<p dir="ltr">Metastatic breast cancer (BC) remains a dauting therapeutic challenge due to the heterogeneity and cellular plasticity that exists. Because of these, BC resistance to targeted therapies and immune checkpoint blockade (ICB) present major challenges in the clinical setting. As a result, incomplete clearance of BC during a therapeutic regimen can lead to the persistence of minimal residual disease (MRD) which greatly contributes to tumor relapse. Here we develop a powerful in vivo model of lung metastasis in which we can achieve robust pulmonary tumor regression in response to the fibroblast growth factor receptor (FGFR) inhibitor, pemigatinib.</p><p dir="ltr">To enhance the efficacy of ICB, tumors must first be converted from an immune “cold” environment to an immune “hot” environment. Using our in vivo model of lung metastasis, we demonstrated that pemigatinib can significantly increase the presence of infiltrating T-cells into the lungs while suppressing the presence of MDSCs both locally in the lungs and systemically. Taken together, pemigatinib is an ideal candidate to prime these immune “cold” tumors for combination with ICB.</p><p dir="ltr">Upon establishment of MRD by pemigatinib in our in vivo model we observe upregulation of an alternate growth factor receptor, platelet-derived growth factor receptor (PDGFR). Functionally, upon FGFR inhibition, there is increased response to pulmonary fibroblast derived PDGF ligand, fueling survival of MRD. We demonstrated that knockdown of PDGFR significantly delayed tumor growth reinitiation in an in vitro 3D culture following pemigatinib as well as delayed tumor relapse in our pulmonary metastasis model.</p><p dir="ltr">To limit cellular plasticity and reduce survival of MRD, we propose a novel dual-targeted approach utilizing pemigatinib, in conjunction with inhibition of DNMT1 using the reversible inhibitor GSK3484862. We used our in vivo model of lung metastasis after treatment with pemigatinib as a model of cellular plasticity to targeted therapy. This combination therapy prevented growth factor plasticity and delayed tumor recurrence. Through prevention of PDGFR upregulation induced by pemigatinib.</p><p dir="ltr">In the present dissertation works, our study demonstrates pemigatinib’s robust ability to increase infiltrating T-cells in addition to its strong antitumor effects on pulmonary tumors. Despite the robust effects of pemigatinib, acquired mechanism of resistance through upregulation of PDGFR allows survival of MRD and are supported by PDGF secreting fibroblasts. Using an approach of limiting cellular plasticity through DNA methylation inhibition combined with pemigatinib, we achieved a more durable therapeutic response. Our findings underscore the significance of understanding adaptive responses to targeted therapies and provide a tangible therapeutic strategy to prolong treatment response in metastatic breast cancer.</p>

Candida parapsilosis is an opportunistic fungal pathogen of humans causing a variety of infections. Immunocompromised individuals represent the most threatened group of patients. The increasing frequency of infections and occurrence of drug resistant strains are the main reasons for research focused on novel antimycotic compounds. Inhibition of secreted aspartic proteases (Sap) of pathogenic Candida spp. appears to be a potential target of therapeutic intervention. The genome of C. parapsilosis contains at least three genes coding for secreted aspartic proteases, denominated SAPP1-3. Protease Sapp1p has been well biochemically and structurally characterized, whereas Sapp2p and Sapp3p have been given less attention. The first part of the thesis is focused on structural analysis of Sapp1p complexes with selected peptidomimetic inhibitors binding to the active site of the enzyme. In addition, complex of the isoenzyme Sapp2p with the well-known secreted aspartate inhibitor Pepstatin A has been analyzed. The second part is related to the fact that C. parapsilosis belongs to the Candida spp. with the unique ability to translate standard leucine CUG codon mostly as serine. Even though it is a non-conservative substitution of hydrophobic amino acids for a hydrophilic one, this unique ability is maintained for more...

La diminution de la biodisponibilité de la sérotonine (5-HT) en inhibant sa biosynthèse peut représenter un traitement complémentaire efficace de l'hypertension artérielle pulmonaire (HTAP). Nous avons évalué cette hypothèse en utilisant LP533401, qui inhibe la tryptophane hydroxylase 1 (TPH1), enzyme limitante de la biosynthèse de la sérotonine, exprimée dans l'intestin et les poumons, sans inhiber Tph2 exprimée dans les neurones. Méthodes et résultats - Les souris traitées à plusieurs reprises avec LP533401 (30-250 mg / kg par jour) ont présenté une diminution marquée du contenu en 5-HT dans le tube digestif, dans les poumons et dans le sang, mais pas dans le cerveau. Après une seule dose LP533401 (250 mg / kg), le contenu en 5-HT du poumon et l'intestin a diminué de 50%, tandis que les niveaux 5-HT sanguins sont restés inchangés, suggérant une synthèse de 5-HT dans l'intestin et des poumons. Le traitement par l'inhibiteur du transporteur de la 5-HT (5-HTT), le citalopram, a diminué le contenu en 5-HT dans le sang et les poumons, mais pas dans l'intestin. En transgénique, les souris SM22-5-HTT+, surexprimant 5-HTT dans les cellules musculaires lisses, développent spontanément de l'HTAP. Le traitement par 250 mg / kg par jour de LP533401 ou 10 mg / kg de citalopram par jour pendant 21 jours diminue nettement les taux de 5-HT dans les poumons et dans le sang, ainsi que la pression systolique du ventricule droit (VD), l'hypertrophie du VD, la muscularisation distale de l'artère pulmonaire et les cellules Ki67-positives (P< 0,001). Le traitement combiné avec les deux médicaments était plus efficace dans l'amélioration des paramètres hémodynamiques que chacun des médicaments seuls. Un traitement par LP533401 ou par citalopram empêche partiellement le développement de l'HTAP chez les souris de type sauvage exposées à l'hypoxie chronique. Le niveau de 5-HT dans les poumons et dans le sang était plus faible dans les souris hypoxiques que dans souris normoxiques et est encore diminué après traitement par LP533401 ou par citalopram. / Decreasing the bioavailability of serotonin (5-HT) by inhibiting its biosynthesis may represent a useful adjunctive treatment of pulmonary hypertension (PH). We assessed this hypothesis using LP533401, which inhibits the rate-limiting enzyme tryptophan hydroxylase 1 (Tph1) expressed in the gut and lung, without inhibiting Tph2 expressed in neurons. Mice treated repeatedly with LP533401 (30–250 mg/kg per day) exhibited marked 5-HT content reductions in the gut, lungs, and blood, but not in the brain. After a single LP533401 dose (250 mg/kg), lung and gut 5-HT contents decreased by 50%, whereas blood 5-HT levels remained unchanged, suggesting gut and lung 5-HT synthesis. Treatment with the 5-HT transporter (5-HTT) inhibitor citalopram decreased 5-HT contents in the blood and lungs but not in the gut. In transgenic SM22-5-HTT+ mice, which overexpress 5-HTT in smooth muscle cells and spontaneously develop PH, 250 mg/kg per day LP533401 or 10 mg/kg per day citalopram for 21 days markedly reduced lung and blood 5-HT levels, right ventricular (RV) systolic pressure, RV hypertrophy, distal pulmonary artery muscularization, and vascular Ki67-positive cells. Combined treatment with both drugs was more effective in improving PH-related hemodynamic parameters than either drug alone. LP533401 or citalopram treatment partially prevented PH development in wild-type mice exposed to chronic hypoxia. Lung and blood 5-HT levels were lower in hypoxic than in normoxic mice and decreased further after LP533401 or citalopram treatment. These results provide proof of concept that inhibiting Tph1 may represent a new therapeutic strategy for human PH.

Foram estudadas 20 pacientes na menacme portadoras de leiomioma uterino, sintomáticas, que utilizaram anastrozol na dose 1 mg/dia por três meses consecutivos. Durante o tratamento acompanhou-se o volume do conjunto úteroleiomiomas com ultra-sonografia, no momento inicial e após um mês e três meses do início do uso da medicação. Além disso, foi observada a evolução da sintomatologia relacionada ao leiomioma (hipermenorréia, dismenorréia e metrorragia), presença de sintomas ligados ao hipoestrogenismo e dosagens séricas de FSH, estradiol, colesterol total e frações, triglicérides e glicose. Obtivemos redução média do volume do conjunto útero-leiomiomas de 9,32% até 31%. Houve diminuição significante dos sintomas relacionados ao leiomioma do útero. Não ocorreram sintomas ligados ao hipoestrogenismo. Não se comprovou modificação significante dos demais parâmetros estudados. Concluiu-se que o inibidor da aromatase, o anastrozol, na dosagem utilizada, foi efetivo na redução volumétrica do conjunto útero-leiomiomas, além de proporcionar significativa melhora dos sintomas relacionados a essa doença, sem alterar, no entanto, os valores de FSH, estradiol, colesterol total e frações, triglicérides e glicose. / We studied 20 patients in menacme with leiomyoma in the uterus, referring symptoms, using anastrozol 1 mg per day for three months. During this treatment we monitored the uterus-leiomyoma volume using ultrasound, at the beginning, one month after and three months after the beginning of the use of the medication. We also observed the leiomyoma symptoms evolution, presence of usual symptoms of hipoestrogenism and seric values of FSH, estradiol, cholesterol and its fractions triglycerides and glicemia. We obtained reduction in uterus-leiomyoma volume of 9.32% in average, in maximum 31%. There was significative reduction in symptoms related with leiomyoma. There were not symptoms of hipoestrogenism. We not observed significative modifications in the other studied parameters. This study concluded that the aromatase inhibitor, anastrozol, in this dosage, is effective in uterus-leiomyomas reduction, cause significative reduction of the symptoms related with this illness, without change the seric dosage of FSH, estradiol, total cholesterol and fractions, triglycerides and glicemia.

Die Wanderung von Leukozyten aus dem Gefäßlumen läuft in einer Kaskade ab, die durch verschiedene Adhäsionsmoleküle vermittelt wird. Dabei wird der erste Kontakt der Leukozyten mit dem Endothel durch die Interaktion von L­Selektin mit seinen endothelialen Sialomucinliganden eingeleitet. Neben seiner Adhäsionsfunktion kann L­Selektin intrazelluläre Signalwege aktivieren und wird, induziert durch intrazelluläre Signale, an seinen cytoplasmatischen Serinresten durch Proteinkinase C (PKC) phosphoryliert. Über die Regulation dieser Serinphosphorylierung von L-Selektin ist nur wenig bekannt. Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der cytoplasmatischen Interaktion von L-Selektin mit dem Proteinphosphatase 2A-Inhibitor PhapII und die Identifizierung noch unbekannter Interaktionspartner der cytoplasmatischen Domäne von L­Selektin. Es konnte gezeigt werden, dass das basische Duplett Lys-365/Arg-366 der cytoplasmatischen Domäne von L-Selektin essentiell für die Bindung von PhapII ist, die über den sauren C­Terminus von PhapII vermittelt wird. In einem Malachitgrün-basierten Phosphataseassay konnte gezeigt werden, dass die cytoplasmatischen Serinreste von L­Selektin durch Protein Phosphatase 2A (PP2A) dephosphoryliert werden. Ferner konnte in Jurkat-Zelllysaten PP2A als ein direkter Interaktionspartner von nicht phosphoryliertem LScyto identifiziert werden. Die Dephosphorylierung von LScyto konnte durch PhapII verhindert werden, was auf eine Regulation der Serinphosphorylierung durch PKC, PP2A und PhapII hindeutet. Mit dem Ziel, die Interaktion von PhapII mit L-Selektin durch Co-Kristallisation zu untersuchen, wurde PhapII rekombinant exprimiert und gereinigt. Mittels chromatographischer Verfahren konnte PhapII als ein Protein mit intrinsischer Unordnung in seiner Sekundärstruktur beschrieben werden. Die Deletion des sauren C-Terminus bzw. die Mutation an Serin-9 von PhapII zeigten einen Einfluss auf die Konformation von PhapII zu einer kompakteren Proteinstruktur hin. / Migration of leukocytes from the lumen occurs in a cascade mediated by different members of adhesion molecules. The first contact of leukocytes to endothelium is initiated by the interaction of L­selectin to its endothelial sialomucin ligands. Besides its role in cell adhesion, L­selectin can induce a set of intracellular signaling pathways and can be a target of serine phosphorylation by protein kinase C (PKC) induced by intracellular signals. But little information on regulation of this serine phosphorylation of L-selectin and therefore regulation of intracellular protein interactions is known. The aim of this thesis was to analyze the cytoplasmic interaction of L-selectin with the inhibitor of protein phosphatise 2A PhapII and searching for other unknown interaction partners of the cytoplasmic domain of L-selectin. Results show that the basic doublet Lys-365/Arg-366 of the cytoplasmic domain of L­selectin (Lscyto) is essential for binding to PhapII which is mediated by the acidic C­terminal tail of PhapII. Using malachite green based assay to detect free phosphate, cytoplasmic serine residues of L­selectin were dephosphorylated by protein phosphatase 2A (PP2A). In addition, it was possible to identify PP2A as a direct interaction partner of the non-phosphorylated domain of L­selectin in Jurkat T cell lysates. The dephosphorylation of Lscyto was prevented by PhapII and points the regulation of serine phosphorylation by PKC, PP2A and PhapII. For analysis of the interaction of PhapII with L-selectin by co-crystallography, PhapII was recombinantly expressed and purified. Using chromatographic techniques PhapII was observed to be a protein with an intrinsic disorder in its secondary structure. Deletion of the acidic C-terminus and in particular mutation of Serine-9 showed an effect on the conformation of PhapII to a globular and compact protein structure.

Das 26S Proteasom ist ein großer Proteinase-Komplex, der aus 32 unterschiedlichen Untereinheiten aufgebaut ist. Das 26S Proteasom ist involviert in die ATP-abhängige De-gradation von ubiquitinierten Proteinen, die eine Vielfalt an zellulären Prozessen wie Signaltransduktion, Stressantwort, transkriptionelle Regulation, Chromosomen-Segregation, DNA-Reparatur, Zellzyklus-Steuerung und die Prozessierung von Peptiden für die MHC I Antigen Präsentation regulieren. Die Prozessierung von Peptiden wird ver-stärkt durch eine Interferon ? stimulierbare Variante des Proteasoms übernommen, dem so genannten Immunoproteasom. Die Biogenese dieses großen Komplexes ist ein komplizierter Mechanismus, welcher Expression und Assemblierung der proteasomalen Untereinheiten beinhaltet. In Eukaryonten sind für die Assemblierung und Maturierungsprozesse Helferproteine notwendig. In Mammalia übernimmt diese Funktion das Proteasom maturation Protein POMP. POMP ist wahrscheinlich auch bei der Biogenese des Immunoproteasoms von Bedeutung, da die mRNA von POMP durch Interferon ? induziert wird. Um die Regulation dieser Induktion zu untersuchen wurde der Promotor von POMP für die erste Fragestel-lung dieser Arbeit charakterisiert und seine Induzierbarkeit durch Interferon ? untersucht. Es konnte nachgewiesen werden, dass die erhöhte mRNA-Menge durch Interferon ?-Stimulation nicht auf eine Promotor-Induktion, sondern auf post-transkriptionelle Ereig-nisse zurückzuführen ist. In der zweiten Fragestellung dieser Arbeit sollte die Genregulation des Proteasoms unter Stressbedingungen untersucht werden. Der Stress wurde durch Inhibition der proteolyti-schen Aktivität des Proteasoms ausgelöst. Wie seit längerem bekannt ist, werden in Bakterien und Hefe die ATP-abhängigen Pro-teasekomplexe über ein kompliziertes regulatorisches Netzwerk gesteuert. Über die transkriptionelle Regulation des Mammalia Proteasoms war bisher wenig bekannt. Im Rahmen der hier vorliegenden Dissertation konnte gezeigt werden, dass die Reduktion der proteolytischen Aktivität des Proteasoms durch Behandlung von Mammalia-Zellen mit Proteasom-Inhibitoren durch eine gesteigerte Genexpression der proteasomalen Unter-einheiten kompensiert wird. Alle proteasomalen Untereinheiten werden konzertiert hoch-reguliert. Exemplarisch an der proteasomalen Untereinheit Rpt1(S7) und an dem Matu-rierungsfaktor POMP konnte eine posttranskriptionelle Regulation unter Proteasom-Inhibitor Einfluss ausgeschlossen werden. Die vom Inhibitor induzierte Genaktivierung resultiert in einer de novo Protein-Synthese und führt daher zu einer gesteigerten de no-vo Biogenese des Proteasoms. Dieses Phänomen ist begleitet durch eine vermehrte Ex-pression vom POMP. Damit konnte erstmals gezeigt werden, dass die Menge an Protea-som in Mammalia auf transkriptioneller Ebene reguliert wird und dass vermutlich ein au-toregulatorischer feedback-Mechanismus eine verminderte proteolytische Aktivität kom-pensieren kann. Diese Daten werden durch Ergebnisse der CAT-Reportergen-Assays des ?1(?)-Promotors gestützt. Exemplarisch konnte gezeigt werden, dass die Aktivität dieses Promotors in Anwesenheit von Proteasom-Inhibitoren ansteigt. Die induzierbare Promotorregion konnte bis auf 130 bp eingegrenzt werden. Innerhalb dieser Promotorse-quenz konnte die Bindung eines Transkriptionsfaktors (Nrf2) durch EMSA-Technik nach-gewiesen werden. / The 26 S proteasome is a high molecular mass proteinase complex that is built by of least 32 different protein subunits. The 26S proteasome is involved in the ATP-dependent degradation of ubiquitinated proteins that regulate a variety of cellular proc-esses including signal transduction, stress response, transcriptional control, chromosome segregation, DNA repair, cell cycle progression and processing of antigenic Peptides for the MHC I pathway. Biogenesis of this large complex is a complicated process compris-ing expression, assembly and maturation of all subunits. This crucial step is supported by POMP (proteasome maturation protein). POMP mRNA is induced by Interferon gamma (IFN ?). We investigated this phenomenon via Reportergen assays with the Promoter re-gion of POMP. POMP mRNA seems not to be regulated on a trancriptional level, but on posttranscriptional events. ATP-dependent protease complexes in bacteria and yeast are systems that undergo a highly sophisticated network of gene expression regulation. However, regulation of mammalian proteasome gene expression has been neglected so far as a possible control mechanism for the amount of proteasomes in the cell. We showed that treatment of cells with proteasome inhibitors and the concomitant impairment of proteasomal enzyme activ-ity induce a transient and concerted up-regulation of all mammalian 26S proteasome subunit mRNAs. Proteasome inhibition in combination with inhibition of transcription re-vealed that the observed up-regulation is mediated by coordinated transcriptional activa-tion of the proteasome genes and not by post-transcriptional events. Our experiments also demonstrate that inhibitor-induced proteasome gene activation results in enhanced de novo protein synthesis of all subunits and in increased de novo formation of the pro-teasome. This phenomenon is accompanied by enhanced expression of the proteasome maturation factor POMP. Thus, our experiments present first evidence that the amount of proteasomes in mammalia is regulated at the transcriptional level and that an auto regu-latory feedback mechanism exists that allows the compensation of reduced proteasome activity. These data are also supported by CAT reportergene assays with the protea-somal subunit ?1(?)-promoter. Exemplary we show the increase of CAT activities in re-sponse to proteasome inhibition. We can restrict the region of the promoter to 130 bp and identify Nrf2 as a possible candidate for a transcription factor via EMSA.

Die Cathepsine B, H und L sind lysosomale Enzyme, die zur Gruppe der Cysteinproteasen gehören. Erhöhte Aktivitäten dieser Proteasen fand man in Gewebeproben verschiedener Tumore, vermutlich Hinweis auf eine Beteiligung an Invasion und Metastasierung. Unter physiologischen Bedingungen werden die Cathepsine von endogenen Inhibitoren kontrolliert, eine Verminderung dieser Cysteinprotease-Inhibitoren (CPI) würde die proteolytische Dysbalance verstärken und zur Ausbreitung des malignen Prozesses beitragen. Für das Prostatakarzinom gab es bisher keine Untersuchungen. Die Aktivität der Cathepsine wurde mit Hilfe spezifischer Substrate bestimmt, die zur Bildung fluorogener Produkte führten. Zur Bestimmung der inhibitorischen Aktivität der CPI wurden die Proben nach einer Hitzeaktivierung gegen reines Cathepsin B getestet. Untersucht wurden Gewebeproben verschiedener Patientengruppen, Primärzellkulturen, die aus normalem und maligne veränderten Prostatagewebe angezüchtet wurden und vergleichend dazu die drei immortalisierten Zellinien LNCaP, PC3 und DU145. Die Ergebnisse der Gewebeproben zeigten höhere Aktivitäten der Cathepsine B und L im nichterkrankten Gewebe, nicht wie erwartet im Tumorgewebe der Prostata. Hingegen waren bei den Primärzellkulturen alle drei Cathepsine und der Quotient Cathepsine/CPI in den Tumorproben erhöht. Die immortalisierten Zellinien zeigten die gleiche Verteilung bei allen Cathepsinen, DU145 mit der höchsten Aktivität, gefolgt von LNCaP und PC3. Anhand der Ergebnisse schlußfolgern wir, daß die Untersuchung von Gewebe-proben der Prostata hinsichtlich der Beteiligung der Cathepsine am Tumor-geschehen keine eindeutigen Erkenntnisse erbringt. Dies ist vermutlich auf die Heterogenität des Gewebes zurückzuführen, das nicht nur epitheliale, sondern auch stromale Zellen enthält. Die aus dem Gewebe angezüchteten Primär-zellkulturen scheinen ein genaueres Bild des Verhältnisses von Cathepsinen und den Inhibitoren zu geben und sind unserer Meinung nach den Bestimmungen in Gewebeproben vorzuziehen. / The cathepsins B, H and L (CB, CH, CL) are lysosomal proteolytic enzymes belonging to the cysteine protease family. Elevated cathepsin levels and decreased concentration of their endogenous inhibitors have been demonstrated in a variety of tumors, suggesting a contribution to invasion and metastasis. The situation for prostate cancer was so far unknown. Using fluorimetric assays, catalytic activities of the cathepsins B, H, L were measured in prostatic tissue samples obtained from different groups of patients, in primary cell cultures established from human prostate and in the immortalized cell lines LNCaP, PC3 and DU145. Inhibitory activities of cysteine protease inhibitors (CPI) were tested against purified cathepsin B. Comparing matched pairs of normal and cancerous tissue samples from the prostate, significantly decreased levels of CB and CL were found in malignant samples. In contrast, primary cell cultures from malignant tissue showed elevated levels of all three cathepsins and increased ratios of cathepsins to CPI when compared to cell cultures from non-malignant prostate. The permanent cell lines showed a similiar distribution of cathepsin levels, DU145 with the highest activity, followed by LNCaP and PC3. These results suggest that elevated cathepsin activities and increased ratios of cathepsins to CPI in malignant cell cultures compared to non-malignant samples may be an indication for a cellular proteolytic imbalance in prostatic cancer cells. Regarding different results, determinations in primary cell cultures should be preferred to tissue samples.

Die aberrante Aktivierung des NOTCH Signalweges trägt entscheidend zu verschiedensten malignen Erkrankungen im Menschen bei. Basierend auf der Analyse von hochdimensionalen Microarray-Datensätzen von klassischen Hodgkin Lymphoma Fällen und nicht-Hodgkin Fällen, haben wir eine Hodgkin Lymphoma-spezifische NOTCH Signatur identifiziert. Diese wird von dem essentiellen NOTCH-Koaktivator Mastermindlike 2 (MAML2) signifikant dominiert. Auf der Grundlage dieses Resultates haben wir die Rolle von MAML2 im Kontext des Hodgkin Lymphoma-spezifischen, aberrant regulierten NOTCH Signalweges weiter untersucht. Die signifikante Überexpression von MAML2 im Hodgkin Lymphom konnte in verschiedenen Hodgkin Lymphom Zelllinien und auch durch die immunhistochemische Analyse von primären Hodgkin Lymphom Fällen verifiziert werden. Mit Hilfe des Knockdowns von MAML2 bzw. der Inhibition des NOTCH Signalweges durch die Verwendung einer kompetitiv, dominant-negativ wirkenden, trunkierten Variante von MAML1 konnte daraufhin gezeigt werden, dass die Überexpression von MAML2 der limitierende Faktor für die Hodgkin Lymphomaspezifische, pathologische Deregulation des NOTCH Signalweges ist. Die MAML2- vermittelte Überaktivierung des NOTCH Signalweges ist darüber hinaus essentiell für die Proliferation von Hodgkin Lymphom Zelllinien und die aberrante Expression der NOTCH Zielgene HES7 und HEY1. Das konstitutive Vorhandensein von aktiviertem, intrazellulären NOTCH1 in Hodgkin Lymphom Zelllinien impliziert darüber hinaus,dass der Signalweg im Hodgkin Lymphom zellautonom aktiviert ist. In dieser Arbeit wird damit ein neuer, pathologisch hochwirksamer Mechanismus der NOTCH Signalweg-Deregulation aufgedeckt. / Inappropriate activation of the NOTCH signaling pathway, e.g. by activating mutations, contributes to the pathogenesis of various human malignancies. Using a bottom up approach based on the acquisition of high–dimensional microarray data of classical Hodgkin lymphoma (cHL) and non-Hodgkin B cell lymphomas as control, we identify a cHL specific NOTCH gene-expression signature dominated by the NOTCH co-activator Mastermind-like 2 (MAML2). This set the basis for demonstrating that aberrant expression of the essential NOTCH co-activator MAML2 provides an alternative mechanism to activate NOTCH signaling in human lymphoma cells. Using immunohistochemistry we detected high-level MAML2 expression in several B cell-derived lymphoma types, including cHL cells, whereas in normal B cells no staining for MAML2 was detectable. Inhibition of MAML protein activity by a dominant negative form of MAML or by shRNAs targeting MAML2 in cHL cells resulted in down-regulation of the NOTCH target genes HES7 and HEY1, which we identified as overexpressed in cHL cells, and in reduced proliferation. In order to target the NOTCH transcriptional complex directly we developed short peptide constructs that competitively inhibit NOTCH dependent transcriptional activity as demonstrated by NOTCH reporter assays and EMSA analyses. We conclude that NOTCH signaling is aberrantly activated in a cell autonomous manner in cHL. This is mediated by high-level expression of the essential NOTCH coactivator MAML2, a protein that is only weakly expressed in B cells from healthy donors. Using short peptide constructs we moreover show, that this approach is promising in regard to the development of NOTCH pathway inhibitors that will also work in NOTCH associated malignancies that are resistant to -secretase inhibition.

Não consta resumo na publicação. / An &#945;-amylase inhibitor purified from black beans (Phaseolus vulgaris L.) prevents the utilization of starch either in normal or diabetic rats during short-time starch loading tests. It causes hypoglycaemia and alters accordingly the serum insulin and non esterified fatty acids levels. These effects are dose dependent and doses higher than 31 mg of the inhibitor can promote the complete smoothing on serum glucose level. The existence of starch in the presence of the inhibitor in the intestine doesn\'t alter the secretion or production of &#945;-amylase by the pancreas.

L’émergence et le développement des maladies métaboliques est sous le contrôle de multiples facteurs génétiques et environnementaux. Le diabète et la résistance à l’insuline sont des maladies métaboliques caractérisées par des défauts dans la sécrétion de l’insuline ou son utilisation périphérique, ou les deux. L’insuline est l’hormone clé de l’utilisation du glucose, et régule également transcriptionnellement et épigénétiquement l’expression des gènes.En travaillant sur le muscle, l’implication de l’épigénétique dans la régulation de l’expression des gènes de la voie de l’insuline a été mis en évidence. L’hexokinase 2 (HK2) est régulée par l’insuline et participe au métabolisme glucidique. Le rôle de l’épigénétique y est démontré avec l’augmentation de l’acétylation des histones autour du site d’initiation de la transcription (SIT) de HK2 et l’accumulation d’une isoforme permissive des histones, H2A.Z. Ces deux phénomènes sont le signe d’une transcription permissive.Nous avons ensuite étudié le rôle de l’acétylation des histones dans les régulations amenées par l’insuline dans les myotubes L6. Nous avons utilisé le butyrate, un inhibiteur des histones deacetylase (HDACi), dans un contexte d’insulino-résistance induite par une lipotoxicité. Le butyrate a en partie restauré la sensibilité à l’insuline visible au niveau des phosphorylations de la PKB (protein kinase B) et de la MAPK (Mitogen-activated protein kinase), inhibées par le traitement au palmitate. Le butyrate a augmenté l’expression de l’ARNm et de la protéine d’IRS1. La surexpression génique d’IRS1 est épigénétique-dépendante car liée à une augmentation de l’acétylation des histones au SIT d’IRS1.L’ensemble de ces résultats démontre l’existence d’un lien entre les modifications épigénétique et l’action de l’insuline. Cela suggère qu’une intervention pharmacologique sur la machinerie épigénétique pourrait être un moyen d’améliorer le métabolisme, et l’insulino-résistance / Diabetes and insulin resistance are metabolic diseases characterized by altered glucose homeostasis due to defects in insulin secretion, insulin action in peripheral organs, or both. Insulin is the key hormone for glucose utilization and regulates gene expression via transcriptional and epigenetic regulations.We determined the epigenetic implications in the regulation of expression of insulin signaling pathway genes. Hexokinase 2 (HK2) is known to be upregulated by insulin and directs glucose into the glycolytic pathway. In L6 myotubes, we demonstrated that insulin-induced HK2 gene expression rely on epigenetic changes on the HK2 gene, including an increase in histone acetylation around the transcriptional start site (TSS) of the gene and an increase in the incorporation of the histone H2A.Z isoform – a histone variant of transcriptionally active chromatin. Both are epigenetic modifications compatible with increased gene expression.To elucidate the role of histone acetylation in the regulation of insulin signaling and insulin-dependent transcriptional responses in L6 myotubes, we investigated the effects of butyrate, an histone deacetylase inhibitor (HDACi), in a model of insulin resistance induced by lipotoxicity. Butyrate partly alleviated palmitate-induced insulin resistance by ameliorating insulin-induced PKB (protein kinase B) and MAPK (Mitogen-activated protein kinase) phosphorylations, downregulated with exposure to palmitate. Butyrate induced an upregulation of IRS1 gene and protein expression. The transcriptional upregulation of IRS1 was proven to be epigenetically regulated, with butyrate promoting increased histone acetylation around the TSS of the IRS1 gene.These results support the idea of the existence of a link between epigenetic modifications and insulin action. Pharmacological targeting of the epigenetic machinery might be a new approach to improve metabolism, especially in the insulin resistant condition.Key words: Muscle, insulin resistance, epigenetic, chromatin, histone acetylation, histone deacetylase inhibitor (HDACi), butyrate, palmitate