Les dérivés lipidiques et solubles des inositol phosphates sont largement impliqués dans la signalisation des cellules normales et des cellules cancéreuses. L’étude de ceux-ci est un domaine en pleine expansion et le représentant le plus connu de ces inositol phosphates est l’inositol 1,4,5-trisphosphate (Ins(1,4,5)P3), responsable de la mobilisation calcique mais également point de départ du cycle des inositol phosphates hautement phosphorylés. Au cours de cette thèse, nous avons étudié le rôle des quatre enzymes capables de phosphoryler l’Ins(1,4,5)P3 :les 3 isoenzymes de l’inositol 1,4,5-trisphosphate 3-kinase (Itpk) l’Itpka, l’Itpkb et l’Itpkc clonées dans notre laboratoire, ainsi que l’inositol polyphosphate multikinase (IPMK), dans deux modèles cellulaires :les cellules souches embryonnaires murines (ESCm) ainsi que dans un modèle d’extension des neurites, les cellules PC12 stimulées au NGF.Dans le projet visant à étudier la fonction de ces quatre kinases dans les ESCm, nous avons fait ressortir deux points importants. Premièrement, grâce à l’étude des ESCm IPMK-/-, nous avons mis en évidence le rôle de l’IPMK dans la différenciation des ESCm d’une part en progéniteurs neuronaux et d’autre part en corps embryoïdes. Ces deux types de différenciation montrant une neurogenèse affectée dans les ESCm IPMK-/-. Deuxièmement, nous avons observé une augmentation d’expression de l’Itpkb dans les ESCm différenciées en corps embryoïdes comparé aux ESCm non différenciées.Dans le projet comparant la fonction des quatre kinases au cours de la différenciation des cellules PC12 en neurones sympathiques, nous avons montré que la surexpression de l’Itpka et de l’Itpkb inhibait l’élongation des neurites observées après stimulation des cellules au NGF. Cet effet inhibiteur sur l’élongation des neurites semble être expliqué par une modification de la réorganisation du cytosquelette d’actine induite par le NGF après surexpression de l’Itpka et de l’Itpkb. En conclusion, nous avons démontré que, bien qu’ayant le même substrat et permettant toutes la production d’inositol hautement phosphorylés, ces quatre enzymes pouvaient être différenciées par des fonctions spécifiques qu’elles exercent au sein de la cellule. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

L’étude des inositols hautement phosphorylés est un domaine en pleine expansion. Leurs essors ne datent que d’une dizaine d’années, mais de nombreuses fonctions y sont déjà associées bien qu’ils en restent sans doute encore à découvrir. Les inositols phosphates (incluant les inositols hautement phosphorylés) s’inscrivent dans un cycle dont le représentant le plus connu est inositol 1,4,5-trisphosphate (Ins(1,4,5)P3). De ce fait, chaque inositol phosphate influence directement ou indirectement les autres membres de ce cycle.<p>Au cours de la thèse, nous avons pu éclaircir une controverse de la littérature sur la voie de synthèse des inositols hautement phosphorylés. Grâce à un modèle de cellules MEF (mouse embryonic fibroblast) n’exprimant aucune des trois isoformes de l’inositol 1,4,5-trisphosphate 3-kinase (ITPK) et à l’aide des cellules souches déficientes pour l’inositol polyphosphate multikinase (IPMK), nous avons pu révéler le rôle majeur de cette dernière dans la génération de l’InsP5 et l’InsP6.<p>Dans un second temps, nous avons comparé la neurogenèse de ces cellules souches IPMK+/+ et IPMK-/- mises dans un milieu de différenciation par défaut (DDM). Les cellules dépourvues de l’IPMK entrent en apoptose et se différencient très difficilement en progéniteurs neuronaux et en neurones. Afin de comprendre le mécanisme sous-jacent pouvant expliquer ce phénomène, nous avons réalisé des PCRs quantitatives qui ont montré une sous expression des gènes du neuroectoderme ainsi qu’une augmentation de l’expression de gènes du mésoderme dans les cellules IPMK-/- par rapport aux cellules IPMK+/+. De plus, nous avons découvert que le phénomène d’apoptose observé au cours de la différenciation en DDM était spécifique à ce milieu. En effet, nous n’avons pas pu mettre en évidence un tel phénomène au cours de la différenciation en corps embryoïdes.<p>Durant la thèse, nous avons également développé des anticorps dirigés contre l’isoforme B de l’inositol 1,4,5-trisphosphate 3-kinase et contre la forme native de l’IPMK. Ceci nous a permis de mener à bien nos expériences et d’ouvrir de futures perspectives de recherche.<p>En conclusion, nous avons démontré le rôle majeur de l’IPMK dans la voie de synthèse des inositols hautement phosphorylés. Nous avons également découvert que l’IPMK est très importante pour la survie de ces cellules souches en cours de différenciation et nous avons également introduit une nouvelle fonction pour l’IPMK dans la neurogenèse.<p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

It has been six decades since the discovery of lithium for the treatment of bipolar disorder. There is, as yet, no conclusive evidence as to how lithium produces this therapeutic effect, since it is known to interact with multiple cellular targets. One of the most credible targets is the enzyme, inositol monophosphatase (lMPase), which plays a crucial role in cell signalling. My aim was to find a novel IMPase inhibitor and evaluate it as a possible lithium-like mood stabiliser by using enzyme, cell and whole animal experiments. To achieve this, I created recombinant human and mouse IMPase enzymes and then used these for screening and crystallisation. I used two different approaches for the small-molecule screening: substrate-based virtual screening and drug repositioning using a library of compounds with clinically proven safety. I identified ebselen as a novel IMPase inhibitor suitable for drug repositioning. I determined thatebselen inhibited IMPase noncompetitively, likely through a covalent modification on a cysteine. In cell cultures, ebselen was found to inhibit not just IMPase but other steps that resulted in accumulation of higher inositol phosphates. When injected intraperitoneally into mice, ebselen crossed the blood- brain barrier and exhibited inhibition of IMPase ex vivo. Moreover, in mice, ebselen simulates some, but not all, of the behavioural effects of lithium. I have determined that ebselen inhibits IMPase and acts as a partial lithium mimetic. Given that ebselen is safe in man, it warrants clinical testing for the treatment of bipolar disorder.

Abstract not available

The studies described in this thesis have used principally the rat neonatal cardiomyocyte (NCM) model to investigate previously unresolved questions regarding inositol phosphate signalling in the heart. Inositol 1,4,5-trisphosphate (Ins(1,4,5)P3) is known to be an arrhythmogenic molecule in the setting of cardiacischaemia and subsequent reperfusion, but the mechanisms responsible for its enhanced generation in pathological circumstances, as well as those suppressing its generation during phospholipase C (PLC)-coupled receptor stimulation under physiological conditions, have not been characterised. [3H]Inositol-labelling in combination with anion-exchange high performance liquid chromatography (HPLC)was used to gain an accurate picture of the changes in various [3H]InsP isomers induced by PLC stimulation.

Thesis (Ph.D.)--Tufts University, 2000. / Adviser: Marc d'Alarcao. Submitted to the Dept. of Chemistry. Includes bibliographical references (leaves 262-271). Access restricted to members of the Tufts University community. Also available via the World Wide Web;

Thesis (Ph.D.)--Tufts University, 2004. / Adviser: Marc d'Alarcao. Submitted to the Dept. of Chemistry. Includes bibliographical references (leaves 114-118). Access restricted to members of the Tufts University community. Also available via the World Wide Web;

À l’heure actuelle, il est estimé qu’une personne sur quatre souffrira personnellement d’un trouble de santé mentale au cours de sa vie. Les traitements existants agissent sur les voies de signalisation des monoamines telles que la dopamine et la sérotonine et ce, à différents niveaux. Les voies de signalisation ainsi ciblées détiennent comme point commun leur capacité à moduler la glycogène synthase kinase 3 (GSK3). Cette kinase est aussi bien associée au mode d’action des composés pharmacologiques qu’à l’étiologie même des maladies mentales. Cependant, même si des mécanismes régulateurs de cette kinase et des cibles sont connus, de nombreuses zones de méconnaissance persistent. Parmi les points nécessitant un aprofondissement des connaissances, nous avons ciblés trois pistes d'étude. Dans un premier temps, nous avons voulu investiguer plus en détail la modulation de GSK3 dépendante de la voie des inositols phosphates. Nous avons alors cherché à répondre a deux questions ; Est-ce qu'une modulation directe de GSK3 est observée? Est ce que cette modulation reproduit les paradigmes comportementaux de l'inhibition de GSK3? Cette étude nous a alors permis de mettre en évidence une interaction directe entre GSK3 et l'IP6K1 dans des modèles cellulaires et animaux. De plus, dans le contexte d'animaux IP6K1-KO, la modulation de GSK3 dépendante de la voie des inositols semble reproduire des effets comportementaux associés classiquement à l'inhibition de GSK3, à savoir une diminution de la locomotion et de la sociabilité. Dans une seconde étude, nous avons cherché à entrevoir si une dépendance régionale de l'inhibition de GSK3β était associable avec des modulations de comportements spécifiques. Nous avons donc utilisé un modèle murin FloxGSK3β /CamKIIcre caractérisé comme modèle de délétion totale postnatale de cette isoforme dans le cerveau antérieur (cortex et CA1). L'analyse histologique des cerveaux de ces animaux nous a permis dans un premier de valider le modèle choisi. Par la suite, l'analyse comportementale de ces animaux nous a révélée que la modulation des comportements locomoteurs et pseudo-dépressifs étaient indépendants de l'expression de GSK3β au niveau du cerveau antérieur, par opposition à la modulation des comportements anxieux et sociaux. De plus, la modulation de la résilience dépendante de GSK3β pourraient détenir une composante corticale mais des travaux supplémentaires sont nécessaires avant de confirmer cette hypothèse. Enfin, la troisième étude nous a révélée l'existence d'une nouvelle cible de GSK3β impliquée dans la réponse aux traitements pharmacologiques et la modulation du comportement GSK3β-dépendante. Cette protéine, FXR1P, est montrée comme une cible phosphorylable de GSK3β. Ses niveaux d'expression sont corrélés avec l'activité de cette kinase, que ce soit dans des modèles cellulaires ou murins. De plus, les traitements pharmacologiques modulant GSK3, comme la surexpression directe de FXR1P, reproduisent des paradigmes comportementaux GSK3β-dépendants. De plus, des polymorphismes dans les promoteurs de FXR1P et GSK3β ont montré une association avec la stabilité émotionnelle d'individus humains . Ces données sont autant de faits appuyant le rôle potentiel de cette protéine nouvellement identifiée dans la signalisation de GSK3 modulant le comportement. / Nowadays, it is estimated that one out of four people will suffer from mental illness issues at some point during their life. The existing therapeutic strategies act at different levels on monoaminergic signaling, especially on those pathways engaging dopamine and serotonin. These signaling pathways share the ability to modulate a kinase called Glycogen Synthase Kinase 3, or GSK3. This protein is implicated in the action of therapeutic agents as well as in the aetiology of the disease itself. However, even if some targets and molecular mechanisms regulating GSK3 are characterized, many aspects still remain unclear. Among points necessitating clarification, we have set three research aims. First of all, we have studied more deeply the interaction between the inositol phosphate pathway and GSK3 signaling. Thus, we have posed two main questions; is there a direct modulation of the GSK3 pathway depending on inositol phosphates? And if so, does this modulation reproduce behavioral consequences of GSK3 inhibition? This study allowed us to show a direct interaction between IP6K1 and GSK3 in cellular and animal models. Moreover, using IP6K1-KO animals, we showed that IP6K1-mediated modulation of GSK3 reproduces behavioral outcomes classically associated with GSK3 inhibition: a reduction of locomotion and sociability. In the second study, we have looked if a link between regional GSK3 inhibition and modulation of specific behaviors exists. We employed the FloxGSK3β/CamKIIcre mice model, considered as a total and postnatal deletion of this isoform in the forebrain (cortex and CA1). Histological analysis of brains first allowed us to validate the model. Then, behavioral characterization of this line revealed that, in contrast to anxiety and sociability, locomotion and depressive-like behavior are independent of forebrain GSK3β expression. Furthermore, the implication of cortical GSK3β in the modulation of resilience was not yet fully established and further investigation is warranted. Finally, the third study revealed FXR1P as a new target of GSK3β signaling implicated in behavior and response to pharmacological treatments. Interestingly, FXR1 protein is phosphorylated by GSK3 and its relative expression levels are correlated with GSK3 activity in both cellular and animal models. Moreover, treatments modulating GSK3 and overexpression of FXR1P reproduce behavioral outcomes known as GSK3β-dependant. Finally, polymorphisms in GSK3β and FXR1 promoters are associated with emotional stability in humans. These findings highly suggest the potential role of FXR1P in GSK3 pathways affecting mood and behavior.

The phosphatidylinositol polyphosphates play a fundamental role in intracellular signalling. Of particular importance is phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate [PtdIns(3,4,5)P₃], which acts by recruiting effector proteins to the cell membrane. PtdIns(3,4,5)P₃ interacts with its protein targets through selective binding domains that include the pleckstrin homology (PH) domain. The PH-domain-containing kinase, protein kinase B (PKB/Akt), which interacts with PtdIns(3,4,5)P₃, is upregulated in ~15 human malignancies. Significantly, inhibition of the PtdIns(3,4,5)P₃-PKB interaction has proved viable as a point of therapeutic intervention. There is currently a lack of small molecule probes that selectively interact with a given PH domain. Consequently, it is impossible to dissect the cellular function of PH-domain-containing proteins at a molecular level. To address this problem, we have designed and synthesised a number of derivatives of the PtdIns(3,4,5)P₃ inositol head-group – Ins(1,3,4,5)P₄. Replacement of the 5-position phosphate with a range of phosphate bioisosteres afforded compounds that displayed no binding affinity for the PH-domain of general receptor for phosphoinositides 1 (GRP1). However, it was shown that the 5-position sulfamate analogue displayed selectivity for the PH-domain of PKB. The methylphosphate biosiostere at the 1-position displayed binding for both the GRP1 PH-domain as well as the PKB PH-domain. These results demonstrate that subtle modification of the Ins(1,3,4,5)P₄ structure allows the synthesis of compounds that interact selectively with a given PH domain. We will now use these results for the synthesis of a second generation of compounds with improved PH-domain affinity and selectivity.

SHIP2 (SH2 domain-containing inositol polyphosphate 5-phosphatase type 2) est un enzyme de la famille des inositol polyphosphate 5-phosphatases qui déphosphoryle le PtdIns(3,4,5)P3, second messager intervenant dans différentes voies de signalisation cellulaire et impliqué dans de nombreux processus biologiques.<p>La surexpression de SHIP2 en cellule, de même que son invalidation chez la souris, ont montré un rôle de cet enzyme dans le contrôle négatif de la cascade de signalisation de l’insuline et dans la sensibilité à cette hormone. Par ailleurs, plusieurs études de polymorphismes chez l’homme ont montré une association entre ce gène et le diabète de type2.<p>La découverte au sein de notre laboratoire de la délétion d’un motif semblable à ceux présents dans les régions déstabilisatrices de type AU-riche dans la région 3’non codante (3’UTR) du gène SHIP2 chez des patients atteints de diabète de type 2, nous a conduit à explorer le rôle de cette région dans le contrôle de l’expression de SHIP2.<p>Dans ce but, nous avons entrepris d’identifier des protéines capables de lier ce motif AU-riche et d’entraîner l’ARN de SHIP2 vers la dégradation, et ce par deux techniques distinctes :l’une in vivo chez la levure (le triple hybride) et l’autre in vitro, par l’intermédiaire d’une sonde ARN biotinylée. Malheureusement, aucune de ces deux techniques ne nous a permis d’identifier des protéines se liant à l’ARNm de SHIP2. D’autre part, l’analyse de souris génétiquement modifiées présentant dans la région 3’UTR de SHIP2 une mutation similaire à celle observée chez les patients diabétiques n’a pas montré une augmentation significative d’expression de SHIP2 comme on aurait pu s’y attendre.<p>Malgré les différentes techniques mises en place, nous ne sommes pas parvenus à caractériser le rôle joué par le 3’UTR de SHIP2 sur le contrôle de son expression.<p>Dans le but de caractériser l’effet d’une surexpression de SHIP2 et de déterminer si une surexpression de ce gène pouvait mimer le phénotype de diabète de type 2 observé au sein de la population, nous avons généré des souris transgéniques d’addition par transgenèse lentivirale.<p>Deux axes phénotypiques majeurs ont été explorés chez ces souris :le métabolisme du glucose et la prise de poids consécutive à divers régimes alimentaire.<p>Les souris transgéniques présentent un retard dans la captation du glucose en réponse à une surcharge en glucose, s’accompagnant d’un défaut de sécrétion d’insuline. Par contre, aucune altération de la sensibilité à l’insuline n’est observée suite à une injection de cette hormone. Cette absence d’altération de la sensibilité à l’insuline est également soutenue par le fait qu’aucune altération de la captation de glucose n’est observée chez des souris surexprimant le transgène spécifiquement dans le muscle squelettique.<p>Les analyses de prise de poids des souris transgéniques ont révélé une résistance à l’obésité des mâles transgéniques lorsqu’ils sont soumis à un régime alimentaire riche en graisse. Par contre, aucune différence n’est observée sous régime alimentaire conventionnel ou faible en graisse. La plus faible prise de poids des souris transgéniques sous régime riche en graisse s’accompagnant d’une plus faible prise de nourriture, un rôle de SHIP2 dans la régulation du comportement alimentaire et de l’appétit n’est pas à exclure.<p>En conclusion, la surexpression de SHIP2 chez la souris provoque une intolérance au glucose induite, en tout cas en partie, par une plus faible sécrétion d’insuline, ainsi qu’une résistance à l’obésité induite par un régime riche en graisse.<p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished