La Memoria plantea el estudio de la biodiversidad parasitaria de los Mamíferos de vida libre que habitan el archipiélago canario. El objetivo principal ha sido contribuir al conocimiento de la helmintofauna y ectoparasitofauna en ecosistemas aislados. Estudios de esta índole son necesarios para poder establecer comparaciones con las faunas parasitarias que aparecen en otros ecosistemas insulares, de la región circummediterránea y/o macaronésica y de áreas continentales/peninsulares próximas. En la Tesis se han analizado parasitológicamente diez especies mastozoológicas pertenecientes a cuatro Órdenes diferentes: 3 Insectívoros (Atelerix algirus, Crocidura canariensis y Suncus etruscus); 1 Carnívoro (Felis catus); 2 Artiodáctilos (Ovis aries y Ammotragus lervia); y 4 Roedores (Atlantoxerus getulus, Rattus rattus, R. norvegicus y Mus musculus). En total, han formado parte del estudio 1090 hospedadores, procedentes de diferentes enclaves de cada una de las islas que conforman el archipiélago. Los helmintos y ectoparásitos hallados han sido estudiados siguiendo las técnicas de montaje tradicionales en Helmintología y Artropodología e identificados a través del microscopio óptico. Se ha realizado el análisis molecular de algunas especies que han entrañado dudas en su taxonomía. En total, el estudio de los Mamíferos silvestres de las Islas Canarias ha dado como resultado el hallazgo de 52 especies parásitas repartidas entre: 1 Trematoda, 11 Cestoda, 29 Nematoda, 2 Acanthocephala y 9 Arthropoda. En lo que se refiere a la helmintofauna de los hospedadores estudiados, esta es, estructuralmente, muy similar ha la que poseen estos mismos vertebrados en su hábitat originario continental y, como sucede en todos los ecosistemas insulares, se caracteriza por una disminución del número de especies parásitas y de sus porcentajes de infestación. Sin embargo, esta misma regla no se ha detectado en el caso de las pulgas, ya que la biodiversidad detectada en el archipiélago es cualitativamente superior a la de muchas zonas continentales. La distribución de las especies parásitas a lo largo del archipiélago se ha visto influenciada por las características climáticas y fisiográficas de las diferentes islas. La presencia de los hospedadores intermediarios adecuados, así como el papel de los hospedadores paraténicos, posiblemente han tenido también un importante papel en la distribución de los helmintos parásitos. Las diversas especies de pulgas tienden a agregarse en los hospedadores para formar comunidades organizadas mediante ciertas reglas de ensamblaje. Los resultados indican que la densidad de la población hospedadora y una elevada abundancia de pulgas hospedador-específicas, conducen a la no aleatoriedad de las comunidades de Sifonápteros sobre sus hospedadores. / The present Thesis evaluates the parasite biodiversity of free-living Mammals inhabiting the Canary archipelago. The main goal is the contribution to the knowledge of the helminth and ectoparasite fauna in isolated ecosystems. Those types of studies are required to establish comparisons with the parasite fauna present in other insular areas of the Mediterranean and Macaronesian Regions, as well as close peninsular and continental areas. A total of ten species of Mammals belonging to four different Orders were examined for the detection of parasites: 3 Insectivora (Atelerix algirus, Crocidura canariensis and Suncus etruscus); 1 Carnivora (Felis catus); 2 Artiodactyla (Ovis aries and Ammotragus lervia); and 4 Rodents (Atlantoxerus getulus, Rattus rattus, R. norvegicus and Mus musculus). In all, 1090 hosts were studied. Animals came from different habitats of each one of the Islands. Classical techniques of general Helminthology and Arthropodology were used to find, manipulate and identify the helminths and the ectoparasites. Molecular methods were used in those species which entailed some doubts in the final diagnosis. As a result of the analysis, 52 parasite species were detected, distributed in: 1 Trematoda, 11 Cestoda, 29 Nematoda, 2 Acanthocephala and 9 Arthropoda. Results shows that, structurally, the helminth biodiversity in Mammals from the Canary Islands is very similar to those fauna displayed by those vertebrates in their native continental habitats although, as it take place in all insular ecosystems, it is characterized by a decrease both in the number of species and in the prevalence of parasitization. Nevertheless, this pattern is not detected in fleas, which biodiversity in the Canary archipelago was qualitatively higher than in continental areas. In addition, the distribution of the parasite species throughout the archipelago was influenced by the climatic and physiographic characteristics of the different islands. Furthermore, the presence of suitable intermediary hosts, as well as paratenic hosts, could have an important role in the distribution of parasites. With regard to ectoparasites, fleas tend to be aggregated on hosts following certain assembly rules. Results showed that a high host population density as well as a high abundance of host-specific fleas, lead to the non-randomness of the Siphonaptera community on their hosts.

La microscopia de fuerza atómica (AFM) permite estudiar las superficies de materiales biológicos a escala nanométrica y obtener imágenes de elevada resolución de la topografía de la muestra. En este trabajo, la utilización de esta poderosa técnica ha permitido observar, caracterizar y explorar tanto la superficie celular como la estructura del biofilm que forman distintas cepas de Candida albicans, las cuales presentan mutaciones por deleción en genes que codifican por proteínas con un dominio denominado CFEM (Common in several Fungal Extracelular Membrane), que podrían estar implicadas en la formación, desarrollo y/o mantenimiento de la estructura del biofilm en C. albicans. De este modo, se han podido realizar diversos estudios en los que se ha evaluado la rugosidad de las superficies celulares y de los biofilms, parámetro que nos ayuda a caracterizar una superficie; se ha observado la formación, estructura y complejidad de los diferentes biofilms obtenidos; explorado la influencia de diferentes tipos de sustrato en la formación de biofilms y se han analizado las fuerzas de adhesión de las distintas cepas de C. albicans estudiadas ante diversos sustratos, recubiertos con una película formada por componentes de la saliva, mediante la técnica de AFM de espectroscopia de fuerza. Por otro lado, con el fin de estudiar la eficacia de distintos tipos de luz láser de gran aplicación en el tratamiento endodóntico y evaluar el efecto de la terapia fotodinámica en la eliminación de microorganismos, la microscopia de fuerza atómica ha sido de gran utilidad para analizar las lesiones producidas sobre la superficie celular de Enterococcus faecalis tratados con luz láser y terapia fotodinámica, tanto en suspensiones celulares como formando biofilms, mediante la visualización de cambios en la morfología celular y análisis de la rugosidad de superficie. Los estudios realizados aplicando la técnica de AFM han revelado como la falta de expresión de proteínas CFEM por C. albicans puede afectar a la estructura y organización del biofilm, y se ha podido evaluar la influencia positiva de distintos tipos de superficies sobre la adhesión celular. Además, los resultados obtenidos han demostrado un enfoque práctico de la técnica de AFM para examinar alteraciones sustanciales en la superficie celular de E. faecalis, tanto en suspensiones celulares como en biofilms formados por este microorganismo, inducidas después de los tratamientos con luz láser y terapia fotodinámica. El estudio llevado a cabo indica que estos tratamientos podrían ser eficaces en la eliminación de biofilms, erradicación de células persistentes y descontaminación de superficies orales. / The atomic force microscopy (AFM) allows to study several properties of biological surfaces at the nanoscale and also to obtain high resolution images of the sample’s topography. In this work, the use of this powerful technique has allowed us to observe, characterize and explore both the cell surface and biofilm structure forming of different strains of Candida albicans, in which deletion mutations occur in genes encoding proteins with a domain named CFEM (Common in several Fungal Extracellular Membrane). Thus, it was possible to perform various studies that have evaluated the surface roughness parameter, which helped us to characterize cellular and biofilm surfaces; have observed the formation, structure and complexity of the different biofilms obtained; explored the influence of different types of substrate in the formation of biofilms and analyzed the adhesion forces of different strains of C. albicans to various substrates studied by the technique of AFM Force Spectroscopy. Furthermore, in order to study the effectiveness of various types of laser lights of wide application in endodontic treatment and to evaluate the effect of photodynamic therapy in the eradication of microorganisms, atomic force microscopy has been useful for analyzing lesions produced on the cell surface of Enterococcus faecalis treated by laser lights and photodynamic therapy, both cell suspensions as biofilms, by visualizing changes in cell morphology and analysis of surface roughness. Studies using AFM revealed that the lack of CFEM protein expression by C albicans can affect the structure and organization of the biofilm, and we assessed the positive influence of different types of surfaces on cell adhesion. Moreover, the results obtained have shown a practical approach of AFM to examine substantial alterations in cell surface of E. faecalis, both cell suspensions and biofilms formed by this microorganism, induced after treatment with laser light and photodynamic therapy. The study carried out indicated that these treatments could be effective in removing biofilms, persistent cells eradication and decontamination of oral surfaces.

El riesgo de infección en cualquier ser humano depende, por un lado, de la intensidad de la exposición a microorganismos potencialmente patógenos y, por el otro, de la integridad de los mecanismos de defensa del huésped, incluidas las barreras anatómicas, la inmunidad humoral y la mediada por células. El estado de salud y la condición premórbida del paciente representan factores de riesgo adicionales al generar defectos cualitativos o cuantitativos en el funcionamiento de la respuesta inmune que pueden aumentar el riesgo de padecer diferentes tipos de infecciones. Ejemplo de ello son la diabetes mellitus o las enfermedades hepática, cardíaca o renal crónicas. Los pacientes con neoplasias son un ejemplo paradigmático, pues tienen un riesgo aumentado de infección debido a diferentes motivos: el daño a las barreras anatómicas es común después de la quimio o radioterapia o luego de procedimientos invasivos como son, por ejemplo, catéteres endovenosos o cirugías; además, la propia malignidad subyacente o las intervenciones terapéuticas inmunosupresoras (quimioterapia, corticosteroides y la radioterapia) son responsables de defectos inmunes. Por todo lo expuesto esta población de pacientes puede englobarse en el término inmunodeprimido. Los inmunodeprimidos son un problema relevante de salud, debido al aumento de su prevalencia, y también por el alto consumo de recursos que suponen. Los pacientes inmunodeprimidos tienen mayor riesgo de enfermar y, consecuentemente, de requerir ingreso en las Unidades de Cuidados Intensivos (UCI). Dos de esas poblaciones, especialmente relevantes por el aumento de su incidencia y por sus potenciales complicaciones son los pacientes hemato-oncológicos y los pacientes con infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Cada vez con mayor frecuencia observamos en nuestra actividad diaria en UCI la necesidad de asistir a estos pacientes. Los pacientes hospitalizados tienen riesgo de desarrollar infecciones nosocomiales. Estas infecciones son relevantes por su potencial gravedad y el elevado coste que generan, sobre todo en el ámbito de la UCI. Una particularidad de estas infecciones es que, con frecuencia, son debidas a microorganismos multirresistentes (MMR), ya que el ingreso a estas unidades condiciona un cambio de la microflora endógena de los pacientes, provocando colonización por gérmenes del ámbito hospitalario, con una sensibilidad a antibióticos diferente. Existe la sensación que los pacientes inmunodeprimidos críticos tienen un riesgo aumentado de presentar infecciones nosocomiales por MMR, así como de una peor evolución cuando las presentan. Sin embargo, hay pocos estudios que hayan analizado esta circunstancia. Esto resulta de interés pues serviría para elaborar guías y protocolos con la intención de determinar la mejor estrategia de uso de antibióticos, y establecer los factores potencialmente modificables para mejorar el pronóstico. Por este motivo se planteó el desarrollo de esta Tesis Doctoral. En ella se incluyen dos trabajos que tienen como principales objetivos evaluar y comparar pacientes críticos con neoplasias malignas (hematológicas y nohematológicas) con aquellos sin neoplasia en términos de adquisición de MMR, infecciones y mortalidad (Artículo 1); y evaluar y comparar pacientes críticos infectados por el VIH con aquellos sin esta infección en los mismos términos (Artículo 2). Para ello se realizó un estudio observacional, prospectivo de cohortes de pacientes ingresados en una UCI médica de ocho camas para adultos en un hospital universitario de 700 camas durante un período de 35 meses. Se obtuvieron frotis de fosas nasales, de faringe y de recto, y se recogieron cultivos de secreciones respiratorias dentro de las 48 h del ingreso y tres veces por semana a partir de entonces. Además se obtuvieron otros cultivos según se considerara necesario por el médico tratante. Se recogieron también variables clínicas cuantitativas y cualitativas que se consideraron de importancia, como factores de riesgo o pronóstico, además de las escalas de gravedad al ingreso y durante la estancia en UCI. Se utilizó un análisis de regresión logística multivariante para evaluar la mortalidad en la UCI. El protocolo del estudio fue aprobado por el Comité de Ética en Investigación Clínica del Hospital Clínic de Barcelona. Los principales resultados de ambos estudios demuestran que ambas poblaciones de pacientes críticos inmunodeprimidos (hemato-oncológicos o infectados por VIH) no parecen tener un mayor riesgo de adquisición de microorganismos resistentes o infecciones durante su estancia en UCI. Además, el pronóstico de su estancia en UCI no se relaciona con la adquisición de estos agentes patógenos o las infecciones adquiridas intra-UCI, ni tampoco con tener o no infección por VIH, sino a la gravedad de la enfermedad al ingreso y a la condición de tener una neoplasia hematológica.

Introducción: Pseudomonas aeruginosa es un patógeno oportunista que causa una gran variedad de infecciones, entre las que destacan las infecciones respiratorias agudas y crónicas y las infecciones de heridas por quemaduras. En un trabajo previo, usamos anticuerpos específicos para detectar la presencia del epítopo de fosforilcolina en la superficie bacteriana asociado al factor de elongación Tu (EF-Tu). Identificamos que el gen eftM (Elongation Factor Tu Modifying enzime) es el responsable de la incorporación de fosforilcolina a EF-Tu. Además demostramos que este epítopo es crucial para la colonización inicial del tracto respiratorio por P. aeruginosa y el desarrollo de neumonía. En esta tesis hemos investigado la contribución de la fosforilcolina en la interacción de P. aeruginosa con los queratinocitos epidérmicos humanos y en las infecciones de heridas por quemadura causadas por este patógeno. Contenido de la investigación: La proteína EF-Tu recombinante purificada de un aislado clínico y de un mutante isogénico desprovisto del gen eftM funcional fue analizada por espectrometría de masas. El análisis comparativo demostró que el producto de eftM es una metiltransferasa (EftM) que incorpora tres grupos metilo al residuo 5 de lisina de EF-Tu dando lugar a un epítopo estructuralmente igual a la fosforilcolina. Mediante la combinación de técnicas de fraccionamiento celular, microscopía electrónica e inmunología, demostramos que EftM trimetila EF-Tu en el citoplasma, el cual es posteriormente transportado a la membrana externa, dejando el residuo 5 trimetilado expuesto hacia el exterior. Los ensayos de invasión y transmigración con cultivos de queratinocitos humanos polarizados infectados con la cepa parental o el mutante en eftM demostraron que la trimetilación de EF-Tu media la migración de P. aeruginosa a través de la barrera epitelial. Esto es debido a que la cepa parental es capaz de alterar, de forma más eficiente que el mutante, la permeabilidad de la barrera epitelial mediante la reducción de la expresión de ZO-1, una proteína clave para la integridad del epitelio. Los ensayos con un antagonista del receptor del factor activador de plaquetas (PAFR) demostraron que este receptor media la interacción de P. aeruginosa con los queratinocitos a través de EF-Tu trimetilado. Sin embargo, la reducción de ZO-1 no es debida directamente a la interacción EF-Tu-PAFR, sino que está inducida por la activación, por parte de P. aeruginosa, del factor de transcripción celular NF-κB. Finalmente, los experimentos en un modelo murino de infección por quemadura demostraron que la mutación de eftM reduce notablemente la virulencia y la capacidad de diseminación de P. aeruginosa. Conclusiones: Se ha identificado el gen eftM, que codifica una nueva metiltransferasa que incorpora tres grupos metilo al residuo 5 de lisina de EF-Tu. EftM está muy conservado y ampliamente distribuido entre especies y es necesario y suficiente para metilar EF-Tu en P. aeruginosa o en otros sistemas heterólogos. EF-Tu está en la membrana externa exponiendo la región N-terminal trimetilada hacia el exterior. Dicha trimetilación facilita la invasión y transmigración bacteriana a través de queratinocitos humanos mediante la interacción con PAFR. P. aeruginosa reduce los niveles de proteína ZO-1 incrementando la permeabilidad paracelular de la barrera epitelial, proceso mediado por la activación de NF-κB. La carencia de EftM reduce la virulencia de P. aeruginosa en un modelo murino de infección de quemadura. La nueva metiltransferasa podría ser una nueva diana para el diseño de fármacos contra P. aeruginosa. / Introducció: Pseudomonas aeruginosa és un patogen oportunista que causa una gran varietat d’infeccions, entre les quals destaquen les infeccions respiratòries agudes i cròniques i les infeccions de ferides per cremada. A un treball previ, vàrem utilitzar anticossos específics per detectar la presència de l’epítop de fosforilcolina a la superfície del bacteri associat al factor d’elongació Tu (EF-Tu). Vàrem identificar que el gen eftM (Elongation Factor Tu Modifying enzime) és el responsable de la incorporació de fosforilcolina a EF-Tu. A més a més demostrarem que aquest epítop és clau per la colonització inicial del tracte respiratori per P. aeruginosa i el desenvolupament de pneumònia. En aquesta tesi hem investigat la contribució de la fosforilcolina a la interacció de P. aeruginosa amb els queratinocits epidèrmics humans i a les infeccions de ferides per cremades causades per aquest patogen. Contingut de la recerca: La proteïna EF-Tu recombinant purificada d’un aïllament clínic i d’un mutant isogènic desproveït del gen eftM funcional va ser analitzat per espectrometria de masses. L’anàlisi comparativa va demostrar que el producte de eftM és una metiltranferasa (EftM) que incorpora tres grups metil al residu 5 de lisina de EF-Tu donant lloc a un epítop estructuralment igual a la fosforilcolina. Mitjançant la combinació de tècniques de fraccionament cel·lular, microscopia electrònica i immunologia, hem demostrat que EftM trimetila EF-Tu al citoplasma, el qual és posteriorment transportat a la membrana externa, deixant el residu 5 trimetilat expossat cap a l’exterior. Els assajos d’invasió i transmigració amb cultius de queratinocits humans polaritzats infectats amb la soca parental o el mutant d’eftM demostraren que la trimetilació d’ EF-Tu facilita la migración de P. aeruginosa a través de la barrera epitelial. Això és degut al fet que la soca parental és capaç d’alterar, de forma més eficient que el mutant, la permeabilitat de la barrera epitelial mitjançant la reducció de l’expressió de ZO-1, una proteïna clau per a la integritat de l’epiteli. Els assajos amb un antagonista del receptor del factor activador de plaquetes (PAFR) demostraren que aquest receptor actua com a intermediari en la interacció de P. aeruginosa amb els queratinòcits a través d’EF-Tu trimetilat. No obstant això, la reducció de ZO-1 no és deguda directament a la interacció EF-Tu-PAFR, sino que està induïda per l’activació, per part de P. aeruginosa, del factor de transcripció cel·lular NF-κB. Finalment, els experiments a un model murí d’infecció per cremada demostraren que la mutació d’eftM redueix la virulència i la capacitat de disseminació de P. aeruginosa. Conclusions: S’ha identificat el gen eftM, que codifica una nova metiltransferasa que incorpora tres grups metil al residu 5 de lisina d’EF-Tu. EftM està molt conservat i àmpliament distribuït entre espècies i és necessari i suficient per metilar EF-Tu a P. aeruginosa o a altres sistemes heteròlegs. EF-Tu està a la membrana externa exposant la regió N-terminal trimetilada cap a l’exterior. Aquesta trimetilació facilita la invasió i transmigració bacteriana a través de queratinocits humans mitjançant la interacció amb PAFR. P. aeruginosa redueix els nivells de proteïna ZO-1, incrementant la permeabilitat paracel·lular de la barrera epitelial, procés mitjançat per l’activació de NF-κB. La mancança d´EftM redueix la virulència de P. aeruginosa a un model murí d’infecció de cremada. La nova metiltransferasa podria ser una nova diana pel disseny de fàrmacs contra P. aeruginosa. / Introduction: Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic pathogen responsible of a wide range of infections including acute and chronic respiratory infections and wound burn infections. In a previous study, we used specific antibodies to detect the presence of the phosphorylcholine epitope on the bacterial surface linked to the elongation factor Tu (EF-Tu). We identified the gene eftM (Elongation Factor Tu Modifying enzime) as the responsible of the modification of EF-Tu with phosphorylcholine. In addition, we demonstrated that this epitope is crucial for initial colonization of the respiratory tract by P. aeruginosa and for development of pneumonia. In this Thesis we have investigated the contribution of the phosphorylcholine in the interaction of P. aeruginosa with the human epidermic keratinocytes and in the burn wound infections caused by this pathogen. Research: A tandem mass spectrometry analysis was choosen to compare recombinant EF-Tu purified from a clinical isolate and from an isogenic eftM deficient mutant. Comparative analysis shown that the product of eftM, is a methyltransferase (EftM) that transfers three methyl groups to the lysine residue 5 of EF-Tu resulting in a chemical structure similar to phosphorylcholine. Through a combination of approaches, including sub-cellular fractionation, electronic microscopy and immunological techniques, we demonstrated that EftM trymethylates EF-Tu in the cytoplasm, which is subsequently transported to the outer membrane, leaving the trimethylated residue 5 exposed outwards. Invasion and transmigration experiments with cultured human polarized keratinocytes infected with the wild-type strain or the eftM mutant demonstrated that the trimethylation of EF-Tu mediates the migration of P. aeruginosa through the epithelial barrier. Accordingly, the wild-type strain increased the paracellular permeability and reduced the expression of ZO-1, a key protein for the integrity of the epithelial barrier, more efficiently than the mutant. An antagonist of the platelet activating factor receptor (PAFR) reduced the invasion and transmigration of the wild type strain but had no effect on the mutant suggesting that PAFR on the keratinocytes mediates the interaction with the modified EF-Tu. However, reduction of ZO-1 is not directly due to the interaction EF-Tu-PAFR, but is due to the activation of the transcription factor NF-κB induced by P. aeruginosa. Finally, we demonstrated the mutation of eftM impaired the virulence and the dissemination capacity of P. aeruginosa in murine model of wound burn infection. Conclusions: We have identified the gen eftM, encoding a novel methyltransferase, which links three methyl groups to the lysine residue 5 of EF-Tu. EftM is conserved and widely distributed among different species and is sufficient and necessary to methylate EF-Tu in P. aeruginosa and other heterologous systems. EF-Tu is on the outer membrane exposing the N-terminal trimethylated region outward. Trimethylation of EF-Tu promotes invasion and transmigration of the microorganisms via PAFR. Activation of NF-κB by P. aeruginosa induces the reduction of ZO-1 and increase the paracellular permeability of the epithelial barrier. Mutation of eftM reduces the virulence of P. aeruginosa in a murine model of wound burn infection. This opens up new avenues for the development of new drugs targeting this new methyltransferase.

Tesi realitzada a l'Hospital Universitari Mútua Terrassa / Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS) was identified more than 30 years ago. The challenges for the clinicians and Human Immunodeficiency Virus (HIV)-infected individuals have changed over the years. Nowadays, viral replication is suppressed with Antiretroviral Therapy (ART). ART prevents AIDS related complications and decreases morbidity and mortality in HIV-infected subjects. However, mortality rates among HIV-infected individuals remain 3-15 times higher than those observed in the general population. The excess of mortality observed among HIV-infected subjects can be partly attributed to HIV-related illnesses. However, more than half of the deaths observed among HIV-infected patients treated with ART are due to co-morbid disorders related to aging. It is nowadays considered that HIV-infected patients are aging prematurely. Multiple hypotheses have been made to explain this premature aging. Chronic systemic inflammation, reduced vascular endothelial reactivity, increased endovascular hypercoagulability and immune activation have been suggested as possible mechanisms. These processes are more prevalent in HIV-infected patients (treated and non-treated) than in the general population. Therefore, HIV-infected patients are prone to develop age-related diseases or co-morbidities. Among these co-morbidities, HIV-infected patients present increased cardiovascular risk, more prevalence of traditional cardiovascular risk factors and early onset of the atherosclerotic disease. However, the underlying mechanisms are not known yet. HIV-infection has been suggested as a potential contributor to atherosclerosis. Given the unique effects of HIV on the immune system, it is plausible to consider that HIV infection itself could be involved in atherosclerosis. The link between both may be the result of a generalized increase in the activity of the inflammatory pathways, especially the cytokine network. It is possible that these alterations in the inflammatory system may modulate the risk of atherosclerosis in HIV-infected individuals. These alterations may be caused by DNA sequence variants and/or by changes in the expression patterns of inflammatory pathway genes induced by the HIV-infection or by ART. The purpose of this study was to investigate the possible association between genetic variants and gene expression of genes involved in inflammation and cardiovascular risk measures in a cohort of HIV-infected subjects. The associations identified between genetic variants in the studied genes and CVR measures were modest. This suggests that SNPs may play a minor role and not be the underlying cause of the increased CVR observed in HIV-infected individuals. HIV-related CVD is probably influenced by non-genetic factors such as traditional CVR factors, the HIV-virus itself and by ART. The gene expression of the investigated genes is altered in HIV-related atherosclerotic disease. The findings regarding 5-LO pathway are the most relevant of this study. This part of the inflammatory pathway is important in the metabolism of lipids, which is closely related to atherosclerosis. To our knowledge this is the first study describing the implication of the 5-LO pathway in HIV-related atherosclerosis. Genetic variants in two key genes of this pathway (ALOX5 and ALOX5AP) were associated with HIV-related atherosclerosis. Although no differences were found in their gene expression, ART introduction reduced ALOX5AP gene expression levels, but not to the levels observed in uninfected controls justifying the importance of early ART initiation. Importantly, the 5-LO pathway interlinks lipid metabolism and inflammation and it is altered in HIV-infection. Thus, 5-LO pathway dysfunction may be critical in HIV-related atherosclerosis development. In summary, the findings reported in this thesis show that there is an intricate relationship among HIV-infection, antiretroviral treatment, atherosclerotic disease and the inflammatory pathway.

Several studies support the use of probiotics for the treatment of minor gastrointestinal problems in infants. Positive effects on newborn colics have been evidenced after administration of Lactobacillus strains, whereas no studies have been reported regarding the use of bifidobacteria for this purpose. This work was therefore aimed at the characterization of Bifidobacterium strains capable of inhibiting the growth of pathogens typical of the infant gastro-intestinal tract and of coliforms isolated from colic newborns. Among the 46 Bifidobacterium strains considered, 16 showed high antimicrobial activity against potential pathogens; these strains were further characterized from a taxonomic point of view, for the presence and transferability of antibiotic resistances, for citotoxic effects and adhesion to non tumorigenic gut epithelium cell lines. Moreover, their ability to stimulate gut health by increasing the metabolic activity and the immune response of epithelial cells was also studied. The examination of all these features allowed to identify 3 B. breve strains and a B. longum subsp. longum strain as potential probiotics for the treatments of enteric disorders in newborns such as infantile colics. The formulation of a synbiotic product with an appropriate prebiotic fiber capable of supporting the growth of the selected Bifidobacterium strains was also considered in this study. In this respect the ability of the 4 selected Bifidobacterium strains to use as the sole carbon source and energy source different polisaccharide fibers was investigated The last phase of the work has been dedicated to the evaluation of the gut microbial diversity in newborns whose mothers has been subjected to antibiotic therapy a few hours before the delivery because of a Streptococcus type B infection. These newborns can represent a possible target for the probiotic strains selected in this work.

El Orden Pleosporales incluye hongos dematiáceos con distribución cosmopolita y que suelen comportarse como saprofitos o parásitos de la madera y las hojas. Tienen notable repercusión agrícola debido a que causan cuantiosas pérdidas económicas por infección de cultivos, principalmente de cereales, verduras, frutales y pastos, y de plantas en general. En patología humana y veterinaria se han relacionado con afecciones que van desde colonizaciones cutáneas leves hasta infecciones diseminadas fatales, pasando por el hecho de que dentro de este orden se encuentran algunos de los hongos alergénicos más reconocidos como Alternaria y Epicoccum. La aerobiología de las conidias de Alternaria ha sido ampliamente estudiada por su gran importancia como fitopatógeno y alérgeno, no obstante, a pesar de que se ha demostrado alta homología entre algunas de sus moléculas alergénicas y factores de virulencia con las de otros géneros dentro de los Pleosporales, poco se conoce acerca de la diversidad y distribución en la atmósfera y del efecto de los factores ambientales sobre estos otros Pleosporales. Barcelona y su área metropolitana es una zona densamente poblada con un clima templado influenciado por el mediterráneo y caracterizado por veranos cálidos y secos e inviernos no muy fríos y otoños y primaveras lluviosos, condiciones consideradas óptimas para el desarrollo de la mayoría de los hongos. La prevalencia de enfermedades alérgicas en la zona es alta, y la sensibilización a alérgenos fúngicos afecta a más del 23% de la población atópica, asociándose principalmente a la frecuencia de las esporas de Alternaria en el aire. No obstante, el aporte de otros taxones filogenéticamente relacionados con Alternaria a la aerospora de Barcelona se desconoce. Con el propósito de dilucidar el comportamiento aerobiológico de los Pleosporales en Barcelona, se procedió a: 1) establecer el comportamiento estacional de las esporas de Pleosporales más frecuentemente identificadas en el aire de tres regiones en Cataluña con diferentes características ambientales (Barcelona, Bellaterra y Lleida), su dinámica a través de un periodo de 15 años y la correlación con los parámetros meteorológicos por medio del análisis retrospectivo de las bases de datos de la Xarxa Aerobiològica de Catalunya desde 1995 al 2009; 2) identificar las esporas de Pleosporales (diversidad) en el aire de la ciudad de Barcelona durante el año 2010, determinando el comportamiento horario y diario de cada taxón y el efecto de las variables meteorológicas sobre su presencia y variabilidad en la atmósfera; y 3) analizar la presencia de Pleosporales en el aire y el polvo sedimentado en ambientes intra y extradomiciliarios de las viviendas de individuos sensibilizados a Alternaria y un grupo control (no sensibilizados al hongo) en Barcelona durante las cuatro estaciones climáticas y empleando métodos para hongos viables y no viables, además de determinar los niveles del alérgeno Alt a 1 en las muestras de polvo del interior de las viviendas. El estudio retrospectivo de 15 años de monitoreo, permitió establecer que los Pleosporales mitospóricos predominaron en la aerospora de todas las zonas estudiadas, siendo Alternaria el taxón más frecuentemente observado. Las mayores concentraciones se presentaron en zonas rurales (Lleida) o semiurbanas (Bellaterra) comparadas con los ambientes urbanos (Barcelona). Los Pleosporales mitospóricos presentaron un comportamiento estacional con un incremento del nivel de las esporas asociado al aumento de la temperatura y la disminución de la humedad relativa. En contraste, los Pleosporales meiospóricos no mostraron un patrón claro, aunque si evidenciaron un comportamiento contrario a los mitospóricos, correlacionándose principalmente a periodos de humedades relativas altas. Durante el año 2010 se identificaron 32 taxones de Pleosporales, nuevamente con el predominio de los estadios mitospóricos a expensas de las conidias de Alternaria, Epicoccum y Stemphylium. Dentro de los Pleosporales meiospóricos las ascosporas de Leptosphaeria y Pleospora fueron las más representativas. Aunque el comportamiento horario no fue común entre todos los Pleosporales, se describió una tendencia a la liberación diurna (hacia el mediodía) de las esporas entre los mitospóricos y nocturna (hacia la madrugada) en los meiospóricos. Con respecto al estudio de los ambientes intra y extradomiciliarios, los hallazgos corroboran la infravaloración de los niveles de hongos cuando se emplean solamente los métodos para organismos viables ya que no permiten el crecimiento de Pleosporales meiospóricos y la cuantificación de los mitospóricos en forma de unidades formadoras de colonias (UFC) da resultados significativamente inferiores a los métodos para no viables. Adicionalmente se observó que las concentraciones fueron evidentemente mayores en el exterior que en el interior, y que eran aún superiores cuando la vivienda se ubicaba en zonas rurales que en semiurbanas. Alternaria fue también el taxón más comúnmente observado en el método viable, tanto en las muestras de aire en el interior como en las del exterior. En cuanto a las superficies, aquellas obtenidas de exteriores presentaron un mayor número de esporas o UFC por cm² y una mayor diversidad de Pleosporales que las de interiores, y estuvieron dominadas por los Pleosporales productores de macroconidias. Las esporas y UFC fueron significativamente mayores durante el verano, tanto en el aire interior como en el exterior, no obstante sobre las superficies de exterior los mayores recuentos se presentaron en invierno o en otoño. Algunas características de las viviendas, como la presencia de moquetas, la ventilación natural por ventanas abiertas y la presencia de mascotas, se correlacionaron con los niveles de algunos taxones de Pleosporales. Los hallazgos sugieren que la abundancia de los Pleosporales en la atmósfera podría representar riesgo de sensibilización para los individuos expuestos o de exacerbación de los síntomas en los ya sensibilizados a los alérgenos de Alternaria u otros Pleosporales, debido principalmente a la reactividad cruzada. Para establecer el riesgo real que supone la exposición a estos agentes, es necesario demostrar la presencia del gen que codifica para Alt a 1 y la producción de esta proteína en los géneros de Pleosporales comunes en el aire. También hay que continuar con la búsqueda de otras moléculas alergénicas determinando la prevalencia de sensibilización a estos nuevos alérgenos en la población. / Order Pleosporales includes dematiaceous fungi with cosmopolitan distribution and usually behaving as saprophytes or parasites of wood and leaves. Pleosporales have an important impact on agriculture because they cause economic losses by infecting crops (mainly cereal, vegetables, fruits and pastures), and plants in general. In human and veterinarian pathology they have been linked to a wide range of illnesses from mild skin colonization to fatal disseminated infections, and through allergy, as the most recognized allergenic fungi (Alternaria and Epicoccum) are comprised amongst of them. Aerobiology of Alternaria conidia has been intensively studied because of its huge importance as phytopathogen and allergen; however, despite high homology between some allergenic molecules and virulence factors with other Pleosporales genera has been demonstrated , little is known about the diversity and distribution in the atmosphere of these other Pleosporales and the effects that environmental factors have on them. Barcelona and its metropolitan area is a densely populated area with a mild climate influenced by the Mediterranean Sea. It is characterized by warm and dry summers and mild winters, as well as by rainy springs and falls. These conditions are considered optimal for the development of most fungi. The prevalence of allergic diseases in the area is high, and sensitization to fungal allergens affects more than 23% of the atopic population, mainly associated with the frequency of Alternaria spores in the air. However, the contribution to the aerospora of Barcelona of other taxa phylogenetically related to Alternaria is unknown. In order to elucidate the aerobiological behavior of the Pleosporales in Barcelona, this study aimed to: 1) establish the seasonal behavior of the most common Pleosporales spores identified in the air of three regions with different environmental characteristics in Catalonia (Barcelona, Bellaterra and Lleida); their dynamics in the atmosphere and correlation with meteorological parameters in a 15 years period using data from 1995 to 2009 provided by the Xarxa Aerobiològica de Catalunya , 2) identify Pleosporales spores (diversity) in the air of Barcelona year 2010, determining for each taxon the hourly and daily distribution and the effect of meteorological parameters, and 3) analyze the presence of Pleosporales spores in the air and settled dust in indoors and outdoors housing environments of people sensitized to Alternaria and a control group (not sensitized to the fungus) in Barcelona, at four moments in the year corresponding to climatic seasons, using methods for viable and non-viable fungi and also measuring the alt a 1 allergen in the indoor dust samples. The study of the 15 years dataset showed that Alternaria was the most frequent mitosporic Pleosporales taxon in the aerospora of the three studied areas. The highest concentrations occurred in the rural (Lleida) and suburban (Bellaterra) areas, while the urban environment (Barcelona) showed lower levels. Mitosporic Pleosporales presented seasonal behavior, increasing their levels with increasing temperature and decreasing relative humidity. In contrast, meiosporic Pleosporales did not show a clear pattern, and correlated mainly with periods with high relative humidity. In 2010, 32 Pleosporales taxa were identified, again with the predominance of mitosporic stages due to the abundance of Alternaria, Epicoccum and Stemphylium conidia. Within meiosporic Pleosporales, Leptosphaeria and Pleospora ascospores were the most representative. Regarding the hourly behavior, mitosporic Pleosporales showed a tendency to be released during daylight (about noon) while meiosporic Pleosporales showed a nocturnal release tendency (toward dawn). With regard to the study of indoors and outdoors environments, our results corroborated that fungi levels were underestimed not only when using measuring methods for viable organisms, which do not allow meiosporic Pleosporales growth, but also when making the quantification of colony forming units (CFU) of mitosporic taxa and comparing them with total spore counts. Additionally, it was found that the concentrations were obviously higher outdoor than indoor, and were even higher in rural than in suburban areas. Alternaria was also the most commonly observed taxon in the viable method, both in indoor and outdoor air samples. Regarding outdoor surfaces, they showed higher number of spores or CFU/cm² and higher Pleosporales diversity than indoor surfaces and were dominated by taxa producing macroconidia. Counts of Spores and CFU were significantly higher during summer, both in indoors and outdoors air, however, counts of the outdoor surfaces samples were higher in winter and autumn. Some characteristics of homes, such as presence of carpets, natural ventilation through open windows and having pets, showed correlations with the levels of some taxa Pleosporales. These findings suggest that the abundance of Pleosporales spores in the atmosphere could be a risk of sensitization to the exposed people and of exacerbation of symptoms in those already sensitized to allergens of Alternaria or other Pleosporales, mainly due to cross-reactivity. To establish the actual risk of the exposure to these particles, it is necessary to demonstrate the presence of the gene coding for Alt a 1 and the production of this protein in common Pleosporales taxa in the air. It is also important to pursue the search for other allergenic molecules and to determine the prevalence of sensitization of the population to these new allergens.

The principal aim of this research project has been the evaluation of the specific role of yeasts in ripening processes of dry-cured meat products, i.e. speck and in salami produced by adding Lactobacilli starter cultures, i.e. L. sakei, L. casei, L. fermentum, L. rhamnosus, L.sakei + S.xylosus. In particular the contribution of the predominant yeasts to the hydrolytic patterns of meat proteins has been studied both in model system and in real products. In fact, although several papers have been published on the microbial, enzymatic, aromatic and chemical characterization of dry-cured meat e.g. ham over ripening, the specific role of yeasts has been often underestimated. Therefore this research work has been focused on the following aspects: 1. Characterization of the yeasts and lactic acid bacteria in samples of speck produced by different farms and analyzed during the various production and ripening phases 2. Characterization of the superficial or internal yeasts population in salami produced with or without the use of lactobacilli as starter cultures 3. Molecular characterization of different strains of yeasts and detection of the dominant biotypes able to survive despite environmental stress factors (such as smoke, salt) 4. Study of the proteolytic profiles of speck and salami during the ripening process and comparison with the proteolytic profiles produced in meat model systems by a relevant number of yeasts isolated from speck and salami 5. Study of the proteolytic profiles of Lactobacilli starter cultures in meat model systems 6. Comparative statistical analysis of the proteolytic profiles to find possible relationships between specific bands and peptides and specific microorganisms 7. Evaluation of the aromatic characteristics of speck and salami to assess relationships among the metabolites released by the starter cultures or the dominant microflora

In the recent years, consumers became more aware and sensible in respect to environment and food safety matters. They are more and more interested in organic agriculture and markets and tend to prefer ‘organic’ products more than their traditional counterparts. To increase the quality and reduce the cost of production in organic and low-input agriculture, the 6FP-European “QLIF” project investigated the use of natural products such as bio-inoculants. They are mostly composed by arbuscular mycorrhizal fungi and other microorganisms, so-called “plant probiotic” microorganisms (PPM), because they help keeping an high yield, even under abiotic and biotic stressful conditions. Italian laws (DLgs 217, 2006) have recently included them as “special fertilizers”. This thesis focuses on the use of special fertilizers when growing tomatoes with organic methods in open field conditions, and the effects they induce on yield, quality and microbial rhizospheric communities. The primary objective was to achieve a better understanding of how plant-probiotic micro-flora management could buffer future reduction of external inputs, while keeping tomato fruit yield, quality and system sustainability. We studied microbial rhizospheric communities with statistical, molecular and histological methods. This work have demonstrated that long-lasting introduction of inoculum positively affected micorrhizal colonization and resistance against pathogens. Instead repeated introduction of compost negatively affected tomato quality, likely because it destabilized the ripening process, leading to over-ripening and increasing the amount of not-marketable product. Instead. After two years without any significant difference, the third year extreme combinations of inoculum and compost inputs (low inoculum with high amounts of compost, or vice versa) increased mycorrhizal colonization. As a result, in order to reduce production costs, we recommend using only inoculum rather than compost. Secondly, this thesis analyses how mycorrhizal colonization varies in respect to different tomato cultivars and experimental field locations. We found statistically significant differences between locations and between arbuscular colonization patterns per variety. To confirm these histological findings, we started a set of molecular experiments. The thesis discusses preliminary results and recommends their continuation and refinement to gather the complete results.

La Sindrome da Immunodeficienza Acquisita (AIDS o SIDA) causata da HIV-1 (Virus dell'Immunodeficienza umana) è caratterizzata dalla graduale compromissione del sistema immunitario del soggetto colpito. Le attuali terapie farmacologiche, purtroppo, non riescono a eliminare l'infezione a causa della comparsa di continui ceppi resistenti ai farmaci, e inoltre questi trattamenti non sono in grado di eliminare i reservoir virali latenti e permettere l'eradicazione definitiva del virus dall’organismo. E' in questo ambito che si colloca il progetto a cui ho lavorato principalmente in questi anni, cioè la creazione di una strategia per eradicare il provirus di HIV integrato nel genoma della cellula ospite. L'Integrasi di HIV-1 è un enzima che media l'integrazione del cDNA virale nel genoma della cellula ospite. La nostra idea è stata, quindi, quella di associare all'attività di legame dell'IN stessa, un'attività catalitica. A tal fine abbiamo creato una proteina chimerica costituita da un dominio DNA-binding, dato dall'Integrasi, e da un dominio con attività nucleasica fornito dall'enzima FokI. La chimera ottenuta è stata sottoposta a mutagenesi random mediante UV, ed è stata oggetto di selezione in vivo, al fine di ottenere una chimera capace di riconoscere, specificamente le LTR di HIV-1, e idrolizzare i siti di inserzione. Questo lavoro porterà a definire pertanto se l'IN di HIV può essere riprogrammata a catalizzare una nuova funzione mediante la sostituzione dell'attività del proprio dominio catalitico con quello di FokI. / The Acquired Immune Deficiency Syndrome (AIDS) caused by HIV-1 (Human Immunodeficiency Virus) is characterized by progressive impairment of the immune system and the onset of serious disease. At the moment the AIDS is treated with drugs, in particular the advent of HAART, based on a drug combination therapy, can strongly suppress viral replication and prevent progression of AIDS. But this treatment does not eradicate the HIV reservoir from the host. For this reason current efforts to improve therapy and prevention are oriented at developing a series of alternative approaches for vaccine development, improvement of HAART and eradication of the virus from the cell. The aim of our project is to develop a new strategy to eradicate the HIV provirus, for this purpose we created several chimeras between the Integrase of HIV-1 and the catalytic domain of the enzyme FokI that would recognize the LTR ends of the HIV genome and cleave them. Chimeras were subjected to random UV mutagenesis and in vivo selection to further improve their activity. This work will define if the Integrase of HIV can be reprogrammed to catalyze a new function by replacing the activity of its catalytic domain with that of FokI.