Orientador: Mario Jose Abdalla Saad / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-07-22T13:35:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carvalho_CarlaRobertadeOliveira_D.pdf: 7786553 bytes, checksum: 2b33335c5ecf4960d08954265cb09959 (MD5) Previous issue date: 1997 / Resumo: A insulina estimula a atividade tiro sina quinase de seu receptor, resultando na fosforilação de substratos citosólicos, IRS-I e IRS-2, que se associam à fosfatidilinositol-3-quinase (PI 3-quinase), ativando-a. A resistência à insulina é uma condição fIsiopatológica associada ao envelhecimento. Entretanto, o mecanismo molecular envolvido nesta situação de resistência não é conhecido. Neste estudo, examinamos a regulação das proteínas envolvidas nas etapas iniciais da ação insulínica em fígado e músculo de ratos com diferentes idades, 2, 5, 12 e 20 meses. Não houve mudanças na concentração do receptor de insulina, em ambos os tecidos, em ratos com 2 e 20 meses de idade (idosos), determinado pelo "immunoblotting" com anticorpo anti-receptor de insulina. Entretanto o grau de fosforilação, refletindo a autofosforilação do receptor, mostrou um especillcidade tecidual, diminuindo em fígado, para 66±7% (p<0,05), mas não em músculo, nos ratos com 20 meses. Curiosamente, os níveis protéicos teciduais de IRS-l diminuiram precocemente (5 meses) para 51±9% (p<0,001) e permaneceram em níveis reduzidos, em músculo, porém não em fígado. Nas amostras de animais com 2 e 20 meses, previamente imunoprecipitadas com anticorpos anti¬IRS-l e' anti-IRS-2 e incubadas com anticorpo antifosfotirosina, houve redução do grau de fosforilação para 39±9% (p<0,001) e 55±12% (p<0,001) respectivamente em fígado e para13±2% (p<0,01) e 10±3% (p<0,05) em músculo, respectivamente. A associação IRS-l/PI 3-quinase diminuiu significativamente para 27±14% (p<0,01) e 20±1O% (p<0,005) em fígado e músculo de ratos senis, respectivamente. A associação IRS-2/PI 3-quinase apresentou uma variação tecido específica, sem alteração no tecido hepático e diminuindo signillcantemente para 5001 % (p<0,05) em músculo dos ratos com 20 meses. Estes dados sugerem que alterações, nas etapas iniciais da transmissão do sinal insulínico, podem contribuir para a resistência à insulina observada em animais senis. A seguir, constou também dos objetivos deste estudo investigar o efeito do captopril, inibidor da enzima conversora da angiotensina, que aumenta a sensibilidade à insulina, nas etapas iniciais da ação insulínica, em ratos senesce. Os animais com 20 meses que receberam o captopril apresentaram um aumento da sensibilidade à insulina, demonstrado pelo teste venoso de tolerância à insulina, acompanhado de um aumento na autofosforilação, induzido pela insulina de seu receptor de 462±253% (p<0,05) em fígado e de 697±78% (p<0,001) em músculo dos ratos. Houve, concornitantemente, um aumento no grau de fosforilação do IRS-l para 25O±17% (p<0,001) e 280±50% (p<0,05) no fígado e músculo respectivamente. E a associação IRS-l/PI 3-quinase aumentou para 305±20% (p<0,001) em fígado e para 267±48% (p<0,05) em músculo. Corno o captopril age, tanto diminuindo os níveis de angiotensina 11 corno elevando os níveis de bradicinina, estes efeitos foram simulados, na tentativa de isolar o efeito predominante nas etapas inicias da ação insulfuica. A administração de losartan, um inibido r do receptor de angiotensina 11, não induziu efeitos no grau de fosforilação do IRS-l, nos tecidos estudados. A administração aguda de bradicinina aumentou o grau de fosforilação, induzido pela insulina, em seu receptor e no IRS-l de fígado e músculo dos ratos senis. Tais dados demonstram que o captopril modula as etapas iniciais da ação insulínica e que estes efeitos podem ser simulados pela administração de bradicinina / Abstract: Insulin initiates its metabolic and growth-promoting effects by binding to the a subunit of its receptor, thereby activating the kinase in the J3 subunit. This event leads to tyrosyl phosphorylation of its cytosolic substrate, insulin receptor substrate-l (IRS-l), which in tum associates with and activates phosphatidylinositol 3-kinase (pI 3-kinase). The clínical use of angiotensin-converting enzyme inhibitors (ACEi) has been associated with increased insulin sensitivity. However, the exact molecular mechanism is unknown. In the present study, we have examined the phosphorylation status of the insulin receptor and IRS-l, as well as the association between IRS-l and PI 3-kinase in the liver and muscle of rats treated acutely with captopril, using immunoprecipitation with anti¬peptide antibodies to the insulin receptor, IRS-l, and immunoblotting with antiphosphotyrosine and anti-PI 3-kinase antibodies. Insulin stimulation increased receptor autophosphorylation to 462:1=253% (p<0.05) in the liver and 697:1:78% (p<0.001) in the muscle of ACEi treated rats. There were also increases to 250:1:17% (p<O.OOI) and 280:1:50% (p<0.05) in the insulin-stimulated IRS-l phosphorylation levels in the liver and muscle, respectively, of animals treated with captopril. The insulin-stimulated IRS-l association with PI 3-kinase in the liver rose to 305:1:200/0 (p<0.001) and in the muscle to 267:1:48% (p<0.05). The losartan, an angiotensin receptor (ATl) blocker, had no significant effect on insulin-stimulated IRS-l phosphorylation in both tissues. The acute administration of bradykinin increased insulin¬stimulated tyrosine phosphorylation of the insulin receptor and of IRS-l in the liver and muscle. These data demonstrate that ACE inhibitors modulate the early steps of insulin signalling, and that this effect may be simulated by the administration of bradykinin / Doutorado / Clinica Medica / Doutor em Ciências Médicas

Orientador: Mario Jose Abdalla Saad / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-02T07:59:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carvalheira_JoseBarretoCampello_D.pdf: 29196532 bytes, checksum: 6adaf88914f9488a42fc234e6f8867f9 (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: Insulina e leptina atuam de forma semelhante e aditiva para controlar a homeostase energética. Entretanto, a base molecular desse sinergismo permanece desconhecida. A insulina sinaliza através de um receptor tirosina quinase que fosforila e ativa seus substratos (IRSs - substratos do receptor de insulina), enquanto a leptina e sua proteína tirosina quinase associada JAK2 (Janus Kinase 2) medeiam a fosforilação e ativação do fator de transcrição STAT3 (Signal Transducer and Activator of Transcription). Para investigar se a insulina e a leptina ativam as mesmas vias de sinalização e para determinar se esses hormônios interagem em hipotálamo, ratos Wistar machos foram estudados após implante de cânula no terceiro ventrículo através de imunoprecipitação, immunoblotting e gel shift. A administração aguda intracerebroventricular (icv) de insulina resultou em aumento da fosforilação do receptor de insulina (IR), substrato 1 do receptor de insulina (JRS-l), substrato 2 do receptor de insulina (IRS-2) e MAPK (Mitogen Activated Protein Kinase), além da associação entre os IRSs e a PI 3-quinase e a fosforilação em serina da Akt. A administração icv de leptina resultou na fosforilação em tirosina da JAK2, OBR, STAT3, IRS-1, IRS-2 e MAPK, bem como da associação entre os IRSs e a PI 3-quinase mas não foi observada a fosforilação da Akt. O estímulo simultâneo com os dois hormônios não aumentou a fosforilação do IRS-1, IRS-2, Akt e MAPK quando comparado com a administração isolada de insulina. Em contrapartida, a insulina induziu a fosforilação da JAK2 e do receptor de leptina (OBR) que, em presença de leptina, aumentou a interação entre o STAT3 e o OBR com conseqüente aumento da ativação do STAT3. A leptina ativou as vias de sinalização classicamente induzidas pela insulina no hipotálamo, e essas vias se intercruzaram, mas foram utilizadas de forma distinta que quando utilizadas pela insulina. Por outro lado a insulina modulou positivamente a via de sinalização da leptina. Esses resultados proporcionam uma base molecular para os efeitos coordenados da insulina e leptina no controle do apetite e peso corporal. Para demonstrar interdependência entre as vias de sinalização da insulina e leptina em hipotálamo de ratos, a transmissão do sinal de insulina em direção às vias da PI 3-quinase e MAPK foi comparada em hipotálamo de ratos zucker obesos (modelo animal de resistência insulina causado pela mutação do receptor de leptina) e controle. A infusão icv de insulina reduziu a ingestão alimentar de ratos controle, o que não foi observado nos animais obesos. Constatamos redução da fosforilação do IR, IRS-1, IRS-2, da associação entre a subunidade p85 da PI 3-quinase com as proteínas IRSs, bem como da fosforilação em serina da Akt no hipotálamo de ratos obesos comparado com os ratos magros. Em contraste, a insulina estimulou a fosforilação em tirosina da MAPK de forma similar em ratos magros e obesos. Assim, documentamos resistência à sinalização da insulina em tecidos hipotalâmicos de ratos Zucker obesos. Esses resultados fortalecem a hipótese de que a insulina tem suas ações anti-obesidade através da via da PI 3-quinase e que a diminuição do sinal por esta via no hipotálamo pode contribuir para o desenvolvimento de obesidade em estados de resistência à insulina. Originalmente, pensava-se que o hipotálamo era o único tecido a expressar a forma longa do receptor de leptina. Entretanto, evidências recentes sugerem que órgãos periféricos, entre eles o figado, também expressam a forma longa do receptor. Assim, na segunda parte deste estudo investigamos os efeitos rápidos e diretos da leptina em figado e determinamos se a leptina interage com a insulina nesse órgão. Em figado de ratos a injeção aguda de leptina ou insulina estimulou a fosforilação da JAK2, STAT3 e STAT5b. A leptina foi menos efetiva que a insulina em estimular as proteínas IRS e a associação destas com a PI 3-quinase. O tratamento simultâneo com os dois hormônios não modificou a fosforilação máxima do STAT3, IRS-l, IRS-2 e Akt, mas causou aumento significativo da fosforilação da JAK2 e do STAT5b quando comparado com a administração isolada de insulina ou leptina. Assim, detectamos uma inter-relação positiva nas vias de sinalização desses hormônios nas proteínas JAK2 e STAT5b em figado de ratos. Concluindo, estes estudos caracterizaram as vias de transmissão do sinal de leptina em hipotálamo e figado, evidenciando mecanismos para a integração da sinalização de insulina e leptina bem como a modulação destas vias em modelo animal de resistência à insulina e leptina nesses tecidos / Abstract: Insulin and leptin have overlapping effects in the control of energy homeostasis and glucose metabolism, but the molecular basis of this synergism is unknown. Insulin signals through a receptor tyrosine kinase that phosphorylates and activates the docking proteins IRSs (insulin receptor substrates), whereas the leptin receptor and its associated protein tyrosine kinase JAK2 (Janus kinase 2) mediate phosphorylation and activation of the transcription factor STAT3 (signal transducer and activator oftranscription). To investigate whether insulin and leptin share common intracellular signal transduction pathways and to determine whether these hormonal signaling systems modulate each other's action in rat hypothalamus male Wistar rats were studied after chronic implantation of an intracerebroventricular (i.c.v.) catheter into the third ventricle. Immunoprecipitation, immunoblotting and EMSA assays were used to examine the activation of insulin and leptin signaling molecules in the rat hypothalamus. Acute i.c.v. administration of insulin resulted in a time-dependent increase in tyrosine phosphorylation of the insulin receptor (IR), insulin receptor substrate 1 (IRS-1), insulin receptor substrate 2 (IRS-2) and MAPK (mitogen activated proein kinase), PI 3 kinase docking and serine phosphorylation of Akt. The i.c.v. administration of leptin resulted in tyrosine phosphorylation of JAK2, IRS-1, IRS-2 and MAPK and PI 3 kinase docking but no phosphorylation of Akt was observed. Simultaneous stimulation with both hormones did not increment tyrosine phosphorylation of IRS-1, IRS-2, Akt and MAPK when compared with isolated administration of insulin. In addition insulin induced JAK2 tyrosine phosphorylation and leptin receptor phosphorylation, which in the presence of leptin, augmented the interaction between STAT3 and this receptor. Insulin also increased the leptin-induced phosphorylation of STAT3 and its activation. Leptin rapidly activates classically insulin signaling pathways directly at the level of hypothalamus, and these pathways overlap with, but are distinct from, those engaged by insulin. On the other side, insulin modulates the leptin signal transduction pathway, and may provide a molecular basis for the coordinated effects of insulin and leptin in feeding behavior and weight control. To demonstrate the interdependence between insulin and leptin signaling in rat hypothalamus in vivo insulin signaling through the phosphatidylinositol 3-kinase (pI 3-kinase), mitogen-activated protein (MAP) kinase were compared in the hypothalamictissues of lean (Fa/?) and obese Zucker (falfa) rats (animal model of insulin resistance, which has a defect in the leptin receptor). Icv insulin infusion reduced food intake in Iean rats but no effect was observed in obese Zucker rats. Pretreatment with PI 3-kinase inhibitors prevents insulin-induced anorexia in lean rats. Insulin-stimulated tyrosine phosphorylation of insulin receptor (IR), IR substrates (IRS-1, IRS-2), the associations of p85 subunit of PI 3-kinase to the IRS proteins and serine phosphorylation of Akt in the hypothalamus of obese rats were significantly decreased compared with the lean rats. In contrast, insulin stimulated tyrosine phosphorylation of MAP kinase was similar in lean and obese rats. This segment of the study provides direct measurements of insulin signaIing in hypothalamic tissues, and document selective resistance to insulin signaling in the hypothalamus of obese Zucker rats at the molecular leveI. These findings have provided support for the hypothesis that insulin may have anti-obesity actions mediated by the PI 3-kinase pathway and that the impaired PI 3-kinase signal pathway in the hypothalamus may Iead to the development of obesity in insulin resistance and diabetic patients. Originally, it was thought that the hypothalamus was the only tissue expressing OBRb. However, recent evidence at the level of messenger RNA expression and cellular function suggest that peripheral organs including liver also express OBRb. Therefore the second part of the study was designed to investigate the rapid and potentially direct effects of leptin on signal transduction in liver and to determine whether insulin and leptin share common intracellular signal transduction pathways. Chronic leptin treatment markedly enhances the action of insulin on hepatic glucose production out of proportion to the body weight loss and increased insulin sensitivity. In the present experiments the cross-talk between insulin and leptin was evaluated in rat liver. Leptin, upon stimulation of JAK2 tyrosine phosphorylation, induced JAK2 coimmunoprecipitation with STAT3, STAT5b, IRS-1 and IRS-2. This phenomenon parallels the leptin-induced tyrosine phosphorylation of STAT3, STAT5b, IRS-1 and IRS-2. Acutely injected insulin stimulated a mild increase in tyrosine phosphorylation of JAK2, STAT3 and STAT5b. Leptin was less effective than insulin at stimulating IRSs phosphorylation and their associations with PI 3-kinase. Simultaneous treatment with both hormones promoted no change in maximal phosphorylation of STAT3, IRS-l, IRS-2 and Akt, but led to marked increase in tyrosine phosphorylation of JAK2 and STAT5b when compared with isolated administration of insulin or leptin. Thus, there is a positive cross-talk between insulin and leptin signaling pathways at the level of JAK2 and STAT5b in rat liver. We have characterized the leptin signaling pathway in hypothalamus and liver and demonstrate various mechanisms for the integration between insulin and leptin in these tissues. We have also showed that the cross-talk between these hormones is tissue dependent and that the effects of this interaction affects the energetic homeostasis and glucose metabolism in the various steps / Doutorado / Clinica Medica / Doutor em Clínica Médica

Orientador: Licio Augusto Velloso / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-07-26T23:18:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rocha_EduardoMelani_D.pdf: 3720932 bytes, checksum: c01b00052a61b99bdf9da344920c7519 (MD5) Previous issue date: 2000 / Resumo: As células da superficie ocular assim como os tecidos das glândulas salivares e lacrimais respondem à insulina quando em cultura, e podem softer modulação no seu ritmo de proliferação quando expostas a este hormônio. Os objetivos do presente estudo foram: (1) investigar a presença da insulina no filme lacrimal; (2) identificar o receptor de insulina, bem como os elementos participantes da via de sinalização intracelular da insulina nestes tecidos; (3) conhecer os efeitos de diabetes mellitus, envelhecimento e gênero sobre as etapas iniciais da sinalização da insulina em glândulas lacrimais e salivares de ratos. A presença de insulina na lágrima foi avaliada por radioimunoensaio enquanto que a identificação dos elementos envolvidos na transmissão do sinal insulínico e a resposta celular ao hormônio foram avaliados através de imunohistoquímica, imunoprecipitação e "imunoblotting". A insulina foi identificada em lágrima humana, havendo aparente relação com níveis circulatórios do hormônio. Demonstrou-se que: o receptor de insulina e o IGFIR estão presentes na cómea e na conjuntiva humana, e também que o RI, IRS-l, IRS-2, Shc, IGF-IR e STAT-l estão presentes em glândulas lacrimais e salivares de ratos; a fosforilação insulino-induzida do receptor de insulina foi significativamente menor em glândula lacrimal de ratos diabéticos, senis e do gênero feminino se comparados a seus respectivos grupos-controle; a fosforilação do receptor de insulina foi significativamente menor em glândulas salivares de ratos velhos e do gênero feminino do que em seus respectivos grupos-controle. O presente estudo traz evidências da ação da insulina sobre glândulas lacrimais e salivares, e na superficie ocular, bem como indícios de que o dia,betes mellitus, o envelhecimento e o gênero influenciam a transmissão do sinal da insuIIDa em glândulas lacrimais e salivares / Abstract: Insulin plays a major role in lacrimal and salivary gland function and may also regula te growth, metabolism and gene expression in those tissues and in ocular surface cells as well. In addition, cells isolated ITom the ocular surface and ITom exocrine glands depend on insulin for optimal survival in culture. The objectives of the present study were to investiga te the presence of insulin in tears as well as the expression and functional, status of the insulin receptor and elements participating in the insulin signaling pathway in ocular surface, salivary and lacrimal glands. Insulin was detected by radioimmunoassay in tear fi1m of humans and apparently correlates with plasma insulin. Immunoperoxidase technique was used to localize insulin and IGF-I receptors in human comea and conjunctiva and rat lacrimal and salivary glands. The insulin-induced phosphorylation in a time- and dosedependent fashion was observed for insulin receptors IGF-IR, IRS-l, IRS-2, Shc and STAT1, as evaluated by mmunoprecipitation and immunoblotting procedures. The insulin receptor phosphorylation in response to insulin was lower in lacrimal glands of diabetic, senile and female rats as compared to controIs. In salivary glands, similar findings were also observed in senile and female rats as compared to the controIs. There was also a significantly lower phosphorylation of ST A T -1 in response to insulin in lacrimal glands of diabetic rats and salivary glands of senile rats, compared to their respective controIs. The present study suggests that insulin, by acting through elements of its signaling pathwày may directly participate in the modulation of cellgrowth and survival in the ocular surface and lacrimal and salivary glands, and that insulin signaling in such sites may be influensed by diabetes mellitus, aging and gender / Doutorado / Clinica Medica / Doutor em Clínica Médica

Orientador: Jose Butori Lopes de Faria / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-04T18:45:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pavan_MariaValeria_M.pdf: 13374436 bytes, checksum: d18553a0c68ce988d91e70a1e20da7dd (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da prevenção da hipertensão arterial com drogas que bloqueiam o sistema renina-angiotensina ou terapia convencional na nefropatia diabética de um modelo de hipertensão genética e diabetes mellitus. Ratos espontaneamente hipertensos (SHR), com 4 semanas de idade, com diabetes induzido por estreptozotocina, foram randomizados para não receberem tratamento anti-hipertensivo, ou serem tratados com captopril, ou losartan, ou terapia tríplice (hidroclorotiazida, reserpina e hidralazina) durante 16 semanas. SHR controles receberam somente veículo da estreptozotocina. O aumento da pressão arterial sistólica foi semelhante no grupo SHR controle (186 '+ ou -' 3 mmHg, média '+ ou -' EP) e SHR diabético (190 '+ ou -' 4) e foi normalizada com captopril (128 '+ ou -' 3), losartan (128 '+ ou -' 2) e terapia tríplice (129 '+ ou -' 2, p<0.0001). A albuminúria no grupo SHR diabético foi maior que no controle [média geométrica (variação), 1547 (1076-3018) vs 472 (319-685), p<0.0001]e foi igualmente reduzida com captopril [499 (404-659)], losartan [622 (470-976)] e terapia tríplice [479 (362-600), 'mu'g/24h, (p<0.0001)]. A expressão renal de fibronectina aumentou no grupo SHR diabético (125 '+ ou -' 13 unidades densitométricas, média '+ ou -' EP) comparada ao controle (51 '+ ou -' 9, p<O.OOO1) e diminuiu (p<0.0001 vs diabéticos) com captopril (32 '+ ou -' 8), losartan (27 '+ ou -' 4) e terapia tríplice (35 '+ ou -' 6). A prevenção do desenvolvimento da hipertensão nos ratos SHR diabéticos tratados com captopril, losartan ou terapia tríplice foi igualmente eficaz em reduzir a albuminúria e a expressão de fibronectina renal. Neste modelo o controle estrito da pressão arterial, mais que a classe terapêutica utilizada, foi determinante na atenuação da nefropatia diabética / Abstract: The aim of this study was to evaluate the effect of preventing hypertension with drugs that block the renin-angiotensin system or conventional therapy on diabetic nephropathy in a model of genetic hypertension and diabetes. Four-week-old spontaneously hypertensive rats (SHR) streptozotocin-induced diabetes were randomized for no treatment, or for treatment with captopril, losartan or triple therapy (hydrochlorothiazide, reserpine and hydralazine) for 16 weeks. Control SHR received only water. Systolic blood pressure (SBP) increased similarly in control (186 '+ ou -' 3 mmHg, mean '+ ou -' SE) and diabetic SHR (190 '+ ou -' 4) but was reduced to normal range by captopril (128 '+ ou -' 3), losartan (128 '+ ou -' 2) and triple therapy (129 '+ ou -' 2, p<0.0001). Albuminuria was higher in diabetic than in control SHR [geometric mean (variance), 1547 (1076-3018) vs 472 (319-685), p<0.0001]and it was similarly reduced with captopril [499 (404-659)], losartan [622 (470-976)] and triple therapy [479 (362-600), 'mu'g/24h, (p<0.0001)]. Renal fibronectin expression increased in diabetic (125 '+ ou -' 3 densitometric unit, mean '+ ou -' SE) as compared to the controls (51 '+ ou -' 9, p<0.0001)and decreased (p<0.0001 vs diabetic SHR) in captopril (32 '+ ou -' 8), losartan (27 '+ ou -' 4) and triple therapy (35 '+ ou -' 6). Prevention of hypertension in diabetic SHR by captopril, losartan or triple therapy was equally efficacious in reducing albuminuria and expression of renal fibronectin. This results show that tight BP control rather than the class of antihypertensive agent is the main determinant ofattenuation in nephropathy / Mestrado / Clinica Medica / Mestre em Clinica Medica

Orientadores: Mario Jose Abdalla Saad / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-07T12:18:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 CarvalhoFilho_MarcoAntoniode_D.pdf: 1466096 bytes, checksum: 1f931970ba1d622a7bfb3430a68142f0 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: Evidências recentes implicam a indução da NO-sintase induzível (iNOS) no desenvolvimento de resistência à insulina associada à obesidade e endotoxemia. A induçãoda iNOS está associada ao aumento da produção de NO, que vem se mostrando um importante sinalizador intra-celular, modificando a função protéica por diversos mecanismos, incluindo Nitrosilação, Nitração e S-nitrosação. A S-nitrosação ocorre pela adição de um grupamento NO ao radical tiol (S-H) de um resíduo de cisteína, formando um nitrosotiol (S-NO). Neste estudo, investigamos se drogas doadoras de NO, Nitrosogluatationa (GSNO) ou Nitrosocisteína (CISNO), e a própria indução da iNOS seriam capazes de provocar S-nitrosação e com isso modificar a função de proteínas envolvidas na via de sinalização insulínica. A insulina inicia suas ações intra-celulares após a ligação à subunidade a do seu receptor transmembrana, o que provoca mudança conformacional e conseqüente auto-fosforilação da subunidade ß, o que ativa sua capacidade tirosina-quinase. Ocorre, então, associação e fosforilação do substrato 1 do receptor de insulina (IRS-1), que uma vez fosforilado, se associa e ativa a fosfatidil inositol 3 quinase (PI 3 quinase), passo fundamental para a ativação da Akt, serina-quinase que modula tanto ações metabólicas quanto de crescimento desencadeadas pela insulina. Neste estudo demonstramos que tanto GSNO quanto CISNO foram capazes de provocar resistência à insulina, tanto em músculo isolado, quanto em animais intactos. Esta resistência foi associada a menor sinalização de insulina pela via IRß/IRS-1/Akt. Após o tratamento com GSNO ou CISNO de músculo isolado ou de animais intactos, observamos S-nitrosação da subunidade ß do receptor de insuilna, o que provocou menor auto-fosforilação e menor atividade tirosina-quinase após estímulo com insulina. Observamos também S-nitrosação do IRS-1, e após o tratamento crônico com droga doadora, os níveis teciduais desta proteína estavam diminuídos. A Akt também foi alvo de S-nitrosação, que aconteceu em paralelo com a perda de sua capacidade serina-quinase, tanto basal , quanto estimulada por insulina. Observamos indução da iNOS em três modelos de resistência à insulina, na obesidade induzida por dieta hiperlipídica, no camundongo diabético ob/ob e na endotoxemia induzida pela infusão de LPS. Nestes três modelos, a sinalização de insulina pela via IRß/IRS-1/Akt estava diminuída, e os níveis de S-nitrosação destas proteínas estava aumentado. Os níveis teciduais de IRS-1 também estavam diminuídos nos três modelos. O bloqueio da indução da iNOS por rosiglitazona no animal com obesidade induzida por dieta, ou por interferência na transcrição da iNOS no camundongo ob/ob, ou pela anulação do gene codificador da iNOS na endotoxemia induzida por LPS, diminuiu o desenvolvimento de resistência à insulina nestes modelos, e impediu a S-nitrosação destas proteínas. Portanto, a S-nitrosação de proteínas envolvidas na transmissão do sinal de insulina é um novo mecanismo molecular de resistência à insulina associado a indução da iNOS / Abstract: Evidence demonstrates that exogenous nitric oxide (NO) and the NO produced by inducible nitric oxide synthase (iNOS) can induce insulin resistance in muscle. Here, we investigated whether this insulin resistance could be mediated by S-nitrosation of proteins involved in early steps of the insulin signal transduction pathway. Exogenous NO donated by S-nitrosoglutathione (GSNO) or by Nitrosocysteine (CYSNO) induced in vitro and in vivo S-nitrosation of the insulin receptor ß subunit (IRß) and protein kinase B/Akt (Akt), and reduced their kinase activity in muscle. Insulin receptor substrate (IRS)-1 was also rapidly S-nitrosated, and its expression was reduced after chronic GSNO treatment. In tree animal models of insulin resistance associated with enhanced iNOS expression ¿ diet-induced obesity, the ob/ob diabetic mice and endotoxemia induced by LPS infusion ¿ we observed enhanced S-nitrosation or IRß/IRS-1 and Akt in muscle. Blocking iNOS induction in muscle by Rosiglitazone in diet-induced obesity, by iNOS anti-sense in ob/ob mice or by genetic knockout in endotoxemia reversed S-nitrosation of these proteins yielding an improvement in insulin action through this pathway. Thus, S-nitrosation of proteins related to insulin signal transduction is a novel molecular mechanism of iNOS-induced insulin resistance / Doutorado / Clinica Medica / Doutor em Clínica Médica

Orientadores: Maria Alice Roston de Mello, Antonio Carlos Boschero / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-23T20:39:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Latorraca_MarciaQueiroz_D.pdf: 5299941 bytes, checksum: b0e3e2cc69f2d831a69c78427432010f (MD5) Previous issue date: 1998 / Resumo: Estudos epidemiológicos têm sugerido que a desnutrição intra-uterina e durante a infância é um dos principais determinantes da suscetibilidade a doenças como o diabetes do tipo 2 e a síndrome de resistência à insulina. Presume-se que a desnutrição materna afete o crescimento inicial da prole, altere a secreção de insulina e a sensibilidade a esse hormônio. No presente trabalho estudamos a influência da restrição protéica durante a vida intra-uterina e a lactação sobre a secreção e a ação da insulina em ratos recém-desmamados e em ratos adultos recuperados da desnutrição. A secreção de insulina e a homeostasia da glicose foram examinadas em crias recém-desmamadas (28 dias de vida) de ratas Wistar alimentadas durante a gravidez e a lactação com dieta contendo 17% de proteína (grupo NP) e 6% de proteína (grupo LP). Durante teste de tolerância à glicose oral, ratos do grupo LP apresentaram áreas sob as curvas de concentração de glicose e de insulina séricas menores em relação aos ratos do grupo NP. A velocidade de desaparecimento da glicose durante teste subcutâneo de tolerância à insulina (Kitt) foi maior no grupo LP do que no grupo NP, indicando aumento da sensibilidade à insulina. Ilhotas pancreáticas isoladas de ratos do grupo LP apresentaram redução da secreção de insulina frente à estimulação com glicose, arginina e leucina. Essas ilhotas apresentaram redução da primeira e segunda fases de secreção de insulina em resposta à glicose. Finalmente, nas ilhotas pancreáticas do grupo LP a incorporação de 45Ca após 5 ou 90 minutos de incubação em meio contendo glicose (que refletem principalmente a entrada e a retenção de Ca2+, respectivamente) foi menor em relação às ilhotas do grupo NP. A secreção de insulina e a sensibilidade ao hormônio foram avaliadas em ratos adultos (90 dias de vida) mantidos com uma dieta contendo 17% de proteína (grupo C) ou 6% de proteína (grupo LP) durante a vida intra-uterina, a lactação e após o desmame, e em ratos que receberam uma dieta contendo 6% de proteína durante a vida fetal e a lactação e uma dieta contendo 17% de proteína após o desmame (grupo R). Durante o teste de tolerância à glicose oral, as áreas sob as curvas de concentração de glicose sérica foram similares nos três grupos. Ratos dos grupo LP e R apresentaram áreas sob as curvas de concentração de insulina sérica significativamente reduzidas em relação aos ratos do grupo C. A velocidade de desaparecimento da glicose durante o teste intravenoso de tolerância à insulina (Kitt) foi maior nos ratos do grupo LP em relação aos ratos dos grupos C e R. Em ilhotas isoladas a secreção de insulina em resposta à glicose foi diferente entre os grupos testados, sendo maior no grupo C e menor no grupo LP. Em músculo gastrocnêmio de ratos do grupo LP foi observado aumento dos níveis de receptor de insulina, da fosforilação de substrato-l do receptor de insulina (IRS-l) e maior associação entre o substrato-l do receptor de insulina e fosfatidilinositol 3-quinase (PI 3-quinase) em relação aos animais do grupo C. No grupo R as alterações dos passos iniciais da ação da insulina foram parcialmente restauradas. Esses resultados tomados em conjunto sugerem que a desnutrição durante a vida intra-uterina e a lactação altera permanentemente a secreção de insulina. A resposta insulínica deficiente &ente à estimulação com glicose e aminoácidos pode estar associada à incapacidade das células beta pancreáticas em "manejar" adequadamente os íons cálcio. Em ratos desnutridos e recuperados, a homeostasia glicêmica é mantida, pelo menos em parte, pelo aumento da sensibilidade à insulina, resultante das alterações nos passos iniciais da via de sinalização do referido hormônio / Abstract: Epidemiological studies have suggested that fetal and infantil malnutrition are major factors determining susceptibility to type 2 diabetes and the insulin-resistance syndrome. It has been suggested that maternal malnutrition affect early growth and determine permanent alterations in insulin secretion and sensitivity of offspring. Therefore, we investigated the influence of protein deprivation during intrauterine and lactation phases on insulin secretion and action in weaned rats and in adult rats recovered from malnutrition. At weaning (28 days of age) glucose homeostasis was examined in offspring from dams fed a normal protein (17%) diet (NP group) or a diet containing 6% protein (LP group). The oral glucose tolerance test revealed less blood glucose and insulin concentration in the offspring from the LP group when compared to the NP group. The glucose disappearance rate (Kitt) was higher in the LP group than in the NP group, indicating increased sensitivity to insulin in target tissues. Isolated islets derived from LP rats displayed reduced insulin secretion in response to glucose, arginine and leucine. In LP islets, the first and second phases of glucose-induced insulin secretion were drastically reduced. Finally, in LP islets the 45Ca uptake after 5 or 90 min incubation in medium containing glucose (that reflects mainly the entry of Ca2+, and the retention of Ca2+, respectively) was lower than in NP islets. Insulin secretion and sensivity were also evaluated in adult rats (90 days of age) maintained on a diet of 17% protein (C group) or 6% protein (LP group) during fetal life, suckling and after weaning, and in rats receiving 6% protein during fetal life and suckling followed by a 17% protein diet after weaning (R group). In LP and R rats, the mean total areas under the glucose curves in response to an oral glucose load were not significant1y different from that in C rats. The mean total areas under the insulin curves were similar in the LP and R rats, and these values were lower than those of C rats. The glucose disappearance rate during an i.v. insulin tolerance test (Kitt) was greater in the LP group than in the C and R groups. In isolated islets glucose-induced insulin secretion was significant1y different among the three groups, LP islets showing the highest values and C islets the lowest. When hind-limb muscles were ana1yzed, LP rats showed greater insulin receptor levels, higher insulin receptor substrate 1 phosphorilation and greater association between insulin receptor substrate-l and phosphatidilinositol 3-kinase. In the R group, the changes in the early steps of insulin action were partially restored. In conclusion, these results suggest that malnutrition during early life produces pancreatic beta cell dysfunction, that is not completely restored by nutritional recovery. The poor secretory response to glucose and amino acids may occur through altered Ca2+ handling. Furthermore, in LP and R rats glucose homeostasis is maintained, at least in part, at the expense of increased insulin sensitivity that results from alterations in the early steps of the insulin signal transduction pathway / Doutorado / Fisiologia / Doutor em Ciências Biológicas

Orientadores: Ricardo Barini, Lourenço Sbragia Neto / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-11-27T12:29:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bueno_MarciaPereira_D.pdf: 2898828 bytes, checksum: 2c6dcaa4a20ec185bea4b47114c30a0e (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: A restrição do crescimento intrauterino (RCIU) limita o desenvolvimento fetal adequado aumentando a morbidade e mortalidades perinatais. Os mecanismos fetais adaptativos na RCIU podem desencadear alterações endócrinas e metabólicas que explicariam a ocorrência de doenças na idade adulta. O objetivo do estudo foi avaliar na RCIU experimental pela ligadura da artéria uterina se existem alterações na morfometria e histologia do fígado, intesti no e rins e se existem diferenças na expressão dos receptores de insulina, IR-(3, IRS-1, IRS-2, IGF-IR(3 no grupo de fetos submetidos à RCIU. O presente experimento foi submetido ao Comitê de Ética e Experimentação Animal da Universidade Estadual de Campinas (CEEA-UNICAMP) e aprovado como projeto de pesquisa N° 1644-1. Para realização do estudo utilizamos fetos de ratas Sprague Dawley divididos em 3 grupos. Grupo I (RCIU) - 40 fetos submetidos à ligadura da artéria uterina unilateral com 18,5 dias de gestação, Grupo II (Controle-RCIU) - 40 fetos do corno oposto ao da ligadura da artéria uterina e Grupo III (Controle Externo) - 40 fetos sem procedimento cirúrgico ou alimentar. Os resultados mostraram no modelo experimental de RCIU uma diminuição do peso corporal (PC), hepático (PH) e intestinal (PI) (p<0,01) no grupo RCIU, as relações entre PH/PC, PI/PC, PR/PC foram mantidas, fetos RC IU tem diminuição das camadas submucosas e mucosas intestinais (p<0,05); diminuição da camada cortical renal e do número de glomérulos, com aumento do volume glomerular (p<0,05). Na RCIU encontramos menor expressão hepática do IR-(3, IRS-1 e IRS-2, menor expressão do IRS-2 no intestino e rins e maior expressão do IGF-IR(3 em todos os tecidos. O modelo experimental estudado causou uma RCIU simétrica com alterações morfométricas e do metabolismo da glicose que poderiam justificar no futuro um maior risco de doenças metabólicas / Abstract: Intrauterine growth restriction (IUGR) limits appropriate fetal development increasing morbidity and perinatal mortality. Adaptive mechanisms in fetal IUGR may leave to endocrine and metabolic alterations that could explain the occurrence of diseases in adulthood. The aim of this study was to evaluate whether experimental IUGR by uterine artery ligation causes changes in morphology and histology of the liver, intestines and kidneys. We also evaluated if there were differences in the expression of insulin receptors, IR-(3, IRS-1, IRS-2, IGF-IR(3 of fetuses subjected to IUGR. This experiment was submitted to the Ethics and Animal Experimentation of the Campinas State University (UNICAMP CEEA) and was approved as a research project No. 1644-1. The study used fetuses Sprague-Dawley rats divided into 3 groups. Group I (IUGR) - 40 fetuses who underwent uterine artery ligation sided with 18.5 days of pregnancy Group II (Control-IUGR) - 40 fetuses of the horn opposite to the uterine artery ligation, and Group III (External Control) - 40 fetuses without surgery or food The results showed the experimental model of IUGR, a reduction in body weight (BW), liver (PH) and intestine (PI) (p <0.01) in IUGR, the relationship between PH/PC, PI/PC, PR/PC have been retai ned, IUGR fetuses have reduced layers of the intestinal mucosa and submucosa (p<0,05), decreased renal cortical layer and the glomerular number and increased volume rate (p<0,05). In IUGR found lower hepatic expression of IR-(3, IRS-1 and IRS-2, reduced expression of IRS-2 in the intestine and kidney and increased expression of IGF-IR(3 in all tissues. The experimental model studied caused a symmetrical IUGR with histological changes and glucose metabolism that could justify a greater risk of metabolic diseasesin the future / Doutorado / Ciencias Biomedicas / Doutor em Tocoginecologia