Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karolinska institutet, 2007. / Härtill 4 uppsatser.

Thesis (Ph.D. in Immunology) -- University of Colorado at Denver and Health Sciences Center, 2006. / Typescript. Includes bibliographical references (leaves 151-168). Free to UCDHSC affiliates. Online version available via ProQuest Digital Dissertations;

<p>Fibroblast growth factor homologous factors (FHFs) are noncanonical members of the fibroblast growth factor family (FGFs, FGF11-FGF14) that bind directly to voltage gated sodium channels (VGSCs), thereby regulating channel activity and consequently neuronal excitability. Mutations in FGF14 cause spinocerebellar ataxia while FGF13 is a candidate for X-linked mental retardation. Since FGF13 and FGF14 are nearly identical within their respective VGSC-interacting domains, those distinct pathological consequences have generally been attributed to regional differences in expression. I have shown that FGF13 and FGF14 have non-overlapping subcellular distributions and biological roles even in hippocampal neurons where both are prominent. While both FHFs are abundant in the axon initial segment (AIS), only FGF13 is observed within the soma and dendrites. shRNA knockdown and rescue strategies showed that FGF14 regulates axonal VGSCs, while FGF13 only affects VGSCs in the somatodendritic compartment. Thus, FGF13 and FGF14 have nonredundant roles in hippocampal neurons, with FGF14 acting as an AIS-dominant positive regulator and FGF13 serving as a somatodendritic negative regulator. Both of these FHFs also perform important non-VGSC regulatory roles. FGF14 is a novel potassium channel regulator, which binds to KCNQ2 and regulates both localization and function. FGF14 is also capable of serving as a “bridge” between VGSCs and KCNQ2 thus implicating it as a broad organizer of the AIS. FGF13, on the other hand is involved in a new form of neuronal plasticity called axon initial segment structural plasticity. Knockdown of FGF13 impairs AIS structural plasticity and reduces L-type CaV current through channels known to be important to this new form of plasticity. Both of these novel non-VGSC roles are specific to the FHF in question because FGF13 does not regulate KCNQ2 whereas FGF14 knockdown does not affect AIS position. These data imply wider roles for FHFs in neuronal regulation that may contribute to differing roles in neural disease.</p> / Dissertation

L'intégrité de l'information génétique est essentielle aux fonctions cellulaires et pour éviter l'instabilité génomique, qui est une des caractéristique du cancer. Suite à des cassures double brin (Double Strand Breaks; DSBs), la voie de signalisation de réponse aux dommages de l'ADN est activée dans la cellule qui comprend deux sous voies de signalisation : la jonction d'extrémités non-homologues et la recombinaison homologue. Le complexe TREX-2 associé au pore nucléaire est impliqué dans l'export des ARNm. Chez la levure, TREX-2 est impliqué dans le maintien de la stabilité génomique. Nous nous sommes intéressés au rôle de TREX-2 dans la réparation de DSBs dans les cellules humaines. La déplétion du complexe TREX-2 entraine une réparation de l'ADN par recombinaison homologue insuffisante. De plus, nos résultats démontrent que la protection contre les dommages de l'ADN par TREX-2 dépend aussi de l'équilibre entre H2B an H2Bub1 contrôlé par le module de deubiquitination de SAGA. / The maintenance of proper genetic information is essential to avoid genomic instability, which is a hallmark of cancer. In response to Double Strand Breaks (DSBs), cells initiate the DNA Damage Response (DDR), that acts through two main sub-pathways: non-homologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). The nuclear pore-associated TREX-2 complex is involved in mRNA export and has been implicated, in yeast, in genome stability maintenance. Here we investigated the role of TREX-2 in DSB repair in human cells. We find that loss of the scaffold subunit of TREX-2 (GANP) results in DNA repair deficiency by HR. Moreover, we showed that the mechanism through which TREX-2 protects human cells from DNA damage is dependent on an interplay with the co-activator complex SAGA that regulates H2Bub1 histone mark. Our results demonstrate a functional cross-talk between human TREX-2 and the SAGA deubiquitination activity that is important to ensure correct DSB repair during HR.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2012-07-16T21:26:49Z No. of bitstreams: 1 Elsio Augusto Wunder Júnior Patogênese da leptospirose...pdf: 2609622 bytes, checksum: aa34c959355bc105a6e849e74258cf78 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-07-16T21:26:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Elsio Augusto Wunder Júnior Patogênese da leptospirose...pdf: 2609622 bytes, checksum: aa34c959355bc105a6e849e74258cf78 (MD5) Previous issue date: 2010 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, Bahia, Brasil / A leptospirose é uma zoonose de importância global e um importante problema de saúde pública principalmente em países em desenvolvimento. É causada por bactérias do gênero Leptospira, uma espiroqueta móvel e de alta morbidade capaz de se disseminar nos tecidos e causar doença crônica em animais hospedeiros. Uma barreira importante para o controle e prevenção da doença tem sido o pouco conhecimento da patogênese do agente, em parte pela falta de ferramentas disponíveis e eficazes de manipulação genética. Um dos objetivos desse estudo foi caracterizar duas cepas mutantes de Leptospira interrogans. A interrupção do gene lipl32, que codifica para a proteína LipL32, a mais abundante proteína no gênero Leptospira e expressa somente na superfície das leptospiras patogênicas, foi realizada através da inserção do transposon Himar1 no sorovar Manilae. A cepa mutante não apresentou nenhuma diferença de crescimento ou de aderência em componentes da matriz celular, comparada com a cepa parental. O mutante foi capaz de produzir doença aguda no modelo animal de hamster e causar colonização crônica no modelo animal de rato, mostrando que LipL32 não possui um papel nestes modelos de infecção. A interrupção do gene ligB foi realizada com a utilização, pela primeira vez em leptospiras patogênicas, da técnica de recombinação homóloga por mutagênese dirigida, onde o gene que codifica para a proteína LigB teve uma parte substituída por um cassete de resistência de espectinomicina (Spcr). Essa proteína, identificada como um possível fator de virulência, reconhecida pelo soro de pacientes infectados e importante para a aderência em componentes da matriz celular, mostrou não ser importante para a infecção aguda ou crônica, quando testada frente aos modelos animais, além de não ser necessária para a aderência em cultura de células. Outro objetivo desse trabalho foi estudar a cinética de disseminação da Leptospira interrogans no modelo animal de hamster, utilizando uma dose alta (108 leptospiras) e baixa (250 leptospiras) de inóculo, além de diferentes rotas de infecção. Nossos resultados demonstraram que leptospiras se disseminam rapidamente em todos os tecidos 01 hora após a infecção com uma alta dose de inóculo e que possivelmente a carga do agente nos tecidos é mais importante para a patogênese do que a sua habilidade para a disseminação. Também demonstramos que a motilidade não é essencial para disseminação, mas pode ser essencial para a carga nos tecidos e letalidade. / Leptospirosis is a worldwide zoonosis and a major public health problem especially important in developing countries. Caused by bacteria of Leptospira genus, a motile lifethreatening spirochete which is able to disseminate to tissues and causes chronic carriage in animal hosts. A significant barrier to the control and prevention of leptospirosis has been the limited understanding of its pathogenesis, due in part to the lack of tools available for the genetic manipulation of this pathogen. One of the purposes of this study was to characterize two mutant strains of Leptospira interrogans. Interruption of lipL32 gene, encoding LipL32, the most abundant protein of pathogenic leptospires and its major outermembrane lipoprotein, was achieved in serovar Manilae using transposon mutagenesis with Himar1. The mutant had normal morphology and growth rate compared to the wild type and was equally adherent to extracellular matrix. The mutant was able to cause acute severe disease manifestations in the hamster model and chronic colonization in the rat model, showing that LipL32 doesn’t play a role in neither of those models of infection. Interruption of ligB gene was achieved using the homologous recombination by target mutagenesis for the first time in pathogenic leptospires and a spectinomycin resistance (Spcr) gene replaced a portion of the ligB coding sequence. This Lig protein, previously identified as a putative virulence factor, recognized by the sera of infected patients and important for the adherence in extracellular matrix components, showed not to be important for acute or chronic infection when tested with animal models and it’s not required to mediate bacterial adherence to cultured cells. Another purpose of this study was to determine and analyze the kinetics of dissemination of Leptospira interrogans in the hamster model, using a high (108 leptospires) and low (250 leptospires) dose of inoculum and different routes of infection. Our results demonstrated that leptospires can rapidly disseminate through all tissues after 1 hour post-challenge with a high inoculum dose and that perhaps the load of the agent in target tissues is more important for pathogenesis than its ability for dissemination. We also demonstrate that motility is not essential for dissemination but can be essential for tissue load and lethality.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The first study characterized the expression of MAS receptor and key enzymes for Ang-(1-7) production, such as, ACE2, NEP and PEP during follicular development. Furthermore, the regulation of local Ang1-7 system was evaluated after the intrafollicular injection of fulvestrant (an estradiolreceptor inhibitor) in the dominant follicle. Cows were ovariectomized when the size between the largest (F1) and the second largest follicle (F2) was not statistically different (Day 2), slightly different (Day 3), or markedly different (Day 4). The mRNA abundance of genes encoding MAS receptor, ACE2, NEP and PEP was evaluated in the follicular cells from F1 and F2. The mRNA expression of MAS receptor was upregulated in the granulosa cells of F2 after the establishment of follicular deviation (Day 4), while PEP mRNA increased during (Day 3) and after (Day 4) the deviation process. However, the mRNA expression of ACE2 was upregulated in the granulosa cells of F1 during and after the deviation process. The mRNA expression of NEP was not regulated in F1 and F2. The MAS receptor was immunolocated in the granulosa and theca cells of F1 and F2 during follicular deviation. Moreover, MAS receptor gene expression increased when the F1 was treated with the estrogen receptor-antagonist in vivo. In conclusion, the expression profile of MAS receptor, ACE2, NEP and PEP in dominant and subordinate follicles indicated that Ang-(1-7) play a role in the regulation of the follicular dominance in cattle. A second study was performed to investigate the expression of genes that control homologous recombination (HR; 53BP1, ATM, RAD50, RAD51, RAD52, BRCA1, BRCA2 and NBS1), and non-homologous end-joining (NHEJ; KU70, KU80 and DNAPK), DNArepair pathways in bovine embryos with high, intermediate or low developmental competence. We also evaluated whether bovine embryos can respond to DNA double-stranded breaks (DSBs) induced by ultraviolet (UV) irradiation by regulating the expression of genes involved in the HR and NHEJ repair pathways. Embryos with high, intermediate or low developmental competence were selected based on the cleavage time after in vitro fertilization and were removed from in vitro culture before (36 h), during (72 h) and after (96 h) the expected period of embryonic genome activation (EGA). All studied genes were expressed before, during and after the EGA period regardless the developmental competence of the embryos. Higher mRNA expression of 53BP1 and RAD52 was found before EGA in embryos with low developmental competence. Expression of 53BP1, RAD51 and KU70 was downregulated at 72 h and upregulated at 168 h post-fertilization in bovine embryos with DSBs induced by UV irradiation. In conclusion, important genes controlling HR and NHEJ repair pathways are expressed in bovine embryos before, during or after EGA. Lower developmental competence seems to be associated with a higher mRNA expression of 53BP1 and RAD52. Bovine embryos can response to UV-induced DSBs after the EGA but HR and NHEJ repair pathways seem to be particularly regulated at the blastocyst stage. / O primeiro estudo caracterizou a expressão do receptor MAS e de enzimas responsáveis pela produção de Ang-(1-7), tais como, enzima conversora de angiotensina 2 (ACE2), endopeptidase neutra (NEP) e prolil endopeptidase (PEP) durante o desenvolvimento folicular. Além disso, a regulação local do sistema Ang-(1-7) foi avaliada após a injeção intrafolicular de fulvestrant (inibidor do receptor de estradiol) no folículo dominante. As vacas foram ovariectomizadas quando o tamanho entre o maior (F1) e o segundo maior folículo (F2) não era estatisticamente diferente (D2), ligeiramente (D3) ou marcadamente diferente (D4). A expressão de RNAm do receptor MAS, ACE2, NEP e PEP foi avaliada nas células foliculares do F1 e F2. O receptor MAS foi mais expresso nas células da granulosa do F2 após o estabelecimento da divergência folicular (D4), enquanto a expressão de PEP aumentou durante (D3) e após (D4) o processo de divergência. Entretanto, a expressão de ACE2 foi maior nas células da granulosa do F1 durante e após a divergência. A expressão de PEP não foi regulada no F1 e F2. O receptor MAS foi imunolocalizado nas células da teca e granulosa do F1 e F2 durante a divergência folicular. A expressão de RNAm do receptor MAS aumentou quando o F1 foi tratado com fulvestrant in vivo. Em conclusão, o perfil de expressão do receptor MAS, ACE2, NEP e PEP nos folículos dominante e subordinado indicam que a Ang-(1-7) apresenta uma função na regulação da dominância folicular em bovinos. Em um segundo estudo investigamos a expressão de genes que controlam o reparo do DNA através das vias de recombinação homóloga (HR; 53BP1, ATM, RAD50, RAD51, RAD52, BRCA1, BRCA2, NBS1) e união terminal não homóloga (NHEJ; KU70, KU80, DNAPK) em embriões bovinos com alta, média ou baixa competência de desenvolvimento. Foi também avaliado se embriões bovinos podem responder a quebra na fita dupla de DNA (DSBs), induzida por irradiação UV, através da regulação de genes envolvidos nas vias de reparo HR e NHEJ. Embriões com alta, média ou baixa competência de desenvolvimento foram selecionados pelo tempo de clivagem após a fertilização in vitro e foram removidos do cultivo antes (36 h), durante (72 h) ou após (96 h) o momento esperado para a ativação do genoma embrionário (AGE). Todos os genes foram expressos antes, durante e após a AGE independentemente da competência de desenvolvimento dos embriões. A expressão de 53BP1 e RAD52 foi maior antes da AGE em embriões com baixa competência de desenvolvimento. A expressão de 53BP1, RAD51 e KU70 foi mais baixa as 72 h e maior as 168 h pós fertilização em embriões com DSBs induzida por irradiação UV. Em conclusão, genes importantes para o controle das vias de reparo HR e NHEJ são expressos em embriões bovinos independentemente do tempo de cultivo ou da competência de desenvolvimento. A menor competência de desenvolvimento embrionário parece estar associada com maior expressão de 53BP1 e RAD52. Os embriões bovinos respondem a DSBs após a AGE mas as vias HR e NHEJ são reguladas principalmente no estágio de blastocisto.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:33:27Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-03-20Bitstream added on 2014-06-13T20:25:01Z : No. of bitstreams: 1 messora_mr_dr_araca.pdf: 374960 bytes, checksum: 4398fcd4c1b5c4c9e5baa4dac6c14324 (MD5) / O propósito deste estudo foi avaliar, histologicamente, a cicatrização de enxertos de osso alógeno fresco congelado (OAFC) associados ou não ao plasma rico em plaquetas (PRP) em defeitos ósseos criados cirurgicamente em mandíbulas de cães. Defeitos ósseos bilaterais, medindo 1,5 cm de largura x 1 cm de altura, foram criados na borda inferior da mandíbula de 10 cães adultos machos. Os defeitos foram divididos em 3 grupos experimentais: C (controle), OAFC, OAFC/PRP. No Grupo C (n=7), os defeitos foram preenchidos apenas com coágulo sangüíneo. No Grupo OAFC (n=7), os defeitos foram preenchidos com enxertos de OAFC. No Grupo OAFC/PRP (n=6), os defeitos foram preenchidos com enxertos de OAFC associados ao PRP. A eutanásia dos animais foi realizada em 12 semanas pós-operatórias. Foram realizadas análises histológica e histométrica. Os dados foram analisados estatisticamente (ANOVA, Tukey, p < 0,05). Nenhum defeito regenerou completamente com tecido ósseo. Os enxertos de OAFC foram bem incorporados. A quantidade média de osso neoformado e os desvios-padrão dos Grupos C, OAFC e OAFC/PRP foram 70,55 8,01%, 71,31 14,36% e 65,57 11,55%, respectivamente. Não foram observadas diferenças estatisticamente significativas entre os grupos (ANOVA, p = 0,642). Os enxertos de OAFC foram biocompatíveis e bem incorporados, mas não proporcionaram maior formação óssea que os defeitos controle em mandíbulas de cães. O uso do PRP não promoveu nenhum benefício adicional à cicatrização desses enxertos em 12 semanas pós-operatórias. / The purpose of this study was to histologically analyze the healing of fresh frozen bone allograft (FFBA) with or without platelet-rich plasma (PRP) in bony defects surgically created in mandible of dogs. Bilateral bony defects, measuring 1.5 cm in width vs. 1 cm in height, were created in the inferior border of the mandible of 10 adult male dogs. The defects were divided into three groups: C (control), FFBA and FFBA/PRP. In Group C (n=7), the defect was filled with blood clot only. In Group FFBA (n=7), the defect was filled with FFBA. In Group FFBA/PRP (n=6), the defect was filled with FFBA combined with PRP. All animals were euthanized at 12 weeks post-operative. Histologic and histometric analyses were performed. Data were statistically analyzed (ANOVA, Tukey, p < 0.05). No defect completely regenerated with bone. The FFBA was well incorporated. The mean percentage of newly formed bone and the standard-deviations of Groups C, FFBA and FFBA/PRP were 70.55 8.01%, 71.31 14.36% and 65.57 11.55%, respectively. Statistically significant differences were not found among the groups (ANOVA, p = 0,642). FFBA were biocompatible and well incorporated. However, these grafts did not promote a greater bone formation than the control defects in mandible of dogs. The use of PRP promoted no additional benefit to the healing of these grafts at 12 weeks post-operative.

Os micro-organismos são profícuas fontes de produtos naturais bioativos. Diversos fármacos de importância clínica são de origem microbiana, sendo que a maioria dos antibióticos usados clinicamente é produzida por actinobactérias, principalmente do gênero Streptomyces. A resistência a múltiplas drogas por microorganismos patogênicos e também pelas células tumorais leva à necessidade por novos fármacos antibacterianos e antitumorais. Actinobactérias endofíticas têm demonstrado grande potencial para a busca de produtos naturais bioativos. O presente trabalho relata o estudo químico de duas linhagens de actinobactérias endofíticas, Streptomyces sp. RTd 22 e Streptomyces sp RTd 31, isoladas das raízes de Tithonia diversifolia. As frações ativas nos ensaios biológicos foram fracionadas para a identificação dos compostos bioativos, sendo eles os antibióticos macrolídeos concanamicinas A (S31-1) e B (S31-2), anidro-agliconas das concanamicinas A (S31-3) e B (S31-4), todos produzidos por Streptomyces sp RTd31, e o ionóforo poliéter grisorixina (S22-2), produzido por Streptomyces sp. RTd22. Foi realizado o monitoramento da produção desses compostos bioativos por UPLC-MS através do modo SIM. As concanamicinas A e B tiveram um máximo de produção com 96h, já a grisorixina obteve um máximo com 192h. Outros compostos identificados por desreplicação dos extratos butanólicos de ambas as actinobactérias foram os sideróforos norcardamina (S31-7) e desoxi-nocardamina (S31-8), já o sideróforo desferrioxamina B (S31-9) foi identificado apenas nos extratos butanólicos de Streptomyces sp RTd31. Experimentos de variação do meio de cultivo e co-cultura com bactérias patogênicas foram empregados a fim de estimular a biossíntese de novos compostos, porém nenhum novo metabólito foi identificado. O sequenciamento genético da actinobactéria Streptomyces sp. RTd22 permitiu verificar a presença de vários clusters biossintéticos nesse micro-organismo através da análise feita pelo antiSMASH. Foi possível identificar o cluster da himastatina (S22-4) e da coeliquelina (S22-5), sendo que ambos os compostos não foram biossintetizados nas condições de cultivo utilizadas. O cluster biossintético da grisorixina foi determinado e o experimento de recombinação homóloga para a deleção do gene análogo a flavina mono-oxigenase da nigericina nigC foi realizado. Dois mutantes foram obtidos e um deles foi cultivado para a análise do perfil metabólico por espectrometria de massas. Não houve a produção da grisorixina nem do seu possível precursor pelo mutante, mas outros metabólitos foram produzidos / Microorganisms are prolific sources of bioactive natural products. Several clinically important drugs have microbial origin, and most of the therapeutically used antibiotics are produced by actinobacteria, mainly from the genus Streptomyces. The multidrug resistance observed in pathogenic microorganisms and tumor cells lead to the need for new antibacterial and antitumor drugs . Endophytic actinobacteria have shown great potential in the search for bioactive natural products. This work describes the chemical study of two endophytic actinobacteria strains: Streptomyces sp. RTd 22 and Streptomyces sp RTD 31, isolated from Tithonia diversifolia roots. Active fractions in biological assays were further fractionated for identifying the bioactive compounds, which are: the macrolide antibiotics concanamycins (S31-1) and B (S31-2), anhydrous aglycones of concanamycins A (S31-3) and B (S31-4), all four produced by Streptomyces sp. RTd31, and the ionophore polyether grisorixin (S22-2), produced by Streptomyces sp. RTd22. The production of these bioactive compounds was monitored by UPLC-MS via the SIM mode. Concanamycins A and B had maximum production at 96 h, and grisorixin at 192 h. Other compounds identified by the dereplication of buthanolic extracts of both actinobacteria were the siderophore norcardamine (S31-7) and deoxy-nocardamine (S31-8), the siderophores desferrioxamine B (S31-9) was identified only in buthanolic extracts of Streptomyces sp RTd31. Experiments varying media and co-culture were tested to stimulate the biosynthesis of novel compounds, but nothing new was identified. By genome sequencing of Streptomyces sp RTd22 and antiSMASH analysis it was possible to verify the presence of several biosynthetic clusters in the genome of this strain. It was possible to identify the biosynthetic clusters of himastatin (S22-4) and its analogous compound coelichelin (S22-5); however, these compounds were not biosynthesized in the culture conditions used. The grisorixin biosynthetic cluster was determined, and homologous recombination was performed for deleting the analogue gene of nigericin flavin monooxygenase nigCI. Two mutants were obtained, and one of them was cultured for analyzing its metabolic profile by mass spectrometry. There was no production of grisorixin or its possible precursor by the mutant, but others compounds were produced.

Os micoplasmas são os menores microrganismos capazes de autoreplicação conhecidos na natureza, responsáveis por uma série de doenças no homem e nos animais, infectando ainda plantas e insetos. Constituem um grande grupo de bactérias, ordenadas em diferentes gêneros na classe Mollicutes, cuja principal característica em comum, além do genoma reduzido, é a ausência de parede celular. Mycoplasma mycoïdes subsp. mycoïdes SC, responsável pela Pleuropneumonia Contagiosa Bovina, foi o primeiro microrganismo desta classe de bactérias a ser identificado. Esta é uma doença bastante grave, com altas taxas de morbidade e mortalidade. A variedade Mycoplasma mycoïdes subsp. mycoïdes LC é responsável principalmente por casos de Pleuropneumonia Contagiosa Caprina, mastite no gado bovino, e ainda artrite em ovinos e caprinos em menor extensão. M. capricolum é um patógeno caprino, responsável principalmente por casos de artrite com grande importância econômica na medicina veterinária. M. pulmonis é um patógeno de roedores, considerado como o melhor modelo experimental para o estudo das micoplasmoses respiratórias. M. genitalium, o menor microrganismo conhecido capaz de se autoreplicar, é um patógeno humano responsável por casos de uretrite não gonocócica, cujo seqüenciamento completo do cromossomo tornou-se um marco na era da genômica. O estudo funcional do genoma destes micoplasmas, para a compreensão de sua biologia e patogenicidade, requer o desenvolvimento de ferramentas genéticas eficientes. No presente trabalho, análises in silico das seqüências na região das prováveis origens de replicação cromossômica (oriC) destes micoplasmas demonstraram a existência de possíveis DnaA boxes localizados em torno do gene dnaA. Estas regiões oriC foram caracterizadas funcionalmente após sua clonagem em vetores artificiais e a transformação dos micoplasmas com os plasmídeos recombinantes resultantes. O plasmídeo pMPO1, contendo a região oriC de M. pulmonis, sofreu integração no cromossomo do micoplasma por recombinação homóloga após poucas passagens in vitro. A redução desta oriC para o fragmento contendo somente os DnaA boxes localizados nas estremidades 5´ou 3´do gene dnaA não foi capaz de produzir plasmídeos replicativos em M. pulmonis, exceto quando estes dois fragmentos foram clonados no mesmo vetor, espaçados pelo determinante de resistência à tetraciclina tetM. Um fragmento interno do gene da hemolisina A (hlyA) de M. pulmonis foi clonado nestes plasmídeos oriC, e os vetores resultantes foram utilizados para transformar o micoplasma. A integração destes vetores por um crossing-over com o gene hlyA, causando a sua dirupção, foi documentada. Deste modo, estes plasmídeos oriC podem vir a se tornar ferramentas genéticas valiosas para o estudo do papel de genes específicos, notadamente aqueles potencialmente envolvidos na patogênese. / Mycoplasmas are the smallest microorganisms capable of self replication known to date, responsible for many diseases in man and animals, infecting also plants and insects. They constitute a large group of bacteria, classified in different genera in the class Mollicutes, which main common characteristic, besides the small genome, is the absence of a cell wall. Mycoplasma mycoïdes subsp. mycoïdes SC, responsible for the Bovine Contagious Pleuropneumonia, was the first microorganism of this class of bacteria to be identified. That is a quite severe disease, with high morbidity and mortality rates. Mycoplasma mycoïdes subsp. mycoïdes LC is responsible mainly for cases of Caprine Contagious Pleuropneumonia, mastitis in cattle, and also arthritis in goats and sheep in less extension. M. capricolum is a pathogen of goats, responsible mainly by cases of arthritis with large economic impact in veterinary medicine. M. pulmonis is a rodent pathogen, considered to be the best experimental model for studying respiratory mycoplasmoses. M. genitalium, the smallest microorganism capable of self replication, is an human pathogen responsible for cases of non gonococcal urethritis, which complete chromosome sequencing has become a benchmark in the era of genomics. Functional studies of these mycoplasma genomes, for comprehension of their biology and pathogenicity, requires the development of efficient genetic tools. In the present work, in silico analysis of sequences of the putative origin of chromosome replication (oriC) region of these mycoplasmas demonstrates the existence of putative DnaA boxes located around the dnaA gene. These oriC regions were functionally characterized after cloning into artificial vectors and transformation of mycoplasmas with the resulting recombinant plasmids. The plasmid pMPO1, which contains the M. pulmonis oriC region, has integrated into the mycoplasma chromosome by homologous recombination after a few in vitro passages. Reduction of this oriC to the fragment containing only the DnaA boxes located upstream or downstream the dnaA gene could not produce plasmids able to replicate in M. pulmonis, except when these two fragments were cloned in the same vector, spaced by tetracycline resistance gene tetM. An internal fragment of the M. pulmonis hemolysine A gene (hlyA) was cloned into these oriC plasmids, and the resulting vectors were used to transform the mycoplasma. Integration of these disruption vectors by one crossing-over with the hlyA gene could be documented. Therefore, these oriC plasmids may become valuable genetic tools for studying the role of specific genes of mycoplasmas, specially those potentially involved in pathogenesis.

Philosophiae Doctor - PhD / The aim of this thesis was to investigate the cellular role of the mouse RBBP6 gene using the interference RNA (RNAi) gene targeting technology and also to understand the relevance of two promoters for the RBBP6 gene. / South Africa