Les produits fonctionnels et nutraceutiques ont pris une grande importance en raison de leur valeur ajoutée. Leur production requiert l’isolation et la concentration des composés tels que les acides aminés et les peptides bioactifs des hydrolysats de protéines. A cette fin, l’EDUF (Électrodialyse combinée à l’ultrafiltration), une nouvelle technique de séparation, a été proposée. Les paramètres importants pour optimiser le procédé tels que la force du champ électrique, le type de membrane, le seuil de coupure, le pH, la configuration du module, le débit de la solution et la surface effective de la membrane ont déjà été étudiés. Cependant, le paramètre concentration de l’hydrolysat n’a encore jamais été étudié. Le projet consistait à évaluer l’impact de l’augmentation de la concentration d’un hydrolysat de crabe des neiges sur la sélectivité et le taux de séparation des peptides anioniques et cationiques, ainsi que sur leur activité antimicrobienne. Pour évaluer l’impact de la concentration de l’hydrolysat, quatre valeurs de concentration en protéines (0.5%, 1%, 2% et 4%) ont été étudiées et les autres paramètres (pH, conductivité, différence de potentiel) du système ont été constants. Les résultats ont montré que l’augmentation de la concentration a un effet sur le taux de séparation des peptides et que le plus haut taux de concentration peptidique a été observé à 4% pour le compartiment anionique à 291.9 µg/mL et pour le compartiment cationique à 431.87 µg/mL. Par contre, l’augmentation de la concentration n’a pas d’effet sur la sélectivité qui reste sans changement. Le taux de migration a augmenté avec l’augmentation de la concentration alors qu’en parallèle l’énergie relative consommée baissait. Le plus haut taux de migration a ainsi été observé à 4% (16.2 g/m2.h et 7.8 g/m2.h respectivement, pour les compartiments cationique et anionique) avec une énergie relative consommée de 3.53 Wh/g. Les résultats ont aussi montré que l’augmentation de la concentration en peptides n’a eu aucun impact sur le colmatage et l’intégrité des membranes. Les différentes fractions (anionique et cationique) obtenues et l’hydrolysat initial testés et n’ont pas montré d’activité antimicrobienne contre Micrococcus luteus. / The importance of functional and nutraceutical products has grown tremendously due to their added value. Their production requires the isolation and concentration of compounds, such as amino acids and bioactive peptides from protein hydrolysates. Therefore, a new separation technique EDUF (electrodialysis with ultrafiltration) was used. To optimize the process, important parameters such as electric field strength, membrane material and molecular weight cut-off, pH, ionic strength and flow rate of the solutions as well as cell configuration have already been studied, except for the initial peptide concentration in the feed solution. The objective of this study was to determine the impact of peptides concentration of snow crab by-product hydrolysate on selectivity and separation rate of anionic and cationic peptides, and on their antimicrobial activity. To assess the impact of peptides concentration, four values of protein concentrations (0.5%; 1%; 2% and 4%) were studied with other parameters (pH, conductivity, potential difference) of the system kept constant. The results showed that increasing the peptides concentration has an effect on separation rate of the peptides. The highest rate was observed at 4% with 291.9 mg/mL and 431.87 mg/mL peptide concentration, respectively for the anionic and cationic compartment. Other results also showed that increasing the initial concentration has no effect on selectivity. The migration rate increased linearly with increasing feed solution concentration while the relative energy consumption decreased with increasing feed solution concentration. The highest migration rates of 16.2 g/m2.h and 7.8 g/m2.h for the cationic and anionic compartments respectively were observed at 4%, with relative energy consumption of 3.53 Wh/g. However, increasing the concentration had no effect on the fouling and membrane integrity. In terms of antimicrobial activity, different fractions (anionic and cationic) and the initial hydrolysate were tested and did not showed antimicrobial activity on Micrococcus luteus.

Des peptides bioactifs ont déjà été fractionnés par électrodialyse avec membrane de filtration (ÉDMF) à partir d’hydrolysats de sous-produits de crabe des neiges. L’optimisation des paramètres apparaît maintenant indispensable pour perfectionner le procédé. Ainsi, le taux de migration des peptides, leur sélectivité et l'évolution des paramètres électrodialytiques ont été étudiés pour différents paramètres (configuration, concentration en KCl et types de champ électrique). La configuration (2) de la cellule d’ÉDMF comprenant deux compartiments d'alimentation et un compartiment de récupération a démontré des valeurs de champ électrique local relativement stables par rapport à la configuration (1) constituée d’un compartiment d’alimentation et de deux compartiments de récupération. Des peptides contenant des glutamates, des aspartates, et des glycines ont été séparés avec la configuration 1 et des peptides composés d’arginines et de lysines avec la configuration 2. Un taux de migration peptidique de 13,76 ± 3,64 g/m2h a été obtenu par le maintien constant de la conductivité des solutions. La sélectivité a été accrue en augmentant la concentration en KCl de 1 à 5 g/L dans le compartiment de récupération. Une augmentation de la force ionique a amplifié la charge de surface, agrandissant ainsi la taille effective des pores et réduisant la couche d'hydratation de la membrane d’ultrafiltration. Toutefois, les membranes échangeuses d’anions et de cations ont été colmatées par des peptides et des acides aminés et détériorées pendant l’ÉDMF. Pour résoudre ces problèmes, l’effet de l’application du champ électrique pulsé (PEF) et de l'inversion de polarité (PR) a été étudié. Le taux de migration des peptides n'a pas été affecté sauf avec PR à 40 V. La sélectivité a été maximale avec PEF à 20 V. La dissociation de l'eau a été réduite tout en conservant les propriétés physico-chimiques des membranes grâce à l’application du PEF et de la PR par rapport au courant continu (DC). En outre, la plus faible quantité d'énergie a été consommée avec le PEF. Par conséquent, il a été possible d’optimiser la technologie d’ÉDMF du point de vue de l’efficacité énergétique, de la sélectivité peptidique et de l’encrassement membranaire grâce à l’application du PEF et tout en maintenant la conductivité électrique des solutions. / Bioactive peptides were efficiently separated by using electrodialysis with filtration membrane (EDFM) from snow crab byproduct hydrolysate. Meanwhile, optimization of parameters is indispensable for scaling-up. The peptide migration rate and selectivity as well as evolution of electrodialytic parameters were studied with different parameters such as EDFM cell configuration, KCl concentration and type of electric field. The EDFM stack with two feed and one recovery compartments (configuration 2) has relatively stable electric field strengths (local) than the configuration with one feed and two recovery compartments (configuration 1). Peptides containing anionic amino acids: glutamic and aspartic acid as well as glycine and cationic amino acids: arginine and lysine were fractionated using configuration 1 and 2, respectively. Maintenance of solution conductivity upheld the local electric field and peptide migration throughout the treatment resulting in a higher peptide migration rate of 13.76±3.64 g/m2.h never observed so far. The selectivity of cationic peptides containing arginine and lysine increased significantly with increase in KCl concentration from 1 to 5 g/L. An increase in ionic strength amplified the surface charge density of filtration membrane subsequently increasing effective pore size and reducing hydration layer. However, both anion- and cation-exchange membranes were fouled by peptides and amino acids and were deteriorated during EDFM treatment. To address these problems, the effect of applying pulsed electric field (PEF) and polarity reversal (PR) was studied. The peptide migration rate was unaffected among PEF, PR and DC modes except with PR at 40 V. The selectivity of cationic peptides was maximum with PEF at 20 V. Fouling and water dissociation were significantly reduced and physicochemical properties of IEMs were better-protected with PEF and PR than DC. Moreover, the least amount of energy was consumed with PEF mode. Therefore, the parameters affecting EDFM process were optimized in terms of energy efficiency, selectivity and lower deterioration of membranes by applying PEF regime with configuration 2 and maintaining the constant electrical conductivity of solutions.

Les hydrolysats protéiques ont une haute valeur ajoutée pour des secteurs industriels variés, de par leurs propriétés nutritives, fonctionnelles et / ou nutraceutiques. Pour améliorer les propriétés des hydrolysats, l’ultrafiltration est utilisée. Cependant, le manque d’outils de modélisation lié à la complexité des mélanges est un verrou pour une mise en œuvre rationnelle du procédé. Ces travaux ont permis de valider une stratégie de prédiction basée sur des caractéristiques classiques des hydrolysats et un étalonnage expérimental de la membrane d’ultrafiltration. Cette méthode permet de prédire les rendements et enrichissements en fraction(s) ou peptide(s) cible(s), ainsi que la productivité du procédé. Le modèle global de prédiction de l’ultrafiltration obtenu est alors utilisé afin d’optimiser la mise en œuvre de ce procédé. La démarche d’optimisation consiste à maximiser l’enrichissement de fractions ou de peptides cibles en minimisant la consommation d’eau et la durée du procédé / Protein hydrolysates are high added value mixtures for various industrial areas, thanks to their nutritive, functional or nutraceutical properties. To enhance hydrolysates performances, fractionation processes such as ultrafiltration are used. However, the lack of tools to predict ultrafiltration performances is a major bottleneck for a rational implementation of the process. This research thesis work enables to validate a prediction strategy based on classical characteristics of hydrolysates and an experimental calibration of the membrane. Yields and enrichment factors in targeted peptides or fractions during ultrafiltration as well as the productivity of the process can be predicted. This global methodology of performances prediction is then used to optimize the implementation modes of ultrafiltration. The multiobjective optimization approach consists in maximizing the enrichment in targeted peptides or fractions while water consumption and / or process duration is minimized

La biomasse lignocellulosique (BLC) est, à l’heure actuelle, la meilleure alternative au pétrole en ce qui concerne la production d’énergie et de molécules à haute valeur ajoutée. Seulement, son exploitation nécessite l’emploi de prétraitements dont les plus courants génèrent des composés inhibant la croissance des microorganismes (dérivés furaniques, acides aliphatiques, phenols).Le but de ces travaux de thèse est donc de répondre à la question suivante : “Est il possible d’utiliser la nanofiltration pour éliminer les composés inhibiteurs présents dans un hydrolysat hémicellulosique, afin de le rendre fermentescible par Bacillus subtilis 168 ?”La détermination des concentrations minimales inhibitrices de ces composés inhibiteurs sur Bacillus subtilis 168 ont permis de fixer la quantité d’inhibiteurs à éliminer de l’hydrolysat.La dia-nanofiltration à l’aide de la membrane DK (GE, USA) a permis d’éliminer de manière efficace (+ de 90%) les dérivés furaniques et les acides alphatiques. Toutefois l’émination des composés phénoliques s’est révélée plus complexe, ainsi seul 25% du syringaldéhyde a été éliminé.La cytométrie en flux a permis de montrer une action de l’acide férulique et de la vanilline sur la fluidité et la polarisation de la membrane plasmique. / Lignocellulosic biomass is a promising alternative to oil for the production of energy and high added value molecules. However, its exploitation requires the use of pretreatment processes. The most commonly used processes generate by-products which present inhibitory action on microorganisms (furan derivatives, aliphatic acids, phenolic compounds).The main goal of this thesis project is to answer the following question : “Is it possible to use nanofiltration to remove inhibitory compounds from hemicellulosic hydrolysate, in order to ferment the latter with Bacillus subtilis 168 ?”Determination of minimal inhibitory concentrations of these inhibitory compounds allowed to determine, for each one, the quantity to remove from the hydrolysate.Dia-nanofiltration with DK membrane (GE, USA) allowed to efficiently remove (more than 90%) furane derivatives of aliphatic acids. However, removal of phenolic compounds was more complexe, hence, only 25% of syringaldehyde could be removed. Though most indentified inhibitory compounds were removed, Bacillus subtilis 168 was still not able to ferment the hydrolysate.Flow cytometry showed that férulic acid and vanillin presented an impact on Bacillus subtilis 168 plasma membrane fluidity of polarisation.

Un hydrolysat de co-produits de crabe des neiges a été fractionné par le procédé d'électrodialyse avec membranes d'ultrafiltration afin de séparer spécifiquement des fractions peptidiques bioactives. La configuration électrodialytique utilisée permettait une séparation simultanée des peptides anioniques et cationiques. Différents paramètres liés au procédé d'EDUF ont été étudiés afin d'obtenir les conditions optimales de séparation. Une fraction anticancer cationique a été obtenue lors d'un fractionnement réalisé à pH 6 avec des membranes d'ultrafiltration de 20 kDa sous une force de champ électrique de 5 V/cm. Une fraction antibactérienne anionique a également été isolée après un fractionnement réalisé à pH 9 avec des membranes d'ultrafiltration de 50 kDa sous une force de champ électrique de 14 V/cm. L'efficacité de l'EDUF, qui est très dépendante des paramètres de procédés appliqués, a donc été démontrée pour le fractionnement et la récupération de fractions peptidiques bioactives.

L’hydrolyse enzymatique de la β-lactoglobuline (β-LG) génère un nombre conséquentdepeptides dont certains possèdent desactivités biologiques. Cependant, l’étape d’hydrolyse peut être améliorée en diminuant le temps de réaction tout en générant unrendementpeptidique plus important. Ainsi, plusieurs travauxse sont intéressés à l’utilisation des hautes pressions hydrostatiques (HPH)afin d’engendrer une dénaturation de la β-LG et ainsi accélérer l’étape d’hydrolyse enzymatique et la production de peptides bioactifs. Cependant, les HPHimpactent également surles profils peptidiques par une modification du ratio peptideshydrophiles/hydrophobes. Une telle modification est ainsi susceptible d’avoir une répercussion négative sur les performances de l’ultrafiltration (UF) lors du fractionnement et de la concentration des peptides bioactifs. Par conséquent, ce projetvisaità étudier l’impact d’un prétraitement de la β-LG parlesHPH (400 et 600 MPa, 10 min) sur les performances du procédé d’UFlors de la séparation d’un hydrolysat trypsiquede β-LG. Suite aux étapes d’UF en mode recirculation et concentration, il a été démontré qu’un prétraitement de la β-LG à 400 MPaa permisde générer des hydrolysats dont les abondances peptidiques, y compris celles de certains peptides bioactifs (VAGTWY et ALPMHIR) étaient supérieures comparativement aux autres conditions(0.1 et 600 MPa).Cependant, à 400 MPa, les flux de perméationétaient inférieursde 31%. La désorption peptidique des membranes d’UFa permis d’identifierle peptide antihypertenseur ALPMHIRcomme l’espèce colmatante majeure. Cependant, et spécifiquement à 400 MPa, d’autres peptides chargés négativement ont été caractérisés, notamment VAGTWY (peptide antidiabèteet antioxydant). Par conséquent, bien qu’un prétraitement par les HPH à 400 MPa permette une augmentation des rendements peptidiques, les performances de l’UF sont considérablement réduites. / Enzymatic hydrolysis of β-lactoglobulin (β-LG) generates a large amount of peptide species including some bioactive peptides.However, the stepof protein hydrolysis can be improved by decreasing the digestion time while increasing the peptide yield. Several studies focused on the use of high hydrostatic pressure (HHP) to improve the denaturationof the native β-LG structure and thus to accelerate its enzymatic hydrolysis and yieldof bioactive peptides.Nevertheless, HHP is reported to affect the resulting peptide profiles by modifying hydrophobic/hydrophilic peptides ratiowhich may negatively affect the performance of ultrafiltration (UF) used to fractionate and concentrate bioactive peptides.Therefore, the aim of this project was to evaluate the performances of UF forthe filtration of tryptic hydrolysates generated after pre-pressurization ofβ-LGat 400 and 600 MPafor10min.After hydrolysate fractionation by UF in total recirculation modeand concentration modes, it has been demonstrated that β-LGpre-pressurization at 400 MPainduced the recovery ofhigher peptide relative abundance in the hydrolysates, including several bioactive peptides (VAGTWY and ALPMHIR), compared to other conditions(0.1 and 600 MPa).At the same time, permeate fluxes were 31% lower at 400 MPa. Characterization of peptide desorbedfrom UF membranes has shown that the antihypertensive peptide (ALPMHIR) was identified as the main fouling peptide.However, other negatively charged peptides were specifically identified at 400 MPa, including VAGTWY (an antioxidant and antidiabetic peptide). Consequently, while pre-pressurization of β-LGat400 MPa improved the recoveryof bioactive peptidescompared to other conditions, UF performances were negatively impacteddue to thisHHP pretreatment.

Le but de ce projet était d'étudier l'impact du débit de la solution d'alimentation, de la surface membranaire effective et de la force du champ électrique sur un procédé d'électrodialyse avec membrane d'ultrafiltration pour le fractionnement de peptides issus d'un hydrolysat trypsique de P-lactoglobuline. L'évolution des paramètres électrodialytiques, soit le pH des solutions d'alimentation et de perméation de même que leur conductivité électrique a été suivie. La migration peptidique dans le temps a été quantifiée par spectrophotométrie et qualifiée par RP-HPLC et par spectrométrie de masse. Les résultats ont montré que le débit des solutions n'influençait pas la productivité et que très peu les paramètres électrodialytiques, mais qu'il pouvait moduler la sélectivité du procédé. Il a aussi été montré que l'augmentation de la surface membranaire permet d'augmenter de façon linéaire la productivité du procédé, en ne modifiant pas sa sélectivité. La hausse de la valeur du champ électrique s'est aussi avérée importante pour améliorer la migration peptidique. Le pH et la conductivité des solutions ont aussi été fortement influencés par ces paramètres d'opération. Une bonne combinaison de surface, débit et champ électrique permet d'améliorer la rapidité et la productivité de l’électrodialyse avec membrane d'ultrafiltration pour la séparation sélective de peptides d'hydrolysats protéiques. / The aim of this study was to evaluate the influence of three process parameters (flow rate of the feed solution, effective membrane area, electrical field strength) on electrodialysis with ultrafiltration membrane for the fractionation of peptides from a tryptic P-lactoglobulin hydrolysate. To achieve this, the evolution of electrodialytic parameters such as the pH. of the feed and permeation solutions as well as their electrical conductivity was followed. Peptide migration over time was evaluated by spectrophotometry and the molecular profiles of both solutions were determined by RP-HPLC and mass spectrometry. Results of the first part of the study have shown that the flow rate had no impact on the productivity, a slight influence on the electrodialytic parameters but could modify the selectivity of the process. On the other hand, the increase of the membrane effective area resulted in a linear increase of the peptide concentration in the permeation solution without influencing the selectivity. The raise of the electrical field strength also resulted in an important increase of the productivity of the process. Modification of those parameters also modified the behaviour of pH and conductivity over time. A combination of the optimal flow rate, membrane area and electrical field strength allows to improve the productivity and the speed of electrodialysis with ultrafiltration membrane for the selective fractionation of peptides derived from protein hydrolysates.

Dans le contexte énergétique et climatique mondial, le coût élevé des enzymes Cellulolytiques (cellulases) freine le développement des bioraffineries lignocellulosiques, pour produire des biocarburants et composés chimiques à partir d'une matière première végétale renouvelable. L'objectif de ce travail est de caractériser et de modéliser le métabolisme du micro-organisme Trichoderma reesei, afin d'optimiser le protocole industriel de production de cellulases. Cette étude a été réalisée sur des milieux modèles représentatifs de ceux attendus à l'échelle industrielle. Tout d'abord, la stoechiométrie des réactions de croissance et de production a été établie, puis une étude cinétique a été menée pour mesurer précisément le comportement du micro-organisme à forte induction de la production de cellulases. Le modèle résultant a été utilisé pour optimiser le protocole industriel de production. Ensuite, l'intégration de cette étape dans une bioraffinerie lignocellulosique a été étudiée, avec l'effet sur le métabolisme i) des mélanges de sucres disponibles, ii) des composés inhibiteurs issus de la dégradation de la lignocellulose, et iii) du changement d'échelle. Ces travaux ont fait progresser de façon substantielle les connaissances du métabolisme de T. reesei en ce qui concerne la production de cellulases, et les modèles développés sont des outils d'aide rationnelle à la définition d'un procédé de production de cellulases intégré dans une bioraffinerie lignocellulosique. / In the global energetic and climatic context, the high cost of the cellulolytic enzymes (cellulases) postpones the development of lignocellulosic biorefineries, dedicated to produce biofuels and chemical compounds from renewable vegetable feedstocks. The aim of this work was to measure and model the metabolism of the micro-organism Trichoderma reesei, in order to optimize the industrial protocol for the production of cellulase. This study was carried out using synthetic media representative of industrial ones. First, the stoichiometries of growth and protein production reactions were determined. Then, a kinetic study was conducted to precisely measure the specific rates of T. reesei at high induction of cellulase production. The resulting model was used to optimize the industrial production protocol. Finally the integration of this step in a lignocellulosic biorefinery was studied by determining the impacts on the metabolism of i) available sugar mixtures, ii) inhibitory compounds from lignocellulosic biomass degradation, and iii) scale-up. These results significantly contributed to improve the knowledge of T. reesei metabolism on cellulase production. The developed models are rational tools for the optimization of a cellulase production protocol suited to lignocellulosic biorefineries.

Ce travail étudie l'intérêt de l'ajout d'hydrolysats de levure dans un procédé de culture de cellules CHO productrices d'anticorps en vue, d'une part, de déterminer leur condition d'utilisation et leur rôle, et, d'autre part, de caractériser les composés actifs. Pour répondre à ces objectifs, une démarche intégrant des études cinétiques, des stratégies de fractionnement et l'analyse biochimique des hydrolysats et de leurs fractions a été développée. En premier lieu, il a été montré que les hydrolysats de levure présentent des effets significatifs sur les cultures selon leur composition et les conditions d'ajout. De même, des effets synergiques ont été mis en évidence par le mélange d'hydrolysats générés à partir de différents procédés. D'autre part, des études cinétiques ont permis de corréler l'influence positive des hydrolysats sur la croissance cellulaire à l'amélioration du métabolisme énergétique. Dans un deuxième temps, la nature biochimique et le rôle des composés actifs ont été étudiés par la mise en oeuvre d'un procédé de nanofiltration membranaire et la reconstitution de mélanges de molécules contenues dans un extrait de levure (EXL). Ces résultats ont mis en évidence l'intérêt des di- et tri-peptides pour approvisionner le métabolisme énergétique et de molécules non nutritives, de poids moléculaire supérieur à 500 Da, pour stimuler la vitesse spécifique de croissance des cellules. Finalement, le rétentat issu de la nanofiltration de l'EXL a été fractionné à l'aide de divers procédés chromatographiques, unitaires ou associés, pour caractériser les propriétés physico-chimiques des composés actifs. L'effet des fractions sur la culture de cellules a alors souligné l'intérêt des molécules chargées positivement, et plus particulièrement, des peptides hydrophiles et cationiques pour stimuler la croissance des cellules. Ainsi, nos travaux permettent de mieux appréhender les mécanismes d'action des hydrolysats de levure sur les cellules CHO productrices d'anticorps et proposent des voies d'optimisation pour la simplification d'additifs complexes dans les milieux de culture dédiés à la culture de cellules animales / This work studies the interest of the addition of yeast hydrolysates in culture medium of CHO cell producing antibody, to determine the operating conditions and their role, but also to improve the characterization of active compounds. In this way, an integrated approach including kinetic studies, fractionation strategies and biochemical analysis of hydrolysates and of their fractions was developed. First, we showed that yeast hydrolysates exhibited various properties depending on their composition and the operating conditions. In addition, synergistic effects were observed with different hydrolysate mixtures. Besides, kinetic studies underlined that the positive influence of hydrolysates on cell growth is correlated with energetic metabolism improvement. Then, the biochemical nature and the role of active compounds were studied by the implementation of a nanofiltration process and the reconstitution of mixtures of molecules contained in a yeast extract (YE). The results highlighted the interest of di- and tri-peptides to supply energetic metabolism, and of non-nutritive molecules, exhibiting a molecular weight greater than 500 Da, to stimulate the specific cell growth rate. Finally, the retentate fraction of nanofiltrated YE was fractionated by various chromatographic processes to characterize the physico-chemical properties of active compounds. The effect of fractions on cell culture emphasized the positive effect of positively charged molecules, especially hydrophilic and cationic peptides, to stimulate the cell growth. Thus, our work provides important insights in yeast hydrolysate mechanisms on CHO cells and suggests procedures to simplify such a complex additive of media dedicated to mammalian cell culture

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