Depuis de nombreuses années, on observe un fort déclin des populations d'amphibiens à travers le monde et une augmentation marquée du taux de malformation des membres. Plusieurs causes sont suggérées pour expliquer l'émergence de ces effets sur le développement. Parmi celles-ci, la présence de fertilisants et de pesticides dans les cours d'eau semble être un facteur majeur impliqué dans ce phénomène étant donné que la peau des amphibiens est très perméable et parce que la plupart des malformations ont été répertoriées dans les marais avoisinant les zones d'agriculture intensive. Il est connu qu'un excès ou une carence en vitamine A (rétinol) durant le développement d'un organisme peut provoquer de graves effets sur le développement, voire même provoquer la mort au stade embryonnaire. Les rétinoïdes sont des molécules qui dérivent de la vitamine A, et l'acide rétinoïque (RA) est un des dérivés biologiquement actif. C'est un morphogène très puissant et ses effets sont assurés par la liaison et l'activation de récepteurs nucléaires spécifiques. Plusieurs pesticides sont connus pour affecter le développement et certains sont également connus pour interférer dans le métabolisme et les voies de signalisation de RA. L'objectif du présent projet était d'évaluer le potentiel tératogène de quelques contaminants d'origine agricole en mesurant leur capacité à affecter la différenciation cellulaire médiée par RA et le catabolisme de RA. Les cellules P19 de carcinome embryonnaire de souris ont été sélectionnées comme modèle d'étude. Ces cellules sont indifférenciées et peuvent se différencier en présence de différents inducteurs, dont RA. Un protocole de neurodifférenciation en agrégats et un second en monocouche ont été utilisés et le taux de différenciation cellulaire a été évalué par cytométrie de flux (FACS) à l'aide du marqueur de non-différenciation SSEA1 et du marqueur neuronal βIII-tubuline. La disparition de RA et sa métabolisation en dérivés polaires ont été mesurés par une méthode HPLC et un bioessai de métabolisation de courte durée permettant de tester de fortes concentrations de contaminants a été mis au point. L'atrazine, les nitrates et les nitrites ont été sélectionnés comme première série de contaminants étant donné que leur toxicité développementale n'est pas complètement documentée et parce qu'ils sont parmi les contaminants les plus abondants dans les cours d'eau avoisinant les zones agricoles. Le carbaryl et l'endosulfane ont été choisis pour une deuxième série d'analyses en considérant leurs effets déjà connus, le premier étant neurotoxique et le second étant tératogène et connu pour interférer dans le système des rétinoïdes. Les résultats ont montré qu'une augmentation de la concentration de RA diminuait SSEA 1 et augmentait βIII-tubuline de façon dose-dépendante. II a également été démontré que les cellules P19 métabolisent le RA, que ce métabolisme pouvait être inhibé partiellement par le clotrimazole (inhibiteur du cytochrome P450) et qu'il pouvait être suractivé suite à un prétraitement des cellules avec RA ou son analogue, le TTNPB. Les 3 premiers contaminants testés sur la différenciation neuronale en agrégats ont été utilisés à des concentrations de 100 à 10000 fois plus élevées que les normes canadiennes pour la protection de la vie aquatique. Les résultats n'ont pas permis de mesurer d'effets à des concentrations qui n'affectent pas la prolifération et/ou la viabilité cellulaire. Des concentrations de nitrites variant de 0 à 670 mg/L préviennent fortement la diminution de l'expression de SSEA1 et diminuent le nombre de cellules positives pour βlII-tubuline. Le carbaryl et l'endosulfane testés à 25 µM n'induisent pas la différenciation cellulaire de cellules cultivées en agrégats. Avec des cellules cultivées en monocouches, ces deux pesticides ont beaucoup affecté la prolifération et/ou la viabilité cellulaire et ont diminué le taux de cellules positives pour βIII-tubuline. Aucun des contaminants n'a affecté le métabolisme. Les résultats suggèrent que la cytotoxicité est probablement un facteur impliqué dans certains effets développementaux et que le système enzymatique impliqué dans la métabolisation de RA ne semble pas être une cible pour ces pesticides aux concentrations utilisées. Les effets de ces contaminants sur la liaison de RA à ses récepteurs, sur le métabolisme microsomal et/ou sur l'expression de diverses cibles cellulaires pourraient éventuellement être étudiés pour préciser les effets de type « rétinoïdiens ». ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Acide rétinoïque, Cellules P19, Contaminants agricoles, Différenciation cellulaire, FACS, HPLC.

Lors de la grossesse, différentes complications peuvent survenir et amener des conséquences néfastes sur la santé de la mère et du foetus. Par exemple, une malformation du placenta peut mener à des conditions pathologiques telles le retard de croissance intra-utérin ou la pré-éclampsie. Ces maladies semblent, respectivement, être causées par un désordre lors de la différenciation des cytotrophoblastes en syncytiotrophoblastes et une altération du transport de calcium de la mère au foetus. Il est donc essentiel de découvrir les mécanismes cellulaires et moléculaires qui régissent ces phénomènes afin de pouvoir, dans l'avenir, contrer le développement de telles conditions pathologiques. Chez la souris, le transport placentaire du calcium est dépendant du peptide apparenté à la parathormone (PTHrP) et son fragment N-terminal est impliqué dans le processus de différenciation des trophoblastes. Ainsi, cette étude a pour but premier de découvrir si la PTHrP (1-34) régule le transport calcique à travers les syncytiotrophoblastes humains. Par ailleurs, comme les Mitogen Activated Protein Kinases (MAPK) ERK1/2 et p38 sont impliquées dans le processus de différenciation des trophoblastes humains, cette étude vise aussi à déterminer si la PTHrP (1-34) peut stimuler la différenciation des trophoblastes humains via ces deux MAPKs. Il a tout d'abord été nécessaire de mettre au point un milieu de culture sans sérum pour observer les effets directs de l'hormone sur la différenciation cellulaire. Les cellules trophoblastiques sont isolées à partir de placentas humains frais et cultivées dans un milieu de culture sans sérum où la PTHrP est ajoutée en concentrations croissantes. Tout d'abord, la cytotoxicité cellulaire des différents traitements a été mesurée. La différenciation des cellules trophoblastiques est ensuite mesurée de manière biochimique par le dosage de l'hormone hCG et, de manière morphologique, par l'observation de la fusion cellulaire. L'activation des voies de signalisation de ERK1/2 et p38 est observée par irnmunobuvardage de type Western et par la capacité de l'hormone de réactiver la voie de signalisation suite à son blocage par un inhibiteur spécifique. La captation du calcium par les syncytiotrophoblastes est étudiée à l'aide de calcium radiomarqué (⁴⁵Ca²⁺) alors que l'effet de la PTHrP (1-34) sur les protéines impliquées dans le transport de l'ion calcique est étudié par PCR en temps réel et par immunobuvardage de type Western. Les résultats obtenus indiquent que les différents traitements administrés aux cellules trophoblastiques ne causent pas de mortalité cellulaire. Par la suite, nous avons constaté qu'une forte concentration de l'hormone stimule la différenciation des cellules cytotrophoblastiques en syncytiotrophoblastes. Ce processus de différenciation semble se faire par la MAPK ERK1/2 puisque cette dernière est davantage activée en présence de PTHrP (1-34). De plus, le fragment N-terminal de la PTHrP est capable de réactiver cette MAPK suite à son inhibition. Par la suite, il a été possible de constater que la présence du fragment N-terminal de la PTHrP dans le milieu de culture des cellules trophoblastiques permet une augmentation significative de l'expression des protéines PMCA1 et 4 au premier jour de culture. Ainsi, une perturbation de la concentration de PTHrP (1-34) pourrait être un phénomène impliqué dans des conditions pathologiques lors de la grossesse chez la femme enceinte. Éventuellement, il serait donc intéressant d'observer l'effet de cette hormone sur la différenciation et le transport calcique des trophoblastes chez des femmes atteintes de pré-éclampsie ou dont l'enfant souffre de retard de croissance intra-utérin. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Placenta, Trophoblaste, PTHrP, Différenciation, ERK1/2, p38, Calcium.

Les films multicouches de polyélectrolytes sont des auto-assemblages de polymères chargés formant des films dont l'épaisseur peut être variée de quelques nm à quelques µm. Un nombre croissant de travaux concerne la compréhension de leur mécanisme d'auto-assemblage et leur utilité pour modifier les propriétés physico-chimiques, topographiques ou mécaniques de surface de (bio)matériaux. Dans cette thèse, nous avons étudié les propriétés de films à base de poly(L-lysine) et de polysaccharides connus pour leur rôle physiologique, notamment le hyaluronane, la chondroïtine sulfate et l'héparine. Les compositions internes de ces films mono-constituants ou à base de mélanges de polyélectrolytes ont été sondées. L'influence de la chimie des polyélectrolytes sur la formation des films, en particulier l'importance des groupements sulfates, a été mise en évidence. Leur potentiel comme vecteur de délivrance d'un facteur de croissance, la BMP-2, a été évalué. De fortes quantités de BMP-2 ont pu être chargées dans les films à base de hyaluronane. Nous avons pu contrôler les quantités insérées en faisant varier la composition chimique des films, leur épaisseur ou la concentration en BMP-2 de la solution de chargement. Puis nous avons mis en évidence une différenciation contrôlée de façon dose-dépendante de cellules C2C12 pluripotentes sur les films bioactifs : différenciation myogénique (en absence de facteur) ou ostéoblastique. De plus, nous montrons qu'un contact des cellules avec le film bioactif est nécessaire pour induire leur différenciation. La protéine est donc présentée par « la phase solide », ce qui constitue un mode de présentation du facteur proche des conditions physiologiques. Des résultats préliminaires obtenus en recouvrant des biomatériaux orthopédiques par les films bioactifs laissent penser que ces films offrent des perspectives intéressantes dans le domaine de la régénération osseuse in vivo. / Polyelectrolyte multilayer films are self-assembled architectures forming nm to µm thick films. During the last decade, they have emerged as an efficient way of modifying materials surface properties such as chemistry, physico-chemical properties, topography as well as mechanical properties. Thanks to the technology's versatility and ease of use, polyelectrolyte multilayer films are now recognized as a new tool for modifying biomaterial surfaces and mediating cell behaviours and implant bio-integration. In this thesis, we studied the properties of poly(L-lysine) and polysaccharide-based multilayer films and focused on their physical-chemical properties as well as on their internal composition. In particular, we studies the influence of their chemistry (presence of carboxylic or sulfate groups) on film formation and characteristics. Three polysaccharides with increasing sulfate group content were chosen for this purpose: hyaluronan, chondroitin sulfate and heparin. The capacity of these films to act as a drug delivery vehicle for BMP-2 (a growth factor able to induce osteo-differentiation) was then assessed. High BMP-2 amounts were successfully loaded and retained in the films in a controlled manner. The loaded amounts could be modulated by varying the film's chemistry, film thickness or BMP-2 concentration in the loading solution. We showed that it is possible to control the extent of C2C12 cell differentiation in osteoblasts when cultured on the bioactive films. Importantly, when no BMP-2 is loaded in the films, the cells differentiated in to myotubes, their most common differentiation pathway. Cells needed a direct contact with the bioactive films to respond to BMP-2, suggesting that BMP-2 is mainly presented to the cells from the solid phase. Preliminary in vivo tests on film-coated orthopaedic biomaterials are encouraging. They showed that these films are interesting candidates for surface modification of orthopaedic biomaterials and may foster bone regeneration.

L'acide ascorbic acid (AA) a été considéré, pendant longtempss, comme une molecule devantêtre absorbée dans la nutrition, et prévenant le scorbut. Notre hypothèse, fondé sur desrésulats de notre groupe, suggèrent de nouvelles fonctions.Parmi celles-ci, nous nous sommes posé la question de l'AA molècule de signalling, durantl'embryogenèse et chez l'adulte, commme l'acide rétinoique (principe actif de la vitamine A)l'est. A cet effet, nous avons utilisé deux modèles cellulaires : des cellules souchesembryonnaires murines et des lignées de cellules souches/progénétrices adultes. Nous avonsainsi montré que l'AA stimule la différentiation de ces cellules en cellules musculairessquelettiques et en osteoblastes et inhibe l'adipogenèse et la neurogenèse. Cet effet passe parle transporteur de l'AA SVCT2 et implique la voie p38/MAPK. D'autre part, nous avonsdemontré que l'AA agit en compétition avec le RA, sur la neurogenèse et la myogenèse.Enfin, dans des cellules mésenchymateuses adultes, nous avons montré que l'AA inhibel'adipogenèse et stimule l'ostéogenèse. Cette action, comme chez l'embryon implique SVCT2et une modulation du pool du cAMP.En conclusion, l'AA pousse les cellules à se différencier en cellule musculaire squelettique eten ostéoblste et inhibie l'adipogenèse et la neurogenèse. / AA has been considered for a long time as a molecule involved in nutrition, to prevent scurvy. Our hypothesis is that AA could also be involved in development during embryogenesis, as well as in cell differentiation in adults. The aim of this study is to evaluate the potential implication of AA in cell differentiation, especially of mesenchyme cells, and to propose potential pathways that could be involved in these processes. Using murine ESCs we observed that AA markedly enhance the differentiation of ESCs toward muscle cells. Furthermore, we demonstrated that induction of myocytes by AA involves p38MAPK pathway and p-CREB. Moreover, we demonstrated that AA acts in mirror with retinoic acid. ESCs treated with RA mainly differentiate into neuronal cells, but AA compete, in a dosage dependent way to this differentiation. AA induces differentiation of ESCs into cardiac myocytes and could probably acts through p38MAPK pathway. Regarding adipocyte we revealed that SVCT2 expression significantly decreased as preadipocytes cells differentiate to adipocytes. This data suggests that mature adipocytes could not receive signals from AA. In addition, our results show that the expression of SVCT2 is increased in cells treated with AA and without IBMX. Moreover, we demonstrated that AA evolves in decreasing of cells containing lipids. Finally, we demonstrated that AA is not only involved in muscle differentiation of mesenchyme but is also involved in adipose tissue as a negative inducer. In conclusion, AA drives differentiation of ESCs toward muscle cells and osteoblast, incompetition with RA, and has a negative effect on adipogenesis and neurogenesis differentiation.

L’apoptose, ou mort cellulaire programmée, joue un rôle majeur au cours du développement embryonnaire et dans le maintien de l’homéostasie tissulaire chez l’adulte. La voie mitochondriale de l’apoptose est principalement activée par la protéine oncosuppressive p53. Le FGF1 est un facteur de croissance atypique, majoritairement intracellulaire et nucléaire qui induit la prolifération, la différenciation et la survie cellulaires. Dans les cellules PC12, le FGF1 présente des activités neurotrophique et anti-apoptotique vis-à-vis de l’apoptose dépendante de p53. De plus, il interagit avec la protéine p53. La localisation nucléaire du FGF1 semble nécessaire à ses activités intracellulaires ainsi qu’à son interaction avec p53.Au cours de ma thèse, j’ai étudié les activités neurotrophique et anti-apoptotique de différentes formes mutantes du FGF1. J’ai entrepris l’étude de l’activité intracellulaire de la forme FGF1K132E, forme mutante dont les activités extracellulaires sont inhibées. La mutation du résidu lysine 132 pourrait modifier la phosphorylation du résidu sérine 130 du FGF1, j’ai donc également étudié deux autres formes mutantes : le FGF1S130A, dont la phosphorylation est inhibée et le FGF1S130D dont la phosphorylation est mimée. Les résidus mutés (K132 et S130) sont situés dans le domaine C-terminal du FGF1.Cette étude nous a permis de montrer que la phosphorylation du FGF1 inhibe son activité anti-apoptotique mais ne modifie pas son activité neurotrophique, et que le domaine C-terminal du FGF1 est fortement impliqué dans la régulation de ses activités intracellulaires. Toutes ces formes mutantes sont capables d’être transloquées dans le noyau ce qui suggère que la localisation nucléaire du FGF1 soit nécessaire mais insuffisante pour ses activités intracellulaires. Par ailleurs, p53 peut interagir avec le FGF1WT et certaines formes mutantes, toutefois cette interaction n’est pas strictement corrélée à l’activité anti-apoptotique du FGF1, ce qui suggère l’existence d’autres régulations nucléaires qui restent à caractériser.Mes travaux ont permis pour la première fois de mettre en évidence le rôle de la phosphorylation du FGF1 et de son domaine C-terminal dans la régulation de ses activités intracellulaires. La poursuite de cette étude permettra de mieux caractériser le rôle nucléaire de ce facteur de croissance et de caractériser ses éventuelles interactions avec des protéines nucléaires comme p53 / Apoptosis, a form of programmed cell death, is required for embryonic development and tissue homeostasis. The mitochondrial pathway of apoptosis is mainly induced by p53, an oncosuppressor that acts as a transcription factor. FGF1 is one of the two prototypic members of the FGF family. Contrarily to most FGFs, FGF1 lacks a secretion peptide signal and acts mainly in an intracellular and nuclear manner. Intracellular FGF1 induces cell proliferation, differentiation and survival. In PC12 cells, FGF1 inhibits p53-induced apoptosis and interacts with p53. FGF1 nuclear localization seems to be required for its intracellular activities and its interaction with p53.To better characterize the FGF1 intracellular pathway, we studied neurotrophic and anti-apoptotic activities of several mutant forms of FGF1: the FGF1K132E that could affect FGF1 phosphorylation, and two phosphorylation-site mutant forms, i.e. the FGF1S130A (preventing phosphorylation) and the FGF1S130D (mimicking phosphorylation). All these mutations are localized in the C-terminal domain of FGF1. This study showed that phosphorylation inhibits FGF1 anti-apoptotic activity but not its neurotrophic activity in PC12 cells and that the FGF1 C-terminal domain is strongly involved in the regulation of its intracellular activities. Despite their different activities, all mutant forms are localized both in the cytosol and the nucleus. Therefore, nuclear localization is required but insufficient for FGF1 to display its intracellular activities.Besides, p53 can interact with wild-type and some of the mutant forms of FGF1. This interaction does not strictly correlate with FGF1 anti-apoptotic activity. Thus, the nuclear mechanisms regulating FGF1 intracellular activities remain to be characterized.Our study highlights for the first time the role of the phosphorylation and the C-terminal domain of FGF1 on the regulation of its intracellular activities. This work must continue on to further characterize FGF1 nuclear activities and its interactions with nuclear proteins such as p53

La LMMC est une hémopathie est caractérisée par une monocytose persistante (>1.10^9/L) ainsi que par la présence anormale de granulocytes immatures dans le sang des patients. Actuellement, il n’existe aucun traitement ciblé, il est donc essentiel de mieux caractériser et de comprendre les mécanismes qui causent cette monocytose afin d’établir de nouvelles stratégies thérapeutiques et de proposer des traitements ciblés. A partir de monocytes primaires humain stimulés par du CSF-1, nous avons observé que l’autophagie, est induite et qu’elle est dépendante des protéines Beclin1, ATG5, ATG7 et ULK1. Cette autophagie est également nécessaire à la différenciation macrophagique. Nous avons déterminé que l’AMP kinase (AMPK), est nécessaire à l’induction de l’autophagie et par conséquent à la différenciation macrophagique. Nous avons également découvert que le récepteur purinergique P2RY6 via la stimulation du CSF-1R active l’axe PLCβ3-CaMKKβ-AMPK-ULK1 conduisant à l’induction de l’autophagie nécessaire à la différenciation macrophagique. Enfin, dans le cadre de la LMMC, où la différenciation macrophagique est altérée, nous avons confirmé que la présence de granulocytes immatures est responsable de l’inhibition de l’axe P2RY6-AMPK. Dans ce contexte, nous avons observé que l’ajout d’agonistes du P2RY6 est capable d’une part de réinduire l’expression de l’AMPK et d’autre part de restaurer la différenciation macrophagique. L’ensemble de ces résultats souligne l’importance de l’induction du processus autophagique au cours de la différenciation macrophagique des monocytes mais également désigne l’axe P2RY6-AMPK comme cible thérapeutique potentielle dans le traitement de la LMMC. / CMML is a hematologic malignancy characterized by a persistent monocytosis (> 1.10^9/ L) and an abnormal presence of immature granulocytes in the blood of patients. Currently, there is no targeted therapy for this disease, so there is a real need to better understand the mechanisms leading to monocytosis in order to establish new therapeutic strategies and propose targeted treatments for CMML patients. From primary human monocytes, stimulated by CSF-1 to induce their differentiation into macrophages, we found that autophagy is induced during this process and is required for proper macrophagic differentiation. Then we were able to show that AMPK kinase (AMPK) is required for the induction of autophagy and therefore macrophage differentiation. We also found that the P2RY6 purinergic receptor via the CSF-1R stimulation, activate the PLCβ3-CaMKKβ-AMPK-ULK1 axis leading to the induction of autophagy, which is necessary for the macrophagic differentiation. Finally, in CMML context, where the macrophagic differentiation is impaired, we confirmed that the presence of immature granulocytes is responsible for the inhibition of AMPK P2RY6-axis. In this context, we observed that the addition of agonists P2RY6 is first capable of re-inducing the expression of AMPK and then restoring the macrophagic differentiation. All of these results emphasize the importance of autophagy induction during macrophage differentiation of monocytes and highlight the P2RY6 AMPK-axis as a potential therapeutic target in the treatment of CMML.

Le tissu osseux est en perpétuel renouvellement (processus désigné remodelage osseux) qui se caractérise par la dégradation (résorption) du tissu osseux par les ostéoclastes et la formation d'un nouveau tissu osseux par les ostéoblastes. L'équilibre entre ces deux processus permet le maintien et le renouvellement permanent de la matrice osseuse. Dans bien des cas où l'équilibre est perdu, il y a apparition d'ostéoporose (littéralement: la maladie des os poreux) qui est caractérisée par une masse osseuse réduite due à une dégradation osseuse supérieure à la fonnation osseuse, une fragilité osseuse et une susceptibilité accrue aux fractures. L'ostéoporose affecte plus de 1,4 million de Canadiens; ainsi 25% des femmes et 13% des hommes de plus de 50 ans souffrent de cette maladie. La réduction de la qualité de vie (diminution de l'estime de soi, réduction ou perte de mobilité et d'autonomie) pour les personnes atteintes d'ostéoporose est énorme. Les coûts pour traiter l'ostéoporose et les fractures qui en résultent sont supérieurs à 1,9 milliard chaque année au Canada. Ces impacts socioéconomiques militent en faveur d'une meilleure compréhension du remodelage osseux. Parmi les facteurs de risque, une diète déficiente en magnésium (Mg2+) a été identifiée comme une condition prédisposant à une réduction graduelle de la masse osseuse et au développement de l'ostéoporose. Des études indiquent qu'une diète réduite en Mg2+ entraîne une augmentation du nombre d'ostéoclastes, une diminution du nombre d'ostéoblastes et une perte de la masse osseuse. Les mécanismes assurant l'homéostasie du Mg2+ intracellulaire ne sont pas encore parfaitement élucidés. La présente étude vise à détenniner l'importance du Mg2+ et l'implication des canaux «melastatin related transient receptor potentiel 7» (TRPM7) au niveau de la prolifération, de la migration et de la différenciation des ostéoblastes ainsi que leur capacité à synthétiser et minéraliser la matrice osseuse. Nos travaux indiquent pour la première fois que les cellules ostéoblastiques expriment les canaux TRPM7 et qu'une réduction du Mg2+ extracellulaire est associée à une diminution de l'activité des ostéoblastes (prolifération, migration, différenciation, minéralisation). De plus, nos résultats indiquent que le canal TRPM7 assure l'homéostasie du Mg2 + intracellulaire, et que son expression est augmentée dans des conditions de prolifération cellulaire induite par le "platelet-derived growth factor" (PDGF), de différenciation et en présence d'un milieu de culture réduit en Mg2+, suggérant son implication dans les fonctions des ostéoblastes. Par ailleurs, une stratégie d'interférence à l'ARN ciblant le TRPM7 des ostéoblastes diminue la prolifération ainsi que la migration basale et induite par le PDGF, en plus de réduire la capacité des ostéoblastes à se différencier et par la suite à minéraliser la matrice osseuse. En conclusion, nos résultats indiquent que les fonctions des ostéoblastes sont favorisées par la présence de concentrations adéquates de Mg2+ extracellulaire et des canaux TRPM7. Cette étude souligne l'importance du Mg2+ au niveau des fonctions des cellules ostéoblastiques et nos résultats se veulent en accord avec la diminution de la formation osseuse et le développement de l'ostéoporose associés à une diète déficiente en Mg2+. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : TRPM7, ostéoblastes, prolifération, migration, différenciation, PDGF, ostéoporose

Les maladies cardiovasculaires sont une des premières causes de mortalité dans les pays industrialisés. L'infarctus du myocarde provoque la mort d'un grand nombre de cellules cardiaques, diminuant la qualité de vie des gens qui survivent à une telle attaque. La transplantation d'un organe entier présente des limites telles que la faible quantité de donneurs et la possibilité de rejet par l'organisme du receveur. Le cœur possède une capacité de se régénérer mais le nombre de cellules souches résidentes pouvant accomplir cette tâche apparaît être insuffisant. Afin d'aider à la régénération, des approches thérapeutiques tentent l'implantation de cellules fonctionnelles dans la zone infarcie. Les cellules implantées sont, entre autres, des myoblastes squelettiques, des cellules souches embryonnaires ou adultes (cellules souches mésenchymateuses) indifférenciées, des cardiomyocytes fœtaux. Les résultats positifs parfois obtenus ont vite fait passer ces études des animaux à l'humain. La mise au point de thérapies cellulaires efficaces pour le cœur nécessite la compréhension des mécanismes moléculaires gouvernant la différenciation et la morphogénèse cardiaques, et l'habileté à manipuler ces mécanismes. Les cellules de carcinome embryonnaire P19, un modèle de cellules souches embryonnaires (ES), peuvent se différencier en cardiomyocytes lorsqu'elles sont traitées avec l'acide rétinoïque (AR) ou l'ocytocine (OT). Des cellules de muscle squelettique sont aussi générées. D'autre part, l'AR permet la différenciation de cellules ES en adipocytes et l'OT inhibe la maturation finale de pré-adipocytes. Nous avons émis l'hypothèse que l'AR et l'OT peuvent induire les cellules P19 à générer, de façon concomitante mais dans des rapports différents, des adipocytes, cardiomyocytes et cellules de muscle squelettique. De plus, des analogues de l'AR capables d'activer préférentiellement les récepteurs de l'acide rétinoïque (RAR) ou les récepteurs de rétinoïdes-X (RXR) pourraient influencer les rapports mésodermiques. Enfin, les kinases ERK1/2 et P38, des protéines-kinases activées par des mitogènes (MAPK), pourraient avoir un rôle dans la différenciation mésodermique induite par l'AR et l'OT. Des marqueurs ont servi à identifier les phénotypes cellulaires : PPARy, aP2, lipoprotéines-lipase et gouttelettes lipidiques colorables à l'huile rouge pour les adipocytes; MyoD et α-actinine sarcomérique pour les cellules de muscle squelettique; troponine I cardiaque (cTpnI), chaîne légère de la myosine cardiaque-2v et α-actinine sarcomérique pour les cardiomyocytes. La culture en agrégats de cellules P19 pendant sept jours, avec une induction à l'AR entre les jours deux (J2) et J5, suivie d'une période de maturation de 20 jours en présence d'insuline et de l'hormone thyroïdienne T3 permet d'obtenir des adipocytes. Des cellules battantes exprimant l'α-actinine sarcomérique sont aussi générées. Une importante proportion de ces cellules montre la forme allongée ou fibrillaire caractéristique de myocytes squelettiques. Une faible proportion a une forme arrondie et exprime la cTpnI, indiquant la génération de cardiomyocytes. L'induction des cellules P19 avec l'AR, à J2, a donc un effet mésodermique large. L'ajout d'OT au milieu de maturation n'augmente pas la proportion de cellules cardiaques par rapport aux cellules musculaires squelettiques ou aux adipocytes. L'AR agit principalement en se liant aux RAR et RXR. Pour activer de façon spécifique chacune de ces deux familles de récepteurs, nous avons remplacé l'AR comme agent inducteur par le LG100268, un agoniste spécifique des RXR, ou par le TTNPB, un agoniste spécifique des RAR. Le LG100268 génère des adipocytes et des myocytes aussi efficacement que l'AR. Le TTNPB est un agent adipogénique plus efficace que l'AR mais inhibe la myogenèse. Les influences mésodermiques différentes des trois agents sont associées à des actions différentes sur ERK1/2 et P38. Ainsi, l'AR et le LG100268 diminuent similairement phospho-ERK1/2 et augmentent similairement phospho-P38. Par contre, le TTNPB, le rétinoïde le plus efficace à diminuer phospho-ERK.1/2, n'a pas stimulé la phosphorylation de P38. L'inhibition pharmacologique d'ERK1/2 ou de P38 pendant le traitement des cellules avec l'AR a augmenté le rendement myogénique, et l'inhibition de P38 a, de plus, augmenté le rendement adipogénique. La voie des RXR est permissive à la fois à l'adipogenèse et à la myogenèse alors que celle des RAR n'est permissive qu'à l'adipogenèse. P38 serait un régulateur négatif de l'adipogénèse. La différenciation à base d'OT produit des cardiomyocytes et, dans une moindre mesure, des cellules de muscle squelettique. L'OT est ajouté durant les quatre jours de l'agrégation et la période de maturation est de dix jours. Les rendements myogéniques sont faibles et nous avons pensé que l'ajout d'AR à l'OT pouvait les augmenter. Lorsqu'il est ajouté dès le J0 du traitement des cellules avec l'OT (addition précoce), l'AR inhibe la myogenèse. Cette inhibition est reliée aux RAR puisqu'elle est reproduite par le TTNPB et non le LG100268. Étonnamment, l'AR ajouté au J2 du traitement avec l'OT (addition tardive) fait plus que doubler le rendement des cellules musculaires, spécialement celui des cellules de muscle squelettique. L'AR a donc un effet dual, temporellement régulé, sur l'action myogénique de l'OT. Un tel effet est aussi observé sur la phosphorylation d'ERK1/2. OT stimule cette phosphorylation, et la stimulation est fortement inhibée par l'addition précoce mais non tardive d'AR. L'inhibition pharmacologique d'ERK1/2 abolit l'action myogénique d'OT. Par contre, l'ajout d'un activateur indirect d'ERK2 à la combinaison "OT + AR tardif" augmente la phosphmylation d'ERK1/2 ainsi que le rendement en cardiomyocytes. Des niveaux de phospho-ERK1/2 sont critiques pour la myogénèse et pour les rendements respectifs en cardiomyocytes et cellules de muscle squelettique. En conclusion, les cellules P19 génèrent adipocytes, cardiomyocytes et cellules de muscle squelettique de façon concomitante lorsqu'elles sont induites avec l'AR. Dans ce processus, l'activation des RAR n'est permissive qu'à l'adipogenèse alors que celle des RXR permet l'adipogenèse et la myogenèse. L'action antimyogénique de l'activation des RAR est aussi observée en présence d'OT, cependant cette action ne se manifeste que si l'activation est faite tôt (J0). AR et OT influencent chacun la phosphorylation de MAPK et, réciproquement, leur action mésodermique est influencée par des modulateurs pharmacologiques de ces kinases. Le sens des influences peut cependant différer. Ainsi, les meilleurs rendements myogéniques ont été observés pour les traitements suivants : "AR + inhibiteur d'ERK (J2 à J5)", "AR + inhibiteur de P38 (J2 à J5)", "OT (J0 à J4) + AR (J2 à J4)", "OT + activateur d'ERK (J0 à J4) + AR (J2 à J4)". La modulation de l'activité des voies RAR, RXR et MAPK a une influence sur les rendements myogéniques et adipogéniques ainsi que sur les rendements en cardiomyocytes et en cellules de muscle squelettique. Le sens de l'influence dépend de la fenêtre temporelle de la modulation et de la présence ou non de l'OT. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Cardiomyocytes, Cellules de muscle squelettique, Adipocytes, Acide rétinoïque, Ocytocine, Rétinoïdes, MAPK, ERK, P38, PCR, Immunobuvardage, Cytofluorescence, Cytochimie

Les Bmps sont des morphogènes appartenant à la superfamille du Tgf-[beta] et sont impliqués dans plusieurs processus cellulaires tels que la prolifération, la migration, la différenciation et le maintien de l'homéostasie autant chez l'embryon que chez l'adulte. La liaison des Bmps aux récepteurs entraîne l'activation au niveau du cytoplasme de facteurs de transcription nommés les BR-Smads (Smadl, 5 et 8). Parmi les rôles attribués à la voie de signalisation des Bmps, très peu d'études ont démontré précisément quels BR-Smads médiaient ces rôles et fonctions. Une étude au sein de notre laboratoire avait préalablement caractérisé les rôles de la voie de signalisation des Bmps au niveau de l'épithélium intestinal suite à la délétion conditionnelle de Bmpr1a chez la souris. Nous avons voulu déterminer les rôles spécifiques de chaque BR-Smad au niveau de l'épithélium intestinal. Nous avons utilisé le système de délétion conditionnelle Cre/loxP afm d'effectuer la délétion individuelle de Smad1, Smad5 ou Smad8 strictement au sein des cellules épithéliales intestinales à l'aide de la Cre recombinase sous le contrôle du promoteur tronqué de la Villine . Des analyses de prolifération et de migration par incorporation de BrdU ont permis de démontrer que Smadl était impliqué dans le contrôle de la prolifération tandis que Smad5 était impliqué dans la migration des cellules épithéliales intestinales. Le marquage des différents types de cellules sécrétrices composant l'épithélium de l'intestin ont été effectués. Les résultats obtenus ont permis de démontrer que les rôles des Bmps dans la différenciation des cellules caliciformes seraient médiés par Smadl et Smad5 alors que Smadl serait le seul BR-Smad impliqué dans la différenciation des cellules de Paneth. Les défauts dans la détermination des cellules entéroendocrines observés chez les souris Bmpr1a[indice supérieur deltaCE1] n'ont pas été observés suite à la délétion individuelle de chacun des BR-Smads. Ce résultat suggère donc la présence d'une compensation entre les divers BR-Sxnads ou que les défauts de la détermination des cellules entéroendocrines nécessitent la perte de deux ou des trois BR-Smads en même temps. Nous avons également généré des modèles cellulaires stables exprimant diverses constructions de shARN contre chaque BR-Smad chez les cellules IEC-6. Les résultats obtenus in vitro confirment l'implication de Smadl dans le contrôle de la prolifération et le rôle de Smad5 dans la migration de cellules épithéliales intestinales. De plus, ces modèles cellulaires permettront l'étude plus approfondie des mécanismes impliqués dans la prolifération et la migration suite à la délétion de Smadl et Smad5 respectivement en plus de faciliter la combinaison de la perte de plusieurs BR-Smads en même temps. Les résultats obtenus démontrent que les BR-Smads ont des rôles distincts au niveau de la prolifération, de la migration et de la différenciation de l'épithélium intestinal, mais suggèrent également que les BR-Smads aient des rôles combinatoires et compensatoires entre eux dans certaines fonctions cellulaires. [symboles non conformes]

L'interférence à l'ARN (RNAi) est un mécanisme cellulaire connu pour inhiber l'expression de gènes avec une grande spécificité de séquence. Chez la levure Schizosaccharomyces pombe, ce processus induit des modifications de structure de la chromatine et implique une interaction entre un ARN naissant et un petit ARN associé au complexe du RNAi, RITS (RNA-induced Initiation of Transcriptional gene Silencing). RITS cible les régions répétées et non codantes et joue un rôle essentiel dans l'intégrité de l'hétérochromatine de ces sites génomiques. Une étude a mis en évidence la présence de la sous-unité Argonaute 1 du complexe RITS, ainsi qu'une marque de l'hétérochromatine, la méthylation de la lysine 9 de l'histone H3 (H3K9me), au niveau de la chromatine de deux gènes méiotiques, mei4 et ssm4. Ceci suggérait une nouvelle fonction du RNAi dans la différenciation sexuelle. Au cours de ma thèse, j'ai montré que la protéine de liaison à l'ARN Mmi1 (Meiotic mRNA interception protein 1), permet à RITS de s'associer spécifiquement à la chromatine et à l'ARN messager de ces gènes méiotiques. La protéine Mmi1 orchestre une répression post-transcriptionnelle de gènes méiotiques spécifiques, une activité de « silencing » essentielle au contrôle de la différenciation sexuelle. Nous avons mené une analyse de l'ensemble du transcriptome dans une souche déficiente pour Mmi1, ce qui nous a conduits à l'identification de nouveaux ARNm méiotiques ciblés directement par Mmi1 et le RNAi. Curieusement, la chromatine des gènes méiotiques correspondants ne présente pas systématiquement la marque épigénétique répressive H3K9me, ce qui suggère que le RNAi pourrait réprimer certains gènes codants seulement au niveau post-transcriptionnel. En parallèle, en combinant des techniques de génétique, de biologie moléculaire et de physiologie cellulaire, nous mettons en évidence un probable rôle direct du RNAi dans l'inhibition de la différenciation sexuelle. Nous proposons que le RNAi pourrait coopérer avec Mmi1 pour bloquer de manière efficace une partie du programme transcriptionnel méiotique durant le cycle végétatif. Cette régulation serait essentielle pour l'activation appropriée de ce programme au cours de la progression de la différenciation sexuelle. / RNA interference (RNAi) is a cellular process known for inhibiting gene expression in a sequence-specific manner. In the fission yeast Schizosaccharomyces pombe, this process induces modifications in chromatin structure and is assumed to involve an interaction between nascent transcripts and a small RNA contained in the RNAi complex, RITS (RNA-induced Initiation of Transcriptional gene Silencing). RITS targets repeated and non-coding regions, and is essential for heterochromatin integrity at these genomic sites. In one study, RITS complex subunit Argonaute 1, and a heterochromatin mark, methylation of histone H3 on lysine 9 (H3K9me), were detected on chromatin of two meiotic genes, mei4 and ssm4. This finding suggested a possible new function for RNAi in sexual differentiation. During my PhD studies, I found that a RNA-binding protein, Mmi1 (Meiotic mRNA interception protein 1), enables RITS to specifically associate with the chromatin and messenger RNAs of these meiotic genes. Mmi1 protein triggers a post-transcriptional repression of specific meiotic genes, a silencing activity essential for the control of sexual differentiation. We conducted a genome wide transcriptomic analysis from a mmi1Δ strain, and uncovered additional meiotic mRNAs that are directly targeted by both Mmi1 and RNAi. Intriguingly, chromatin of the corresponding meiotic genes does not necessarily display the repressive epigenetic mark H3K9me, suggesting that RNAi might silence some protein-coding genes only at a post-transcriptional level. In parallel, combining genetic, molecular biology and physiological techniques, we highlighted a potentially direct role for RNAi in the inhibition of sexual differentiation. We propose that RNAi cooperates with Mmi1 to efficiently block expression of the early meiotic transcriptional programme during vegetative growth. This regulation might be essential for the proper timing of activation of this programme during sexual differentiation progression.