Introdução: As células-tronco apresentam capacidade de proliferação, autorrenovação, potencial de diferenciação e já foram descritas na hipófise estando envolvidas na renovação celular e regulação homeostática, porém pouco se sabe sobre o seu perfil de expressão nos quadros de hipopituitarismo. Dentre os marcadores de células-tronco descritos previamente na hipófise, destacam-se os genes Sox2, Nanog, Nestina, Cd44 e Oct4. Outro marcador, o gene Nr2e1 (Tlx), encontrado em células-tronco neuronais, apresenta-se elevado durante a embriogênese e na vida adulta no cérebro de camundongos, mas, até o momento, não foi caracterizado na hipófise. Objetivo: Analisar a imunolocalização do SOX2 e o padrão de expressão de marcadores de células-tronco/progenitoras, fatores de transcrição precoce, marcadores de apoptose e proliferação celular na hipófise de três linhagens de camundongos com hipopituitarismo de causa genética por alteração em fatores precoces de diferenciação glandular, as linhagens Ames (Prop1) e Snell (Pou1f1), e por fator tardio de conjugação dos hormônios glicoproteicos, a linhagem alfaGSU, nocaute do gene Cga. Material e Métodos: Foram coletadas hipófises nos tempos P0 (ao nascimento), P7 (final da primeira onda de crescimento glandular), 4 semanas (4S-período da puberdade) e 8 semanas (8S-vida adulta). Nas três linhagens de animais, realizou-se imuno-histoquímica com SOX2 e RT-qPCR com os marcadores de células-tronco/progenitoras Sox2, Nanog, Nestina, Cd44, Oct4 e Nr2e1, fatores de transcrição precoces (Hesx1, Hes1 e Otx2), fator de proliferação celular (Ki67), fatores de diferenciação celular (S100beta e Sox9) e marcadores de apoptose (Caspases 3 e 7). A quantificação relativa dos genes-alvo nos animais mutantes teve como calibrador os seus respectivos selvagens. Resultados: A imunolocalização do SOX2 foi observada na zona que circunda a fenda de Rathke (camada marginal) e em nichos difusos pela glândula nas três linhagens estudadas. Na linhagem alfaGSU, evidenciou-se uma redução de Nanog, Nr2e1, Oct4, e Hesx1 em 4S e de Nestina em 8S. Na linhagem Snell, observou-se aumento na expressão de Sox2, Nanog, Cd44, Nr2e1, Hesx1, Hes1, Otx2, S100beta e Sox9 em 4S e aumento de Sox2, Cd44, Hesx1, Otx2 e Sox9 em 8S, associado à redução de Ki67 em ambos os períodos. Na linhagem Ames, evidenciou-se aumento de Sox2, Nanog, Cd44, Hesx1, Hes1, Otx2, S100beta e Sox9 em 4S e 8S. O gene Nr2e1 esteve hiperexpresso em todos os tempos. Houve redução do Ki67 em 4S. As caspases 3 e 7 não se apresentaram alteradas em nenhuma linhagem e/ou tempo. Discussão e conclusão: O padrão de imunolocalização de SOX2 encontrado nas três linhagens estudadas foi semelhante ao descrito em animais sem hipopituitarismo. A evidência da presença do Nr2e1 o coloca como um novo marcador de células-tronco/progenitoras na hipófise. A expressão elevada dos marcadores de células-tronco/progenitoras nas linhagens Ames e Snell sugere que a ausência dos fatores de transcrição precoces não permitiria que a célula tronco/progenitora iniciasse o processo de diferenciação celular, enquanto o oposto ocorreria na linhagem alfaGSU. Adicionalmente, estes achados justificam a hipoplasia hipofisária observada em animais com defeitos em fatores de transcrição expressos no início da diferenciação hipofisária, nos quais o acúmulo de células-tronco pode ser um indicador da indiferenciação hipofisária / Introduction: The role of stem cells, with their capacity for proliferation, self-renewal, and differentiation, has already been described in the cell turnover and homeostatic regulation of the pituitary gland. However, little is known about the expression profiles of these markers in hypopituitarism. Among the stem cell markers previously described in the pituitary include the genes for Sox2, Nanog, nestin, CD44 and Oct4. Another gene marker, Nr2e1 (Tlx), found in neural stem cells, is highly expressed during embryogenesis and adulthood, but so far has not been characterized in the pituitary. Objective: To analyze the immunohistochemical profile of SOX2, as well as the pattern of expression of various markers of stem/progenitor cells, early transcription factors, apoptosis factors and cell proliferation in three pituitary strains of mice with a genetic cause of hypopituitarism. Strains studied with hypopituitarism due to changes in factors of precocious glandular differentiation, include the Ames (Prop1) and Snell (Pou1f1) lineages; hypopituitarism due to the delayed conjugation of glycoprotein hormones include the alfaGSU strain, which is caused by the knockout of the Cga gene. Material and Methods: We collected pituitaries at four time points including P0 (birth), P7 (considered the end of the first wave of growth glandular), 4 weeks (4S - puberty period) and 8 weeks (8S - adulthood). All three strains were subjected to immunohistochemical analysis of SOX2 and RT-qPCR of markers of stem/progenitor cells Sox2, Nanog, Nestin, Cd44, Oct4 and Nr2e1, early transcription factors (Hesx1, Otx2 and Hes1), cell proliferation (Ki67), cell differentiation factors (S100beta and Sox9) and apoptosis (caspases 3 and 7) markers. Relative quantification of target genes in mutant animals was normalized to their respective wild type littermate. Results: The immunolocalization of SOX2 was observed in the area surrounding the Rathke cleft (marginal layer), as well as in diffuse niches throughout the gland in all three strains studied. The alfaGSU strain showed a reduction of Nanog, Nr2e1, Oct4 and Hesx1 at 4S, and Nestin at 8S. The Snell mice exhibited an increase of expression in Sox2, Nanog, Cd44, Nr2e1, Hesx1, Hes1, Otx2, S100beta and Sox9 in at 4S and increased Sox2, Cd44, Hesx1, Otx2 and Sox9 at 8S, associated with the reduction of Ki67 in both periods. The Ames strain showed an increase of Sox2, Nanog, Cd44, Hesx1, Hes1, Otx2, S100beta and Sox9 at 4S and 8S; the gene Nr2e1 was over expressed at all times; and there was reduction in Ki67 at 4S. Caspases 3 and 7 had not changed in any strain, at any time. Discussion and Conclusion: The pattern of immunolocalization of SOX2 found in the three strains studied was similar to that described in animals without hypopituitarism. The presence of Nr2e1 in our study suggests it as a new marker of stem/progenitor cells in the pituitary. The high expression of markers of stem/progenitor cells in the Ames and Snell strains suggests that the absence of early transcription factors Prop1 and Pou1f1 do not allow the stem/ progenitors cells to start the process of cell differentiation, while the opposite occurs in the alfaGSU lineage. Additionally, these findings explain the pituitary hypoplasia observed in animals with defects in early transcription factors, as indicated by the accumulation of stem cells in the Snell and Ames lineages, preventing the initiation of pituitary differentiation

INTRODUÇÃO: Na Neoplasia Endócrina Múltipla tipo 2 (NEM2), o desenvolvimento do Carcinoma Medular de Tireoide (CMT), Feocromocitoma (FEO) e Hiperparatireoidismo primário (HPT) está associado à mutações germinativas ativadoras no proto-oncogene RET. Casos de CMT esporádico podem apresentar mutações somáticas no RET (~40%). A variabilidade fenotípica observada em casos de CMT e FEO familiais associados à NEM2 indica o envolvimento de eventos genéticos adicionais que seriam responsáveis pelas diferenças clínicas observadas nos indivíduos afetados (idade de desenvolvimento, progressão e agressividade do tumor). Outras alterações genéticas no RET como duplas mutações, SNPs e haplótipos específicos podem influenciar na susceptibilidade, agressividade e modulação do fenótipo NEM2. Entretanto, os estudos de outros genes envolvidos no processo da tumorigênese NEM2 ainda estão em andamento. Recentemente foi mostrado que RET ativado controla a expressão de proteínas inibidoras do ciclo celular (p18 e p27). Mutações germinativas no gene p27 foram recentemente associadas à susceptibilidade de tumores neuroendócrinos e estão associadas à síndrome NEM4 (Neoplasia endócrina múltipla tipo 4). Mutações somáticas, inativadoras de p27, são raramente encontradas em vários tipos de tumores. Entretanto, diversos estudos documentaram que a redução na expressão e a sublocalização citoplamática de p27 são controladas por alterações pós-transducionais e/ou epigenéticas. OBJETIVOS: o estudo teve como objetivos avaliar a participação de genes, recentemente associados ao RET ativado, em tumores de pacientes com NEM2 e também verificar se polimorfismos no gene p27 estariam atuando como moduladores de fenótipo em uma grande família com NEM2. CASUÍTICA: foram analisadas 66 amostras tumorais advindas de 36 pacientes com diagnóstico clínico e genético de NEM2 e 28 indivíduos pertencentes a uma grande família com NEM2A-CMTF e mutação C620R no gene RET. MÉTODOS: As análises somáticas do p27 e também de p15, p18 e RET foram realizadas por PCR e sequenciamento direto de DNA e análise de microssatélites para p27 foi realizada por PCR e eletroforese capilar. Análises de expressão e localização da proteína p27 celular foram realizadas por Western blot e imunohistoquímica. A análise da modulação de fenótipo na família com NEM2A foi realizada por meio da amplificação do éxon 1 do gene p27 na amostra de sangue total. RESULTADOS: Não foram encontradas mutações somáticas no gene p27 e também nos genes p15 e p18. Entretanto, verificamos baixa expressão proteica de p27 em tumores CMT e FEO, a qual se encontrava relacionada com o tipo e agressividade do códon mutado no RET, principalmente em tumores que apresentavam mutação RET no códon 634 (controle x 634 p=0,05; controle x 634/791 p= 0,032; 620 x 634 p=0,045; 620 x 634/791 p= 0,002; 620 x 634 + 634/791 p=0,036). Notou-se também correlação positiva entre os níveis de expressão de p27 na localização nuclear, analisada por imunohistoquímica, e o genótipo TT do SNP p27 p.V109G (p=0,03). CONCLUSÕES: Alterações moleculares somáticas no gene p27 nos tumores NEM2 não são frequentes. Entretanto, a redução na expressão e a localização citoplasmática de p27 provavelmente estão associadas a alterações somáticas em outros genes que controlam os processos de fosforilação da proteína p27 (eventos pós-transducionais) / INTRODUCTION: In Multiple Endocrine Neoplasia type 2 (MEN2) the development of medullary thyroid carcinoma (MTC), pheochromocytoma (PHEO) and primary hyperparathyroidism (HPT) are associated with activating germline mutations in RET proto-oncogene. Cases of sporadic MTC may have somatic RET mutations (~ 40%). The phenotypic variability observed in cases with familial MTC/MEN2 and PHEO/MEN2 indicates the probable involvement of additional genetic events that could be responsible for the clinical differences observed in the affected individuals (age development, progression and aggressiveness of the tumor). Other genetic alterations such as RET double mutations, SNPs and specific haplotypes may influence susceptibility, aggressiveness and MEN2 phenotype modulation. However, studies of other genes involved in the tumorigenesis of MEN2 are still in progress. Recently, it was shown that the activated RET controls the expression of cell cycle inhibitory proteins (p18 and p27). Germline mutations in the p27 gene have recently been associated with the susceptibility to neuroendocrine tumors and are associated with the MEN4 syndrome (Multiple endocrine neoplasia type 4). Somatic inactivating mutations p27 are rarely found in many types of tumors. However, several studies have documented that reduced expression and subcellular location of p27 is controlled by post-transductional changes and/or epigenetic factors. OBJECTIVES: This study aimed to evaluate the role of genes recently associated with RET activated in tumors from MEN2 patients and also check whether polymorphisms in the p27 gene would be acting as modulators of phenotype in a large MEN2 family. PATIENTS: We analyzed 66 tumor samples from 36 patients with clinical and genetic diagnosis of MEN2 and from 28 individuals belonging to a large family with FMTC/MEN2A and RET C620R mutation. METHODS: The analyses of somatic p27, p15, p18 and RET were performed by PCR and direct sequencing of DNA and microsatellite analysis was performed for p27 by PCR and capillary electrophoresis. Expression analysis and subcellular localization of p27 protein were performed by Western blot and immunohistochemistry. The analysis of phenotype modulation in MEN2A families was performed by the amplification of exon 1 of the p27 gene in a whole blood sample. RESULTS: There were no somatic mutations in the p27 gene and also in the p15 and p18 genes. However, we verified a low p27 protein expression in MTC/MEN2 and PHEO/MEN2 that showed a definite correlation with the type and aggressiveness of the mutated RET codon, mainly in those tumors from cases with germline RET codon 634 mutations (control vs 634, p=0,05; control vs 634/791, p= 0,032; 620 vs 634, p=0,045; 620 vs 634/791, p= 0,002; 620 vs 634 + 634/791, p=0,036). It was also verified a positive correlation between the immunohistochemistry expression of nuclear p27 subcellular location and the p27 p.V109G TT genotype (p=0,03). CONCLUSIONS: The reduction in the expression of p27 and its subcellular localization are likely to be associated with somatic changes in other genes that control the processes of phosphorylation of p27 protein through post-transductional events

Introdução: Existem dados suficientes disponíveis demonstrando a importância da quimiocina CXCL12 e seu receptor CXCR4 na progressão tumoral e angiogênese dos gliomas. O CXCR4 é regulado positivamente pelo HIF1alfa. Recentemente um novo receptor com maior afinidade à CXCL12 foi identificado, o receptor órfão RDC1, agora denominado CXCR7. O objetivo deste estudo é investigar a expressão de mRNA CXCR7 em tecidos astrocitomas difusos e avaliar suas interações com expressão CXCR4 e HIF1alfa, bem como analisar sua relação com mutação do IDH1. Métodos: A expressão do CXCR7, CXCR4, IDH1 e HIF1alfa foram avaliadas por PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR) em 129 amostras congeladas de astrocitomas (25 astrocitoma difuso - AGII, 18 de astrocitoma anaplásico - AGIII e 86 glioblastoma - GBM) e 22 amostras de tecido cerebral não neoplásico (NN) obtidos de cirurgia de epilepsia. A mutação do IDH1 previamente determinada foi analisada em relação aos níveis de expressões de mRNA do CXCR7, CXCR4 e HIF1alfa, combinado com os parâmetros clínico-patológicos e sobrevida global. Adicionalmente, a expressão proteica do CXCR7 foi analisada por imuno-histoquímica em astrocitomas de diferentes graus e em linhagem celular de glioma (U87MG) por microscopia confocal. Resultados: Houve diferença significativa nos níveis de expressão dos genes estudados entre astrocitomas e NN (p < 0,001). Na análise da expressão gênica associada nos AGII não se observou correlação entre os níveis de expressão de CXCR7/HIF1alfa (p = 0,548); observou-se correlação significativa entre CXCR7/IDH1 (p < 0,001) e CXCR7/CXCR4 (p = 0,042). Nos GBM houve correlação significativa entre CXCR7/CXCR4 (p = 0,002), CXCR7/IDH1 (p < 0,001) e CXCR7/HIF1alfa (p = 0,008). Hiperexpressão do HIF1alfa foi associado com maior expressão do CXCR7 e CXCR4 (p = 0,001), enquanto a presença de IDH1 mutado foi associada a menor expressão de mRNA do CXCR7 e CXCR4 (p = 0,009). A expressão proteica de CXCR7 foi identificada em todas as amostras estudadas, e aumentou com malignidade. A proteína CXCR7, na linha celular U87MG, foi localizada principalmente na membrana celular. Conclusão: O CXCR7 é um gene diferencialmente expresso em astrocitomas difusamente infiltrativos em relação tecido cerebral não neoplásico. O nível de expressão do CXCR7 correlacionou-se significativamente com os níveis de expressão do CXCR4 e IDH1 nos AGII e com CXCR4, IDH1 e HIF-1alfa nos GBM. O nível de expressão elevado do CXCR7 e CXCR4 correlacionou-se com nível elevado de expressão de HIF-1a, enquanto a presença da mutação do IDH1 associou-se a níveis reduzidos de CXCR7 e CXCR4. Não se observou associação significativa entre os níveis de expressão de CXCR7 e CXCR4 com os dados de sobrevida / Introduction: There is abundant evidence showing that chemokine CXCL12 and its receptor CXCR4 are involved in glioma progression and angiogenesis. CXCR4 is upregulated by HIF1alfa. The CXCR7, a recent additional receptor for CXCL12 with higher affinity than CXCR4 has raised key issues on glioma cell migration. The aim of this study is to investigate the CXCR7 mRNA expression in diffuse astrocytoma tissues and to evaluate its interactions with CXCR4 and HIF1alfa expression and IDH1 mutation. Methods: CXCR7, CXCR4, IDH1 and HIF1alfa expressions were evaluated by quantitative real-time PCR (qRT-PCR) in 129 frozen samples of astrocytoma (25 diffuse astrocytomas - AGII, 18 anaplastic astrocytomas - AGIII and 86 glioblastomas - GBM) and 22 samples of non-neoplastic tissue cerebral (NN) from epilepsy surgery. IDH1 mutation status was analyzed with CXCR7, CXCR4 e HIF1alfa mRNA expressions, matched with clinicopathological parameters and overall survival time. Furthermore, CXCR7 protein expression was analyzed by immunohistochemistry in different grades of astrocytoma and in glioma cell line (U87MG) by confocal microscopy. Results: There was significant difference in the expression levels of the genes studied between astrocytomas and NN (p < 0.001). The analysis of associated gene expressions in AGII showed no significant correlation between CXCR7/HIF1alfa (p = 0.548); there was significant correlation between CXCR7/CXCR4 (p = 0.042) and CXCR7/IDH1 (p = 0.008). In GBM, there were significant correlations between CXCR7/CXCR4 (p = 0.002), CXCR7/IDH1 (p < 0.001) and CXCR7/HIF1alfa (p = 0.008). HIF1alfa overexpression was associated with higher expressions of CXCR7 and CXCR4 (p = 0.001), while presence of IDH1 mutation was associated with lower CXCR7 and CXCR4 mRNA expressions (p = 0.009). Protein expression was identified in all samples studied, and it increased with malignancy. CXCR7 protein, in U87MG cell line, was mainly localized in the cellular membrane. Conclusion: CXCR7 was overexpressed in astrocytoma of different grades of malignancy compared to non-neoplastic brain tissue. CXCR7 expression levels correlates with CXCR4 and IDH1 in AGII and CXCR4, IDH1 and HIF1alfa in GBM. Overexpression HIF1alfa was related with higher expressions of CXCR7 and CXCR4, otherwise presence of IDH1 mutation related with lower expression of both genes. Protein expression level was associated with the degree of malignancy. The results revealed no significant association between CXCR7 and CXCR4 expression and survival data

INTRODUÇÃO: Na Neoplasia Endócrina Múltipla tipo 2 (NEM2), o desenvolvimento do Carcinoma Medular de Tireoide (CMT), Feocromocitoma (FEO) e Hiperparatireoidismo primário (HPT) está associado à mutações germinativas ativadoras no proto-oncogene RET. Casos de CMT esporádico podem apresentar mutações somáticas no RET (~40%). A variabilidade fenotípica observada em casos de CMT e FEO familiais associados à NEM2 indica o envolvimento de eventos genéticos adicionais que seriam responsáveis pelas diferenças clínicas observadas nos indivíduos afetados (idade de desenvolvimento, progressão e agressividade do tumor). Outras alterações genéticas no RET como duplas mutações, SNPs e haplótipos específicos podem influenciar na susceptibilidade, agressividade e modulação do fenótipo NEM2. Entretanto, os estudos de outros genes envolvidos no processo da tumorigênese NEM2 ainda estão em andamento. Recentemente foi mostrado que RET ativado controla a expressão de proteínas inibidoras do ciclo celular (p18 e p27). Mutações germinativas no gene p27 foram recentemente associadas à susceptibilidade de tumores neuroendócrinos e estão associadas à síndrome NEM4 (Neoplasia endócrina múltipla tipo 4). Mutações somáticas, inativadoras de p27, são raramente encontradas em vários tipos de tumores. Entretanto, diversos estudos documentaram que a redução na expressão e a sublocalização citoplamática de p27 são controladas por alterações pós-transducionais e/ou epigenéticas. OBJETIVOS: o estudo teve como objetivos avaliar a participação de genes, recentemente associados ao RET ativado, em tumores de pacientes com NEM2 e também verificar se polimorfismos no gene p27 estariam atuando como moduladores de fenótipo em uma grande família com NEM2. CASUÍTICA: foram analisadas 66 amostras tumorais advindas de 36 pacientes com diagnóstico clínico e genético de NEM2 e 28 indivíduos pertencentes a uma grande família com NEM2A-CMTF e mutação C620R no gene RET. MÉTODOS: As análises somáticas do p27 e também de p15, p18 e RET foram realizadas por PCR e sequenciamento direto de DNA e análise de microssatélites para p27 foi realizada por PCR e eletroforese capilar. Análises de expressão e localização da proteína p27 celular foram realizadas por Western blot e imunohistoquímica. A análise da modulação de fenótipo na família com NEM2A foi realizada por meio da amplificação do éxon 1 do gene p27 na amostra de sangue total. RESULTADOS: Não foram encontradas mutações somáticas no gene p27 e também nos genes p15 e p18. Entretanto, verificamos baixa expressão proteica de p27 em tumores CMT e FEO, a qual se encontrava relacionada com o tipo e agressividade do códon mutado no RET, principalmente em tumores que apresentavam mutação RET no códon 634 (controle x 634 p=0,05; controle x 634/791 p= 0,032; 620 x 634 p=0,045; 620 x 634/791 p= 0,002; 620 x 634 + 634/791 p=0,036). Notou-se também correlação positiva entre os níveis de expressão de p27 na localização nuclear, analisada por imunohistoquímica, e o genótipo TT do SNP p27 p.V109G (p=0,03). CONCLUSÕES: Alterações moleculares somáticas no gene p27 nos tumores NEM2 não são frequentes. Entretanto, a redução na expressão e a localização citoplasmática de p27 provavelmente estão associadas a alterações somáticas em outros genes que controlam os processos de fosforilação da proteína p27 (eventos pós-transducionais) / INTRODUCTION: In Multiple Endocrine Neoplasia type 2 (MEN2) the development of medullary thyroid carcinoma (MTC), pheochromocytoma (PHEO) and primary hyperparathyroidism (HPT) are associated with activating germline mutations in RET proto-oncogene. Cases of sporadic MTC may have somatic RET mutations (~ 40%). The phenotypic variability observed in cases with familial MTC/MEN2 and PHEO/MEN2 indicates the probable involvement of additional genetic events that could be responsible for the clinical differences observed in the affected individuals (age development, progression and aggressiveness of the tumor). Other genetic alterations such as RET double mutations, SNPs and specific haplotypes may influence susceptibility, aggressiveness and MEN2 phenotype modulation. However, studies of other genes involved in the tumorigenesis of MEN2 are still in progress. Recently, it was shown that the activated RET controls the expression of cell cycle inhibitory proteins (p18 and p27). Germline mutations in the p27 gene have recently been associated with the susceptibility to neuroendocrine tumors and are associated with the MEN4 syndrome (Multiple endocrine neoplasia type 4). Somatic inactivating mutations p27 are rarely found in many types of tumors. However, several studies have documented that reduced expression and subcellular location of p27 is controlled by post-transductional changes and/or epigenetic factors. OBJECTIVES: This study aimed to evaluate the role of genes recently associated with RET activated in tumors from MEN2 patients and also check whether polymorphisms in the p27 gene would be acting as modulators of phenotype in a large MEN2 family. PATIENTS: We analyzed 66 tumor samples from 36 patients with clinical and genetic diagnosis of MEN2 and from 28 individuals belonging to a large family with FMTC/MEN2A and RET C620R mutation. METHODS: The analyses of somatic p27, p15, p18 and RET were performed by PCR and direct sequencing of DNA and microsatellite analysis was performed for p27 by PCR and capillary electrophoresis. Expression analysis and subcellular localization of p27 protein were performed by Western blot and immunohistochemistry. The analysis of phenotype modulation in MEN2A families was performed by the amplification of exon 1 of the p27 gene in a whole blood sample. RESULTS: There were no somatic mutations in the p27 gene and also in the p15 and p18 genes. However, we verified a low p27 protein expression in MTC/MEN2 and PHEO/MEN2 that showed a definite correlation with the type and aggressiveness of the mutated RET codon, mainly in those tumors from cases with germline RET codon 634 mutations (control vs 634, p=0,05; control vs 634/791, p= 0,032; 620 vs 634, p=0,045; 620 vs 634/791, p= 0,002; 620 vs 634 + 634/791, p=0,036). It was also verified a positive correlation between the immunohistochemistry expression of nuclear p27 subcellular location and the p27 p.V109G TT genotype (p=0,03). CONCLUSIONS: The reduction in the expression of p27 and its subcellular localization are likely to be associated with somatic changes in other genes that control the processes of phosphorylation of p27 protein through post-transductional events

Introdução: Existem dados suficientes disponíveis demonstrando a importância da quimiocina CXCL12 e seu receptor CXCR4 na progressão tumoral e angiogênese dos gliomas. O CXCR4 é regulado positivamente pelo HIF1alfa. Recentemente um novo receptor com maior afinidade à CXCL12 foi identificado, o receptor órfão RDC1, agora denominado CXCR7. O objetivo deste estudo é investigar a expressão de mRNA CXCR7 em tecidos astrocitomas difusos e avaliar suas interações com expressão CXCR4 e HIF1alfa, bem como analisar sua relação com mutação do IDH1. Métodos: A expressão do CXCR7, CXCR4, IDH1 e HIF1alfa foram avaliadas por PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR) em 129 amostras congeladas de astrocitomas (25 astrocitoma difuso - AGII, 18 de astrocitoma anaplásico - AGIII e 86 glioblastoma - GBM) e 22 amostras de tecido cerebral não neoplásico (NN) obtidos de cirurgia de epilepsia. A mutação do IDH1 previamente determinada foi analisada em relação aos níveis de expressões de mRNA do CXCR7, CXCR4 e HIF1alfa, combinado com os parâmetros clínico-patológicos e sobrevida global. Adicionalmente, a expressão proteica do CXCR7 foi analisada por imuno-histoquímica em astrocitomas de diferentes graus e em linhagem celular de glioma (U87MG) por microscopia confocal. Resultados: Houve diferença significativa nos níveis de expressão dos genes estudados entre astrocitomas e NN (p < 0,001). Na análise da expressão gênica associada nos AGII não se observou correlação entre os níveis de expressão de CXCR7/HIF1alfa (p = 0,548); observou-se correlação significativa entre CXCR7/IDH1 (p < 0,001) e CXCR7/CXCR4 (p = 0,042). Nos GBM houve correlação significativa entre CXCR7/CXCR4 (p = 0,002), CXCR7/IDH1 (p < 0,001) e CXCR7/HIF1alfa (p = 0,008). Hiperexpressão do HIF1alfa foi associado com maior expressão do CXCR7 e CXCR4 (p = 0,001), enquanto a presença de IDH1 mutado foi associada a menor expressão de mRNA do CXCR7 e CXCR4 (p = 0,009). A expressão proteica de CXCR7 foi identificada em todas as amostras estudadas, e aumentou com malignidade. A proteína CXCR7, na linha celular U87MG, foi localizada principalmente na membrana celular. Conclusão: O CXCR7 é um gene diferencialmente expresso em astrocitomas difusamente infiltrativos em relação tecido cerebral não neoplásico. O nível de expressão do CXCR7 correlacionou-se significativamente com os níveis de expressão do CXCR4 e IDH1 nos AGII e com CXCR4, IDH1 e HIF-1alfa nos GBM. O nível de expressão elevado do CXCR7 e CXCR4 correlacionou-se com nível elevado de expressão de HIF-1a, enquanto a presença da mutação do IDH1 associou-se a níveis reduzidos de CXCR7 e CXCR4. Não se observou associação significativa entre os níveis de expressão de CXCR7 e CXCR4 com os dados de sobrevida / Introduction: There is abundant evidence showing that chemokine CXCL12 and its receptor CXCR4 are involved in glioma progression and angiogenesis. CXCR4 is upregulated by HIF1alfa. The CXCR7, a recent additional receptor for CXCL12 with higher affinity than CXCR4 has raised key issues on glioma cell migration. The aim of this study is to investigate the CXCR7 mRNA expression in diffuse astrocytoma tissues and to evaluate its interactions with CXCR4 and HIF1alfa expression and IDH1 mutation. Methods: CXCR7, CXCR4, IDH1 and HIF1alfa expressions were evaluated by quantitative real-time PCR (qRT-PCR) in 129 frozen samples of astrocytoma (25 diffuse astrocytomas - AGII, 18 anaplastic astrocytomas - AGIII and 86 glioblastomas - GBM) and 22 samples of non-neoplastic tissue cerebral (NN) from epilepsy surgery. IDH1 mutation status was analyzed with CXCR7, CXCR4 e HIF1alfa mRNA expressions, matched with clinicopathological parameters and overall survival time. Furthermore, CXCR7 protein expression was analyzed by immunohistochemistry in different grades of astrocytoma and in glioma cell line (U87MG) by confocal microscopy. Results: There was significant difference in the expression levels of the genes studied between astrocytomas and NN (p < 0.001). The analysis of associated gene expressions in AGII showed no significant correlation between CXCR7/HIF1alfa (p = 0.548); there was significant correlation between CXCR7/CXCR4 (p = 0.042) and CXCR7/IDH1 (p = 0.008). In GBM, there were significant correlations between CXCR7/CXCR4 (p = 0.002), CXCR7/IDH1 (p < 0.001) and CXCR7/HIF1alfa (p = 0.008). HIF1alfa overexpression was associated with higher expressions of CXCR7 and CXCR4 (p = 0.001), while presence of IDH1 mutation was associated with lower CXCR7 and CXCR4 mRNA expressions (p = 0.009). Protein expression was identified in all samples studied, and it increased with malignancy. CXCR7 protein, in U87MG cell line, was mainly localized in the cellular membrane. Conclusion: CXCR7 was overexpressed in astrocytoma of different grades of malignancy compared to non-neoplastic brain tissue. CXCR7 expression levels correlates with CXCR4 and IDH1 in AGII and CXCR4, IDH1 and HIF1alfa in GBM. Overexpression HIF1alfa was related with higher expressions of CXCR7 and CXCR4, otherwise presence of IDH1 mutation related with lower expression of both genes. Protein expression level was associated with the degree of malignancy. The results revealed no significant association between CXCR7 and CXCR4 expression and survival data