Les mécanismes moléculaires impliqués dans la régulation du programme génétique de l'épithélium intestinal sont encore à ce jour très peu connus. Dans ce travail, nous avons étudié la régulation des membres de la famille de facteurs de transcription C/EBP en utilisant la lignée épithéliale intestinale de crypte IEC-6 afin de mieux comprendre le rôle de ces gènes dans l'intestin. Dans un premier temps, nous avons vérifié par Northern l'expression des ARNm des C/EBPs suite à la stimulation des cellules avec du sérum qui favorise la prolifération cellulaire et avec un traitement au dexaméthasone qui diminue la prolifération cellulaire. Le sérum induit à des niveaux variables les ARNm des trois isoformes alors que les niveaux d'ARNm de C/EBP? et C/EBP? augmentent rapidement suite à un traitement aux glucocorticoïdes. Par des études de run-on, nous démontrons que le sérum agit surtout par des mécanismes post-transcriptionnels alors que le dexaméthasone influence les niveaux d'ARNm principalement au niveau transcriptionnel. Les analyses par Western nous permettent de constater une induction des trois protéines C/EBP?, ? et ?, parallèle à celle des ARNm suite à une stimulation par le sérum. Par contre, les variations de l'expression de ces trois protéines en présence de dexaméthasone par rapport aux niveaux d'ARNm témoignent d'une certaine régulation post-traductionnelle. La capacité de liaison à l'ADN des C/EBPs augmente suite à la stimulation par le sérum mais ne varie pas suite à un traitement au dexaméthasone, tel que révélé par la technique de rétention sur gel. Des études d'immunofluorescence montrent une localisation nucléaire pour C/EBP? et C/EBP?. Par contre, pour la première fois, nous démontrons une localisation différente de C/EBP?, soit périnucléaire et cytoplasmique, contrairement à une localisation nucléaire chez les hépatocytes et adipocytes. La régulation complexe des C/EBPs dans ces conditions particulières suggère un rôle potentiel de ceux-ci dans la croissance et la réponse inflammatoire des cellules épithéliales intestinales de la crypte.

Le récepteur ionotropique P2X[indice inférieur 7] (P2X[indice inférieur 7]R) est impliqué dans divers rôles physiologiques tels la prolifération, l'apoptose, la réponse inflammatoire et le trafic membranaire dans plusieurs types cellulaires. Cependant, peu est connu quant aux rôles physiologiques du P2X[indice inférieur 7]R dans les cellules épithéliales intestinales (CEIs). Dans la littérature scientifique, le P2X[indice inférieur 7]R est connu pour activer la protéine kinase Dl (PKD1/PKC[mu]) qui est impliquée dans le transport des protéines membranaires. Comme l'un des rôles physiologiques majeurs des CEIs est le transport et l'absorption du glucose, le transporteur à glucose de type 2 (Glut2) a été ciblé afin d'étudier son transport membranaire suite à l'activation du P2X[indice inférieur 7]R. Glut2 est un élément clé dans le métabolisme du glucose par les CEIs. Une hypothèse stipulant que le P2X[indice inférieur 7]R serait impliqué dans le trafic membranaire de Glut2 par une voie dépendante de la PKD1/PKC[mu] a été émise. Les objectifs majeurs de l'étude étaient de déterminer le profil d'expression du P2X[indice inférieur 7]R selon le stade de différenciation des CEIs, d'élucider les mécanismes moléculaires régulant l'expression du P2X[indice inférieur 7]R, d'étudier la signalisation intracellulaire affectant l'expression membranaire de Glut2 induite par l'activation du P2X[indice inférieur 7]R. D'abord, le profil d'expression du P2X[indice inférieur 7]R en fonction de la différenciation des CEIs a été déterminé par immunofluorescence indirecte sur des sections de jéjunum de souris normales et par immunobuvardage de type western sur des lysats de cellules Caco-2/15 prolifératives et différenciées. Ensuite, la signalisation induite par l'activation du P2X[indice inférieur 7]R a été étudiée en stimulant des cellules IEC-6 avec de l'ATP ou du BzATP, deux agonistes du P2X[indice inférieur 7]R, et en prétraitant les cellules avec de l'oATP, un antagoniste du P2X[indice inférieur 7]R. Différents inhibiteurs pharmacologiques tels le UO126 (MEK1/2) et la rottlerine (PKC[delta]) ont été utilisés pour déterminer l'ordre des protéines dans les voies de signalisation. Également, différents chélateurs de calcium, comme le BAPTA-AM et l'EGTA, ont été utilisés pour étudier la dépendance des voies trouvées au calcium. L'expression de Glut2 à la membrane plasmique suite à la stimulation du P2X[indice inférieur 7]R a été étudiée par immunofluorescence indirecte et par biotinylation des protéines membranaires de surface. Finalement, la régulation transcriptionnelle du P2X[indice inférieur 7]R dans les cellules HEK 293T et Caco-2/15 a été étudiée par des essais luciférase qui permettent de visualiser l'interaction entre le promoteur du P2X[indice inférieur 7]R et des facteurs de transcription cibles comme Cdx-2, GATA-4, HNF-4[alpha], C/EBP[alpha] et C/EBP[bêta]. Les résultats obtenus démontrent que l'expression du P2X[indice inférieur 7]R augmente en fonction de l'état de différenciation des cellules Caco-2/15, ce qui coïncide avec sa localisation dans les deux tiers supérieurs de la villosité de jéjunum de souris normales. Aussi, l'activation du P2X[indice inférieur 7]R amène une augmentation de la phosphorylation des protéines PKD1/PKC[mu], PKC[delta], ERK1/2, MEK1/2, SAPK/JNK, p90RSK et CREB. Également, la PKC[delta] est en amont des protéines MEK1/2 et ERK1/2 qui elles-mêmes sont en amont de la PKD1/PKC[mu]. Cette voie PKC[delta]/MEK/ERK/PKD est également indépendante du calcium extracellulaire et intracellulaire. Aussi, il y a internalisation et diminution de l'expression membranaire de Glut2 suite à l'activation du P2X[indice inférieur 7]R par le BzATP. Finalement, le P2X[indice inférieur 7]R est régulé au niveau transcriptionnel par les facteurs de transcription HNF-4[alpha], C/EBP[alpha] et C/EBP[bêta] mais pas par Cdx-2 et GATA-4. En résumé, les résultats démontrent que le P2X[indice inférieur 7]R est impliqué dans l'internalisation et la diminution de l'expression membranaire de Glut2 par un mécanisme qui semble dépendant de la voie PKC[delta]/MEK/ERK/PKD calcium-indépendante.

Le récepteur ionotropique P2X7 est impliqué dans diverses fonctions physiologiques telles que la prolifération, l’apoptose, la réponse inflammatoire et le trafic membranaire dans plusieurs types cellulaires. Cependant, peu est connu quant aux rôles physiologiques de P2X7 dans les cellules épithéliales intestinales (CEIs). Dernièrement, un collègue a démontré une nouvelle fonction pour P2X7 qui est de réguler l’internalisation du transporteur à glucose GLUT2. Comme l’un des rôles physiologiques majeurs des CEIs est l’absorption du glucose, la régulation de ce transporteur est d’une importance capitale. Par contre, nous ne savons pas ce qui permet de réguler l’expression du récepteur P2X7 dont la disponibilité pourrait être un des facteurs déterminants dans la régulation de l’absorption de glucose par le transporteur GLUT2. Ceci nous a menés à l’hypothèse suivante qui dit que le glucose lui-même pourrait stimuler certaines voies de signalisation menant à l’activation de facteurs de transcription, qui pourraient réguler l’expression du récepteur P2X7. Les objectifs de mes travaux de maîtrise étaient de déterminer si des variations dans la concentration de glucose affectaient l’expression de P2X7 dans les CEIs et d’identifier les facteurs de transcription impliqués dans ce processus. Les résultats obtenus démontrent que l’expression de P2X7 semble être affectée par la concentration de glucose. Cette régulation de l’expression de P2X7 en réponse au glucose semble impliquer les facteurs de transcription C/EBP? et ß. En fait, les essais d’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) effectués confirment que ces facteurs pouvaient lier le promoteur de P2X7 et que la liaison de C/EBPß au promoteur varie en fonction de la concentration de glucose. La capacité de liaison de C/EBPß au promoteur est comparable au niveau d’expression du gène du récepteur P2X7. In vivo, nous avons observé une diminution de l’expression du récepteur P2X7 dans les extraits de jéjunum de souris invalidées pour C/EBPß. Finalement, dans le modèle de souris diabétique NOD, il semble y avoir un dérèglement dans l’expression du récepteur P2X7, ce qui pourrait indiquer que P2X7 a bel et bien un rôle dans la régulation de l’homéostasie du glucose. [symboles non conformes]