Rôle de l’IL-6 dans la régulation des réponses Th2:<p>Les réponses de type Th2 sont indispensables à l’élimination des parasites extracellulaires tels que les helminthes. Cependant, une réponse Th2 non contrôlée et dirigée contre des antigènes inoffensifs présents dans notre environnement entraine une réponse allergique délétère pour l’organisme. L’initiation d’une réponse Th2 doit donc être un processus hautement contrôlé. Or les signaux émis par les cellules dendritiques afin d’initier une telle réponse n’ont pas encore tous été identifiés à ce jour. <p>L’IL-6 est une cytokine pouvant être sécrétée par de nombreux types cellulaires et dont le rôle dans la régulation des réponses Th2 semble dépendre du moment où elle est sécrétée. L’objectif de ce travail est donc d’étudier spécifiquement le rôle de l’IL-6 produit par les cellules dendritiques (DC) dans l’initiation des réponses Th2 in vivo. <p>Au cours de ce travail, nous avons montré que les DC dérivées à partir de la moelle (BMDC) de souris IL-6-/- induisent une réponse Th2 exacerbée, et ce par un mécanisme nécessitant la présence des cellules iNKT. Nos résultats suggèrent en outre que c’est l’IL-6 produite par la BMDC au moment où elle active le lymphocyte T qui inhibe la réponse Th2, par un mécanisme dépendant du contact entre ces cellules. Enfin, nous avons montré que les DC spléniques IL-6-/- n’induisent pas de réponse Th2 in vivo. L’ensemble de ces résultats suggère que les mécanismes d’initiation et de contrôle de la réponse Th2 sont multiples et dépendent du type de DC initiant la réponse ainsi que des cellules de l’immunité innée présentes dans l’environnement du lymphocyte T au moment de son activation.<p>Rôle de l’AMPK dans la régulation des réponses immunes:<p>L’activation d’un lymphocyte T induit sa prolifération et sa différenciation en lymphocyte T effecteur. L’ensemble de ces processus est coûteux énergétiquement. De plus, le lymphocyte T circulant dans l’organisme afin d’y exercer ses fonctions effectrices est confronté à des environnements au sein desquels les apports énergétiques peuvent varier.<p>L’ « AMP-activated Protein Kinase » (AMPK) est une protéine kinase dont le rôle est de maintenir l’homéostasie énergétique de la cellule lorsque celle-ci subit un stress métabolique. Or la stimulation d’un lymphocyte via son TCR induit l’activation de l’AMPK. Nous avons donc voulu étudier le rôle de cette enzyme dans la régulation des réponses immunes. Dans ce but, nous avons analysé le système immunitaire des souris AMPKα1-/-. En effet, cette sous-unité est la seule sous-unité catalytique de l’enzyme exprimée par les lymphocytes.<p>Nous avons observé que les lymphocytes AMPKα1-/- sont plus sensibles à un stress métabolique in vitro. Ces cellules restent néanmoins capables de répondre à une stimulation antigénique in vitro et in vivo. Les souris AMPKα1-/- développent en outre des réponses humorales, des réponses cytotoxiques et une réaction d’hypersensibilité retardée normale en réponse à l’injection d’antigènes. Ces résultats suggèrent que l’AMPK ne joue pas de rôle dans l’activation des lymphocytes T, du moins dans les modèles étudiés au cours de ce travail. Cependant, nous avons observé une diminution importante du nombre de cellules iNKT présentes dans le foie de ces souris, suggérant un rôle de l’AMPK dans l’homéostasie de ces cellules.<p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La voie des kynurénines est l’une des trois voies de biosynthèse du NAD, qu’elle produit à partir de la dégradation du plus rare des acides aminés essentiels, le tryptophane. Cette voie catabolique est initiée par trois enzymes distinctes, dont l’indoléamine 2,3-dioxygénase 1 (IDO-1). L’IDO-1 est la seule des trois enzymes dont l’expression est induite par des stimuli pro-inflammatoires tels que l’IFN-γ, le TNF-α ainsi que des produits bactériens et viraux. De plus, son expression est induite de manière particulièrement importante au cours de la maturation des cellules dendritiques (DC) qui jouent un rôle clé, tant dans les réponses immunes innées qu’adaptatives. Par conséquent, outre la production d’un cofacteur essentiel du métabolisme cellulaire, le catabolisme du tryptophane participe également à la régulation de la réponse immune. <p><p>En effet, la fonction d’agent antimicrobien fut la première attribuée à l’IDO-1 parce qu’en réponse aux stimuli inflammatoires, celle-ci dégrade le tryptophane et limite la prolifération d’organismes pathogènes auxotrophes pour cet acide aminé. Ensuite, l’inhibition de l’activité catalytique de l’IDO-1 par une approche pharmacologique permit de mettre en évidence la contribution de cette enzyme au phénomène de tolérance maternelle pour les fœtus semi-allogéniques qu’elle porte. Enfin, sa participation à la tolérance périphérique fut proposée étant donné sa capacité à induire le développement de Treg ou à leur servir de mécanisme effecteur. Cependant, ces deux dernières fonctions ne sont pas très claires puisque les souris invalidées pour le gène de l’IDO-1 (IDO-1-/-) ne présentent ni défaut reproducteur, ni signe d’auto-immunité spontanée.<p><p>Comme deux publications récentes suggéraient que l’inhibition pharmacologique de l’IDO-1 affecte la maturation des moDC humaines, nous avons effectué une analyse détaillée du compartiment immunitaire des souris IDO-1-/-, avec une attention toute particulière pour les DC. Au début, nous avons également constaté un important défaut de la maturation des BMDC IDO-1-/- générées in vitro en présence de GM-CSF. Cependant, le défaut se révéla extrêmement dépendant des conditions de culture, puisqu’un changement de substrat de culture ou de facteur de croissance suffit à restaurer une maturation normale de ces cellules. De même, l’analyse de la maturation des DC spléniques démontra de manière claire que l’IDO-1 n’est certainement pas essentielle à la maturation des DC in vivo.<p> <p>Nous avons ensuite montré que l’expression fonctionnelle d’IDO-1 protège les cellules et potentiellement les souris qui l’expriment lorsqu’elles sont soumises à des stress oxydatifs, suggérant que l’IDO-1 puisse consommer les anions O2- afin d’assurer son activité catalytique. Contre toute attente, nous avons ensuite constaté que les souris IDO-1-/- survivent plus longtemps aux infections par la forme pléiomorphe du parasite Trypanosoma brucei brucei. Bien que la levée de l’inhibition de la lymphoprolifération chez les souris IDO-1-/- soit l’explication la plus évidente de l’augmentation de leur survie, nous suggérons plutôt que c’est la perte de la fonction antioxydante de l’IDO-1-/- qui leur confère cette résistance. <p><p>En conclusion, l’IDO-1 ne semble pas jouer un rôle important dans la différenciation et maturation des cellules dendritiques. Nos observations préliminiares indiquent cependant que cette enzyme pourrait jouer un rôle anti-oxydant, et protége donc les cellules dendritiques d’un stress oxydant potentiellement causé lors des réponses innées anti-microbiennes.<p> / Doctorat en sciences, Spécialisation biologie moléculaire / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Dans cette étude, nous avons tenté de décrypter les mécanismes reliant l’augmentation de lymphocytes infiltrant les tumeurs (LIT) T CD8+ et un pronostic clinique défavorable dans le cancer du rein à cellules claires (ccRCC). Pour cela, nous avons déterminé 1) la relation entre le pronostic associé à l'expression d’immune checkpoints et l’infiltrat de cellules dendritiques (DC) et de LT CD8+ et 2) les caractéristiques phénotypiques des LIT T CD8+. L’expression des immune checkpoints a été déterminée par immunohistochimie dans une cohorte de 135 ccRCC. Nous avons constaté que les densités des cellules exprimant CD8, PD-1 et LAG-3 sont corrélées, et associées à une diminution de PFS et OS. Egalement, les patients dont les tumeurs présentent des densités élevées de cellules PD-1+ et PD-L1 et/ou PD-L2 +, ont le taux de survie le plus faible. Des densités élevées de DC immatures isolées dans le stroma tumoral sont associées à une forte expression d’immune checkpoints et à un faible taux de survie chez ces patients. En revanche, les patients présentant un taux de survie prolongé ont une densité élevée de lymphocytes CD8+, des DC matures au sein de structures lymphoïdes tertiaires, ainsi qu’une faible expression d’immune checkpoints. Nous avons analysé les LIT T CD8+ chez 21 patients ccRCC par Cytométrie de Flux. On a trouvé un groupe de patients (8/21) dont les tumeurs sont caractérisées par la surexpression de marqueurs inhibiteurs (PD1 et TIM3) et de d'activation (CD69 et CD38), par l'expansion des cellules T CD8 + mémoires effectrices et un plus grand potentiel d’agressivité. En résumé, nous avons démontré qu’une densité élevée de LIT T CD8+ dans les ccRCC est accompagnée d’une forte expression d’immune checkpoints et d’une réponse immunitaire mal coordonnée dans un sous-groupe de tumeurs agressives. / To decipher the potential mechanisms linking increased CD8+ T cell infiltration with an adverse clinical outcome in ccRCC, in this study we determined: 1) the prognosis associated with the expression of immune checkpoints and its coordination with dendritic cell (DC) and CD8+ cell infiltration, and 2) the phenotypic traits of CD8+ tumor infiltrating lymphocytes. The prognosis associated with CD8+ and DC infiltrations, in addition to the expression of immune checkpoints were investigated in a cohort of 135 ccRCC by quantitative immunohistochemistry. We found that the densities of CD8+, PD-1+ and LAG-3+ cells were closely correlated, and independently associated with decreased PFS and OS. In addition, patients whose tumors presented both high densities of PD-1+ cells and PD-L1+ and/or L2+ tumor cells, displayed the worst clinical outcome. High densities of immature DC isolated in the tumour stroma were associated with high expression of immune checkpoints and patients’ poor clinical outcome. In contrast, the presence of mature DC within Tertiary Lymphoid Structures identified, among the tumours with high CD8+-TIL densities, those with low expression of immune checkpoints and prolonged survival. We also investigated the phenotype of freshly isolated CD8+TIL in 21 ccRCC by flow cytometry. We found a group tumors (8/21) characterised by the over-expression of inhibitory (PD-1 and TIM-3) and activation markers (CD69 and CD38), the expansion of the effector memory cell subpopulation (CCR7-CD45RA-), and a trend toward more aggressive features. In summary, we demonstrated that the infiltration with CD8+ TIL in ccRCC is accompanied by the enhanced expression of immune checkpoints and a poorly coordinated immune response in a subgroup of aggressive tumors.

Il est maintenant bien établi que le microbiote du tractus digestif humain joue un rôle important dans la santé humaine. Pourtant, nous commençons à peine à comprendre les mécanismes moléculaires par lesquels les bactéries agissent sur les cellules hôtes, des connaissances qui pourraient fournir des nouvelles orientations dans le traitement et la prévention de maladies. Cette dernière décennie a vu un développement rapide des études du microbiote intestinal, et à présent des quantités importantes de données métagénomiques ainsi que des centaines de séquences génomiques de bactéries commensales sont disponibles. Ensemble, ces données fournissent une plateforme pour des approches in silico pour l'identification de molécules bactériennes impliquées dans la communication moléculaire avec l'hôte. Le défi consiste à développer des stratégies efficaces d'exploration de données et de validation, permettant de passer de corrélations et prédictions à des interactions bactérie - hôte fonctionnelles, validées expérimentalement. Le travail présenté dans cette thèse vise à démontrer l'importance d'analyses in silico afin d'élargir nos connaissances sur les interactions bactéries - hôtes. Il montre également comment cette information peut être appliquée dans des études fonctionnelles visant à identifier des molécules effectrices bactériennes fonctionnelles. Les principaux résultats peuvent être divisés en trois parties. La première partie traite de l'élaboration et de la validation d'un système hôte - vecteur pour des études de (méta)génomique fonctionnelle. La deuxième partie décrit une étude fonctionnelle où un certain nombre d'effecteurs candidats ont été identifiés parmi les protéines sécrétées et de surface de bactéries à Gram positif par une approche d'exploration in silico. Il décrit également l'application du nouveau système hôte - vecteur pour l'évaluation du rôle de ces candidats dans l'immuno-modulation. Enfin, dans la troisième partie, nous présentons une étude in silico qui a permis l'identification de fonctions bactériennes sur- ou sous-représentées dans une sélection de bactéries à Gram positif du tractus digestif humain. / It is now well established that the human gastrointestinal tract microbiota plays an intricate role in human health. However, we are only beginning to understand the molecular mechanisms by which bacteria act on the host cells, knowledge that could provide new directions in treating and preventing disease. The last decade has seen a rapid development of the gut microbiota field, and presently abundant metagenome data and hundreds of genome sequences of individual commensal bacteria are available. Together, these data provide a platform for in silico mining approaches to identify bacterial molecules involved in communication with the host. The challenge is to develop efficient mining and validation strategies, in order to move from correlations and predictions to experimentally validated functional bacteria – host relationships. The work presented in this thesis aims to demonstrate the importance of in silico analyses to broaden our knowledge on bacteria - host interactions. It also shows how this information can be applied in functional studies aiming to identify functional bacterial effector molecules. The main results can be divided in three parts. The first part deals with the development and validation of a host - vector system for functional (meta)genomics studies. The second part describes a functional study where a number of candidate effectors were identified among secreted and surface-exposed proteins from Gram-positive bacteria using an in silico mining approach. It also describes the application of the newly developed host - vector system to evaluate the role of these candidates in immune modulation. Finally, in the third part we present an in silico study that identified new bacterial functions over- or under-represented in a selection of Gram-positive human gut bacteria.

Selon le modèle standard de l'hématopoïèse, la différenciation des cellules souches hématopoïétiques est un processus graduel de type arborescent. La première séparation a lieu au niveau de cellules multipotentes qui se scindent en progéniteurs lymphoïdes et myéloïdes communs. Bien que l'architecture de l'hématopoïèse humaine reste encore mal connue, de nombreux travaux suggèrent qu'elle ne suit pas le modèle standard. À ce jour encore, la question de l'existence d'un équivalent humain du CLP murin, n'a pas été tranchée. L'étude de l'hématopoïèse humaine soulève des problèmes méthodologiques. Ceci est lié au difficile accès au; prélèvements de moelle primaire et les études sur le sang placentaire ne reflètent pas complétement le développement médullaire. Dans ce travail, nous avons utilisé un modèle in vivo d'hématopoïèse foetale humaine chez la souris NSG par xénogreffe de progéniteurs du sang placentaire. La caractérisation faite sur les populations générées dans la moelle osseuse de souris a révélé que ce modèle reproduit l'hématopoïèse foetale humaine. Nous montrons que la lymphopoïèse foetale humaine présente une organisation originale caractérisée par une duplication des axes développementaux. Nos travaux mettent en évidence l'émergence indépendante de deux type de progéniteurs lymphoïdes à partir d'un intermédiaire multipotent: une population ancestrale CD127+générant principalement des lymphocytes B folliculaires, ainsi que des cellules ILC3 ; une population CD127- générant des lymphocytes T, des lymphocytes B de la zone marginale, et des cellules NK/ILC1. Ces résultats montrent que l'hématopoïèse humaine ne suit pas le modèle standard établi chez la souris. / The standard model of hematopoiesis proposes that hematopoietic differentiation is a stepwise bifurcation process. The first separation downstream of hematopoietic stem cells will segregate mutipotent progenitors into common lymphoid and myeloid progenitors. In human many evidences support the idea that human hematopoietic organization doesn't follow the classical model, but the question was not concluded and need for further investigation. Due to limited access to primary bone marrow samples and lack of appropriate in vivo model human studies face many difficulties. In this work, we used a xenogeneic model of human fetal hematopoiesis in immune-deficient mice to dissect the early stages of lymphoid development. This model relies on the injection of UCB CD34+ cells into NSG mice. Flow cytometry analysis and gene expression profiling of humanized mice BM populations revealed that this model faithfully reproduces human fetal hematopoiesis. Combining in vitro differentiation assays to molecular studies and genetic approaches, we show that fetal human lymphopoiesis displays a dual organization, split into an ancestral CD127+ CLP-like population devoid o myeloid potential that differentiate preferentially into follicular B cells and ILC3s, and into a previously undescribed CD127- population mainly dedicated to the generation of T, marginal zone B, NK, and ILC1s We also provide evidence that Early Lymphoid Progenitors emerge independently from multipotent developmental intermediates referred to as lympho-mono'dendritic progenitors. These results confirm that human hematopoiesis doesn't follow the standard model of hematopoietic differentiation established in the mouse.

Certaines fibres alimentaires réduiraient l'apparition des cancers colorectaux mais l'hypothèse reste contreversée. Un des mécanismes fait intervenir la production par fermentation de butyrate. Nous avons testé deux fibres butyrogènes chimiquement différentes (fructo-oligosaccharides à chaîne courte scFOS, et amidon résistant) versus une fibre faiblement productrice de butyrate (son de blé désamidonné) chez la souris Min, un modèle de carcinogenèse intestinale spontanée. Seul le régime scFOS réduisait le nombre de tumeurs coliques et stimulait l'immunité locale. La nature chimique de la fibre ou bien les propriétés prébiotiques des scFOS (ils favorisent la croissance de bactéries lactiques qui agiraient sur la réaction immunitaire) sont donc impliquées. Deux autres types d'amidons résistants réduisaient le nombre de petites tumeurs. L'addition de bifidobactéries à l'un de ces deux régimes réduisait le nombre de petites tumeurs, mais augmentait celui de grosses tumeurs illustrant le concept de modulation par l'immunogénicité de la dualité immunofacilitation/surveillance. La déplétion en lymphocytes T associée au régime scFOS doublait le nombre de tumeurs par rapport aux souris immunocompétentes. Le régime scFOS diminuait l'expression du récepteur à l'IL2 à la surface des lymphocytes intra-épithéliaux (LIE) suggérant la mise en anergie temporaire du système immunitaire, mais pouvant aussi signifier l'implication d'une autre voie d'activation des LIE. Enfin, pour mettre en place une modélisation des intéractions lympho-épithéliales, nous avons croisé des souris C57BL6 et Min avec la souris transgénique Immortomouse et isolé à partir de primo-cultures de muqueuses des lignées cellulaires conditionnellement immortalisées saines et mutées sur Apc. Ce modèle permettra d'étudier en co-culture sur filtre, l'influence des glucides indigestibles et de leurs produits de fermentation sur les interactions lympho-épithéliales au cours de la carcinogenèse.

La radiothérapie implique de limiter l'irradiation des tissus sains. Dans ce but, des nanocapsules lipidiques chargées en complexes lipophile de rhénium-188 (NCL188Re-SSS) ont été utilisées afin de créer une irradiation localisée après injection intra-tumorale. Nous avons ainsi évalué la faisabilité d'une radiothérapie interne après injection intra-hépatique de NCL188Re-SSS pour le traitement du carcinome hépatocellulaire (CHC) et, dans un deuxième temps, étudié l'efficacité d'un fractionnement de la dose radioactive après injections intra-crâniennes répétées pour le traitement des gliomes. La première partie de ce travail décrit l'intérêt d'une radiothérapie interne via les NCL188Re-SSS pour le traitement du CHC avec une augmentation de la médiane de survie jusqu'à 107% dans un modèle CHC chimio-induit chez le rat. Dans une seconde partie, nous avons pu démontrer un bénéfice majeur, sur un modèle de gliome, avec 83% des animaux long-survivants. Cette efficacité thérapeutique pourrait s'expliquer par la mise en place d'une réponse immunitaire adaptative avec recrutement local de cellules immunitaires effectrices (CD4+, CD8+...). En revanche, les essais d'une radiothérapie interne nanovectorisée sur un modèle de rat peu immunogène et radiorésistant (modèle tumoral F98) ont montré des bénéfices moindres en terme de survie. Pour stimuler la réponse immunitaire anti-tumorale et optimiser l'efficacité thérapeutique, nous avons évalué la combinaison d'une radiothérapie interne nanovectorisée et d'une vaccination par cellules F98 irradiées. Un recrutement des cellules immunitaires effectrices a été observé, cependant, l'efficacité thérapeutique n'a pas été augmentée. Les perspectives qu'offre ce travail sont de deux ordres : évaluer l'impact du processus angiogénique dans le cas du modèle CHC et stimuler le système immunitaire en association avec la radiothérapie interne pour le modèle de gliome.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Le risque de LH est augmenté en cas de déficit immunitaire acquis ou inné. Les déficits immunitaires innés associés à un risque accru de LH, sont les DICV (Déficit Immunitaire Commun Variable), XLP (Syndrome lymphoprolifératif lié au chromosome X) et ALPS (Syndrome lymphoprolifératif Autoimmun). L'objectif de notre travail était d'évaluer la prévalence de ces déficits immunitaires chez des enfants atteints de LH. Nous avons reçu, 395 prélèvements de patients atteints de LH au diagnostic. L'âge médian de la population étudiée est de 13 ans, allant de 3 à 18 ans. Le sex-ratio M/F est de 1.1. Il augmente à 3 au dessous de l'âge de 10 ans. Parmi les biopsies (n=84) qui ont été relues, 87% sont de type scléro-nodulaires (SN), 7% à cellularité mixte (CM) et 6% non spécifié. L'EBV est détecté in situ dans 23% des cas de LH. Les patients atteints de LH-EBV+ sont significativement plus jeunes que ceux atteints de LH-EBV- (p=3.10-4). Ce sont plus fréquemment des garçons que des filles (63% ; M/F : 1,7) et fréquemment de sous-type CM (40%). Enfin, ils ont une charge virale EBV significativement plus élevée (p=3.10-3) que les enfants qui ont un LH-EBV-.Parmi les 83 premiers enfants analysés, un immunophénotypage approfondi a montré une diminution de la population lymphocytaire par rapport aux témoins et une lymphopénie B fréquente (31 patients sur 83 soit 37% des patients). La lymphopénie B était corrélée aux facteurs pronostiques connus du LH. Dans un cas parmi les 31, une baisse des immunoglobulines a été mise en évidence ce qui est évocateur de DICV. Nous avons montré que dans les autres cas, les lymphopénies se corrigeaient à distance de la maladie. La recherche de profil cytokinique associé à ces lymphopénies (TGF, BAFF, IL-7) n'a pas permis de mettre en évidence de mécanisme physiopathologique simple pour expliquer ces lymphopénies. Nous émettons l'hypothèse qu'elles sont liées à l'exposition au contact des cellules tumorales à des signaux favorisant l'apopotose.En ce qui concerne la recherche d'autres déficits immunitaires innés, aucun cas évocateur de XLP n'a été mis en évidence sur la base de la quantification des lymphocytes NKT. Cinq cas parmi les 83 (6%) avaient une expansion de lymphocytes T DN (Lymphocytes TCRαβ CD4-CD8-) dans le sang périphérique. Des dosages de Fas ligand et d'IL-10 plasmatiques ont permis d'exclure un ALPS. Au total, nous n'avons pas pu affirmer de défaut qualitatif des sous-populations lymphocytaires évoquant les déficits immunitaires de type XLP et ALPS. Seule une lymphopénie B avec baisse des IgG est évocatrice de DICV. Nous avons étendu l'analyse à l'ensemble des patients (395patients) avec un contrôle à distance du diagnostic pour ceux qui étaient anormaux. Nous avons identifié 4 patients potentiellement atteints de DICV, 1,5%. Parallèlement, nous avons recherché un déficit de la réponse T anti-EBV par cytomètrie de flux et l'Elispot. L'étude de la réponse T anti-EBV par la cytométrie de flux, a montré une tendance vers une baisse de la production d'IL-2 par les CD4 et les CD8 de patients avec une charge virale EBV élevée en réponse à une stimulation par des peptides EBV en présence de lignées autologues. L'étude de la réponse T anti EBV par la technique d'ELISPOT sur 9 patients n'a pas montré globalement de déficit du contrôle de l'EBV sauf pour une jeune patiente de 10 ans ayant une charge virale EBV très élevée sans réponse T anti-EBV efficace. Les résultats que nous avons obtenus restent à approfondir, ce qui permettra d'enrichir les connaissances actuelles sur cette pathologie.