observadas para a imobilização de LGC por adsorção iônica em MANAE-agarose. Foram avaliadas as propriedades catalíticas da LGC purificada e imobilizada em MANAE-agarose, observando uma maior estabilidade da lipase em uma ampla faixa de pH e maior estabilidade térmica quando comparado com a enzima livre. A imobilização da LGC em MANAE-agarose também reduziu em 50% a energia de ativação (Ea) e aumentou a quantidade de produto formado em reações de hidrólise, verificado através do cálculo dos parâmetros cinéticos como a velocidade de reação máxima (vmáx) e a constante de Michaelis-Menten (Km). A hidrólise do óleo de oliva pela LGC imobilizada em MANAE-agarose sem a adição de emulsificantes atingiu 100% de hidrólise em 120 minutos de reação, sendo superior a enzima livre (95,5% em 140 min). No entanto, na reutilização do biocatalisador observou-se uma redução de 50% na reação de hidrólise para o segundo ciclo e de 5,5% para o terceiro ciclo. Os resultados obtidos na hidrólise dos óleos de algodão e de palmiste mostraram que a LGC livre expressa sua máxima atividade hidrolítica em pH 8,0 e temperatura de 37 °C, para ambos os substratos empregados. Entretanto, uma maior atividade foi observada para o óleo de algodão, devido à quantidade de ácidos graxos insaturados presentes em sua composição (≈ 71%) comparando-se com o óleo de palmiste (≈ 19%). / Lipases (triacylglycerol hydrolases E.C. 3.1.1.3) are important biocatalysts, due to their catalytic activity towards several substrates and their chemical, regio as well as stereo selectivity. They acts in the hydrolysis of triacylglycerols in order to produce free fatty acids, and in the inverse reaction (esterification) in non-aqueous mediums. Some lipases produced by Geotrichum candidum (G. candidum) possess selectivity with the hydrolysis of the long-chain unsaturated fatty acid ester bonds, like oleic and linoleic acids that are present in several triacylglycerols. This type of selectivity allows these bonds to be rapidly hydrolyzed, increasing the speed and consequently the efficiency of the vegetable oils hydrolysis. However, the high cost of enzymes is still a limiting factor for their widespread use. Immobilization on solid supports can be a viable alternative to the use of enzymes in industrial processes, allowing its reuse and to improve their stability and/or selectivity. In this context, the present work allowed the evaluation of different immobilization strategies, as well as the characterization of catalytic properties and the determination of thermodynamic parameters of a produced lipase from G. candidum (GCL) via submerged fermentation, in order to produce concentrated fatty acids by the hydrolysis of different vegetable oils (olive, cottonseed and palm kernel). Preliminary assays of free GCL immobilization on hydrophobic supports (octyl-agarose and octyl-silica) showed that they were not able to carry out the enzyme purification from fermentation broth as efficiently as polyhydroxybutyrate (PHB) via immobilization, due to the impurities in the fermentation broth. GCL produced was purified by precipitation with organic solvent in order to better analyze the immobilization on different types of support and by different immobilization methods, as via physical and ionic adsorption and multipoint covalent attachment. Among these methods, the maximum hydrolytic (45.4 ± 0,2 U/ g of biocatalyst) and the highest percentage of activity recovered (22.8%) were observed for GCL immobilized by ionic adsorption in MANAE-agarose. The catalytic properties of GCL purified and immobilized on MANAE-agarose were evaluated, a greater lipase stability over a broad pH range, and high thermal stability were observed as compared to the free enzyme. Immobilization of GCL on MANAE-agarose decreased the activation energy (Ea) by 50% and increased the amount of product formed during hydrolysis reactions, it was verified by calculating kinetic parameters such as the maximum reaction rate (vmáx) and the Michaelis-Menten constant (Km). The hydrolysis of olive oil by GCL immobilized on MANAE agarose, without the addition of emulsifiers, reached 100% hydrolysis in 120 minutes of reaction, whereas free enzyme reached 95.5% in 140 min. However, reusability tests of the biocatalyst showed that it retained around 50% of its original activity after second cycle, and only 5.5% after third cycle. The obtained results in the hydrolysis of cottonseed and palm kernel oils showed that free GCL expressed a maximum hydrolytic activity at pH 8.0 and temperature of 37 °C, for both used substrates. However, a greater activity was observed for cottonseed than for palm kernel, due the percentage of unsaturated fatty acids in cottonseed oil composition (≈ 71%) compared to palm kernel oil composition (≈ 19%). / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES