Le syndrome de Bloom (BS) est une maladie génétique rare caractérisée par une forte augmentation du taux d'échanges entre chromatides soeurs, des anomalies de ségrégation des chromosomes et une prédisposition au développement de tous types de cancers. Ce syndrome est la conséquence de mutations dans les deux copies du gène BLM, codant pour une 3'-5' ADN hélicase de type RecQ. La ou les fonctions de la protéine BLM sont encore mal définies mais les données de la littérature convergent vers un rôle de BLM dans des mécanismes de surveillance et/ou maintien de l'intégrité du génome. La protéine BLM serait impliquée dans le redémarrage de fourches de réplication bloquées pendant la phase S et serait nécessaire à la résolution de ponts anaphasiques en mitose, notamment de ponts particuliers appelées " UltraFine anaphase Bridges " (UFBs). Ces UFBs, qui relient les chromatides soeurs entre elles, ne sont pas détectables par les colorants classiques et leur présence ne peut-être révélée que par la détection des protéines PICH (Plk1-Interacting Checkpoint Helicase) ou BLM. A l'état basal, ces UFBs sont essentiellement d'origine centromérique (cUFBs).Tout l'enjeu de mon projet était de déterminer si BLM était également impliquée dans la prévention de la formation de ces cUFBs et donc si BLM jouait un rôle avant l'anaphase. Nous avons montré que BLM est recrutée aux centromères de la phase G2 jusqu'en mitose. BLM, en coopération avec la protéine PICH, est nécessaire (1) à l'organisation structurale de l'ADN centromérique, (2) à la disjonction complète des centromères, indépendamment de la voie des cohésines, suggérant une implication de ces protéines dans le processus de décaténation des centromères et (3) au recrutement de la topoisomérase IIa (Topo IIa) active aux centromères.Nos résultats révèlent ainsi une nouvelle localisation et une nouvelle fonction de la protéine BLM aux centromères et montrent pour la première fois l'implication des protéines BLM et PICH dans la décaténation centromérique avant l'anaphase. Nous proposons que BLM et PICH, par leurs activités respectives hélicase et de remodelage de la chromatine, modifient la structure des centromères pendant la pré-métaphase, rendant ainsi certaines caténations accessibles à la Topo IIa avant l'anaphase. La défaillance de ce mécanisme entraînerait la persistance de caténations centromériques non résolues avant l'anaphase. Ainsi, dans les cellules BS, la fréquence élevée de cUFBs aurait deux origines différentes : une partie correspondrait à des cUFBs formés du fait d'une décaténation défaillante des centromères avant l'anaphase, et l'autre partie correspondrait à des cUFBs " physiologiques " non résolus en anaphase. Afin de distinguer l'origine des cUFBs, nous avons appelé ceux issus de caténations non résolues avant l'anaphase les UFBs centromériques surnuméraires (SC-UFBs pour Supernumerary Centromeric UFBs).

Les nématodes à galles du genre Meloidogyne sont des parasites obligatoires des plantes. Lors de l'interaction compatible, ils induisent la formation de cellules nourricières hypertrophiées et plurinucléées leur permettant d'assurer croissance et reproduction. L'étude des mécanismes moléculaires impliqués dans la formation de ces cellules géantes a permis d'identifier une protéine associée aux microtubules, MAP65-3, essentielle à la formation de ces cellules géantes et au développement du nématode. Un des partenaires protéiques de MAP65-3 est un homologue de BUB3, membre du " Mitotic Checkpoint Complex " (MCC). Le MCC est un point de contrôle de la mitose assurant la fidélité de la ségrégation des chromosomes. Au cours de ma thèse, j'ai caractérisé chez la plante modèle Arabidopsis thaliana les homologues du MCC: BUB3.1, MAD2 et la famille multigénique composée de BUBR1, BRK1 et BUB1.2. J'ai démontré les interactions in planta entre les membres du complexe, certaines interactions ayant lieu au niveau des noyaux, voire au niveau des centromères. J'ai réalisé l'analyse fonctionnelle de ces gènes et montré qu'ils étaient exprimés dans les tissus enrichis en cellules en division comme MAP65-3. L'étude de la localisation subcellulaire des protéines a révélé une localisation cytoplasmique pour BUB3.1, BUB1.2 et MAD2, nucléaire pour BUBR1 et centromérique pour BRK1. Nous avons pu également montrer que lorsque des défauts d'attachement des microtubules du fuseau mitotique sont provoqués, BUB3.1, BUBR1 et MAD2 se relocalisent au niveau des kinétochores. L'étude de la famille BUB1/BUBR1 a révélé que l'inactivation des gènes correspondants induisait une sensibilité accrue à un traitement chimique déstabilisant les réseaux de microtubules. L'étude de la mitose chez ces mutants a révélé que BUBR1 est essentielle à la réalisation d'une mitose sans erreur chez Arabidopsis. Ce travail a ainsi permis de caractériser pour la première fois le MCC chez A. thaliana.

Th. : Göteborg : 1998. / Notes bibliogr.

Les cellules multiciliées jouent un rôle essentiel dans la propulsion des fluides physiologiques. Leur dysfonctionnement provoque des maladies chroniques. Contrairement à la plupart des cellules de mammifères qui possèdent un centrosome composé de deux centrioles, les cellules multiciliées possèdent une centaine de centrioles qui servent de base à la nucléation des cils motiles. Les mécanismes d'amplification de centrioles ou de régulation du nombre de centrioles dans ce type cellulaire étaient jusque-là inconnus. Les centrioles nouvellement formés étaient considérés comme apparaissant " de novo ". Une approche de vidéomicroscopie et de microscopie de super-résolution corrélative nous a d'abord permis de déterminer que tous les procentrioles sont générés à partir du centrosome préexistant. Nous démontrons que le centriole fils du centrosome est le site principal de nucléation de 95% de centrioles nouvellement formés dans les cellules multiciliées. Ces résultats réfutent par conséquent l'origine " de novo " des centrioles dans ce type cellulaire. Puis, nous montrons que la machinerie mitotique orchestre la progression spatio-temporelle de la dynamique centriolaire dans ces cellules post-mitotiques et en phase terminale de différentiation. L'amortissement de l'activité de Cdk1 empêche la rentrée en mitose tout en permettant la coordination du nombre de centrioles, leur croissance, et leur désengagement par des transitions phasiques nécessaires à la nucléation de cils motiles. Cette thèse aide à mieux comprendre la différentiation des cellules multiciliées, les ciliopathies, ainsi que l'amplification centriolaire pathologique associée avec le cancer et la microcéphalie. / Multiciliated mammalian cells play a crucial role in the propulsion of physiological fluids. Their dysfunction causes severe chronic diseases. In contrast to the strict centriole number control in cycling cells, multiciliated cell differentiation is marked by the production of up to several hundred centrioles, each nucleating a motile cilium. The mechanisms of centriole amplification or centriole number control in these cells were unknown and new centrioles were thought to appear de novo in the cytoplasm. First, videomicroscopy combined with correlative super-resolution and electron microscopy has enabled us to determine that all procentrioles are generated via runs of nucleation from the pre-existing progenitor cell centrosome. We show that the daughter centriole of the centrosome is the primary nucleation site for 95% of the new centrioles in multiciliated cells and thus refute the de novo hypothesis. Then, we provide evidence of an activation of the mitosis regulatory network during the centriole dynamic. With single cell live imaging and pharmacological modulation of mitosis regulators, we show that the mitosis machinery orchestrates the spatiotemporal progression of centriole amplification in terminally differentiating multiciliated cell progenitors. The fine-tuning of Cdk1 activity prevents mitosis while allowing the timely coordination of centriole number, growth, and disengagement through checkpoint-like phase transitions necessary for subsequent functional motile ciliation. This PhD provides a new paradigm for studying multiciliated cell differentiation, cilia-related diseases and pathological centriole amplification associated with cancer and microcephaly.

Les microtubules constituent l’un des réseaux du cytosquelette des cellules eucaryotes. Ils jouent un rôle central dans de multiples fonctions comme la division cellulaire, les trafics intracellulaires et la morphogenèse cellulaire. Chez les plantes supérieures, les microtubules (MTs) forment différents réseaux qui s'assemblent au cours du cycle cellulaire. Cette spécificité nécessite un recrutement régulé des complexes de nucléation des MTs à l’enveloppe nucléaire, au cortex et au niveau de MTs préexistants, qui sont des sites de nucléation caractérisés. L'équipe d’A.C. Schmit (IBMP, CNRS, Strasbourg), dans laquelle j'ai effectué mon travail de thèse, se focalise sur la caractérisation des complexes de nucléation des MTs (γ-TuRCs) et la régulation de l'assemblage du fuseau mitotique chez les plantes. Deux nouvelles protéines associées au γ-TuRC ont été mises en évidence par une interaction directe avec l'un de ses composants AtGCP3. Ces protéines, AtGIP1 et AtGIP2 (GCP3 Interacting Protein 1 et 2), sont très conservées au cours de l'évolution, mais leur fonction reste totalement inconnue. Mon travail a été consacré à la caractérisation de cette nouvelle classe de protéines dans le but de comprendre leur rôle. Nos résultats suggèrent que l'association des protéines GIPs aux γ-TuRCs participe à la régulation de leur activité et à la formation d'un fuseau mitotique robuste. Le profil de localisation des protéines GIPs au cours du cycle cellulaire et les phénotypes observés chez les mutants "perte de fonction" gip1gip2 indiquent que ces protéines interviennent dans le recrutement des γ-TuRCs, la nucléation des MTs, l’assemblage du fuseau mitotique, le déroulement du cycle cellulaire et l'organisation des méristèmes. L’étude des mécanismes de régulation de cette famille de protéines a été initiée. Nos résultats ont permis d’identifier GIP1comme un substrat de la kinase Aurora1 in vitro. Les résultats d’expérience de complémentation avec des phosphomutants GIP1 indiquent que la/les fonction(s) des GIPs pourrai(en)t être dépendante(s) de la phosphorylation par la kinase Aurora1, qui est un régulateur avéré du cycle cellulaire. L’ensemble de mes travaux a ainsi contribué à la caractérisation de nouveaux acteurs du cytosquelette microtubulaire. Une meilleure connaissance de leur réseau d'interaction (interactome) ainsi que l’étude de leur homologue humain pourraient ouvrir de nouvelles perspectives de recherche dans le contrôle de la division cellulaire et la lutte contre le cancer. / Microtubules (MTs) constitute one of the cytoskeletal networks in eukaryotic cells. They are involved in various processes such as cell division, intracellular transport and cell morphogenesis. In higher plants, MTs can be organized into dynamic structures, which undergo continual assembly and disassembly during the cell cycle. This specificity requires the recruitment of the nucleation complexes of the MTs to the nuclear envelope, to the cortex and to pre-existing MTs. The work of A. C. Schmit’s team (IBMP, CNRS, Strasbourg), in which I did my thesis, focuses on the characterization of MT nucleation complexes (γ-TuRCs) and the regulation of mitotic spindle assembly in plants. We have identified small proteins interacting with Gamma-tubulin Complex Protein 3 (GCP) and named GIP1 and GIP2 (GCP3-Interacting Proteins). The aim of these studies was to characterize this new class of proteins in order to understand their role. It shows that GIPs are conserved among eukaryotes and suggests that their association with the γ-TuRC participates in the regulation of their activity and the formation of a robust mitotic spindle. The localization of GIPs during the cell cycle and the phenotypes observed in T-DNA insertional gip1gip2 double mutants indicatethat GIPs are required for the recruitment of γ-TuRCs, MT nucleation, spindle assembly, cell cycle regulation and stem cell maintenance. Likewise, in vitro assays showed that GIP1 is a novel substrate for Aurora kinase1, which is a well known cell cycle regulator. The results of complementation experiments with GIP1 phosphomutants indicate that the phosphorylation of GIPs may be required for their function(s). Altogether, our results have contributed to the characterization of a new class of proteins involved in MT nucleation/organization and functions. The study of the interaction network (interactome) of GIPs and oftheir homologues could open new ways of research in the control of cell division and in the fight against cancer.

Orientador: Nelson Adami Andreollo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-15T23:47:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Braoios_MariaCristinaCostaResck_D.pdf: 3388857 bytes, checksum: 58550a8a6d4c3f121c9a3aa9185d24ae (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: As gastroplastias e as derivações intestinais revolucionaram o tratamento da obesidade mórbida, pela sua viabilidade e resposta sustentada. Porém, estudos experimentais, sugerem após as derivações jejunoileais um aumento do risco de câncer de cólon devido ao aumento do tamanho e da proliferação das criptas intestinais. Evidências sugerem os possíveis efeitos antioxidantes na prevenção da carcinogênese que demonstram sua capacidade de neutralizar ou eliminar os radicais livres. O ácido ascórbico participa do processo de oxirredução das células, como também é importante na biossíntese de catecolaminas. Os compostos de nitrito e nitrato são sais empregados como conservantes de alimentos, que neste contexto do aumento de população mundial e escassez de alimentos, será cada vez mais empregado. Estes sais têm ação danosa ao organismo em situações específicas, como demonstram vários experimentos. O objetivo dessa pesquisa foi analisar as alterações histopatológicas caracterizadas pelo índice de mitoses produzidas no intestino grosso de ratos Wistar submetidos à derivação jejunoileal após administração continuada de vitamina C e nitrito de sódio, em diferentes grupos. Oitenta ratos machos Wistar pesando entre 450-550g foram divididos em doze grupos, com vinte animais controles não operados (5 animais ingeriram somente água, 5 animais ingeriram somente vitamina C, 5 animais ingeriram somente nitrito de sódio e 5 animais ingeriram vitamina C+nitrito de sódio). Sessenta animais foram anestesiados e submetidos à laparotomia mediana com exposição das alças intestinais. Em vinte animais apenas manipulação intestinal foi realizada, este servindo como sham. Nos restantes (grupo denominado operado), o intestino foi seccionado a 3cm da junção duodeno-jejunal, e a derivação jejunoileal foi realizada através da anastomose látero-lateral no íleo terminal a 2cm da válvula íleo-cecal. Os animais foram acondicionados em gaiolas com cinco animais cada de acordo com a droga que receberam. Após 180 dias de observação, os animais eram pesados semanalmente, e para análise foram divididos em segmentos (S1, S2, S3, S4 e S5) correspondentes ao ceco, colon ascendente, transverso, descendente e reto. No grupo controle, observando os segmentos em comparação ao tratamento (p< .0001) e comparando a média entre todos os segmentos (p=0,0323) indica que o nitrito+vitamina C obtiveram o menor índice de mitoses em relação aos outros tratamentos. No grupo operado os segmentos S1 e S2 houve diferença estatística com o tratamento vitamina C, o qual apresentou um maior índice de mitose e melhor preservação do epitélio. No grupo sham houve diferença apenas entre tratamento (p< .0001), não havendo diferença entre segmentos (p=0,0849) e nem interação entre segmento e tratamento (p=0.7135). A principal diferença estatística ficou apenas no grupo nitrito+vitamina C entre a média dos segmentos. Concluem que, comparando todos os segmentos colônicos avaliados dos vários grupos estudados, foi observado que os animais que receberam nitrito de sódio associado à vitamina C apresentaram menor índice de mitoses. Além disso, foi verificado que a vitamina C não apresentou um efeito inibidor, estatisticamente significativo, na preservação da mucosa e no índice de mitos / Abstract: Gastroplasty and intestinal bypass revolutionized the treatment of morbid obesity, the viability and sustained response. However, experimental studies suggest following the jejunoileal bypass increased risk of colon cancer due to the increased size and proliferation of intestinal crypts. Evidence suggests the possible effects of antioxidants in the prevention of carcinogenesis that demonstrate their ability to neutralize or eliminate free radicals. The ascorbic acid redox process of the cells, it is also important in the biosynthesis of catecholamines. The compounds of nitrite and nitrate salts are used as food preservatives, which in this context of increasing world population and food shortages, will be increasingly employed. These salts have a harmful action to the body in specific situations, as demonstrated by several experiments. The aim of this study was to evaluate the histopathological changes characterized by the index of mitosis produced in the intestine of rats subjected to jejunum-ileum bypass after continuous administration of vitamin C and sodium nitrite in different groups. Eighty male Wistar rats weighing 450-550g were divided into twelve groups, with twenty non-operated control animals (5 animals ingested only water, only 5 animals ate vitamin C, only 5 animals ingested sodium nitrite and 5 animals ate vitamin C + nitrite sodium). Sixty animals were anesthetized and underwent laparotomy with exposure of the bowel. In twenty animals only intestinal manipulation was performed, this serving as a sham. In the other (called the operated group), the intestine was cut to 3 cm from the duodenum-jejunal junction, and jejunum-ileum bypass was performed through the side-to-side anastomosis in the ileum 2 cm from the ileocecal valve. The animals were placed in cages with five animals each according to the drug they received. After 180 days of observation, the animals were weighed weekly, and for analysis were divided into segments (S1, S2, S3, S4 and S5) corresponding to the cecum, ascending colon, transverse, descending and rectum. In the control group, noting the segments in comparison to treatment (p <.0001) and comparing the average of all segments (p = 0.0323) indicates that nitrite + vitamin C obtained the lowest rate of mitosis in relation to other treatments. In the group operated the segments S1 and S2 was no statistical difference in treatment vitamin C, which showed a higher rate of mitosis and better preservation of the epithelium. In the sham group only showed a difference between treatment (p <.0001), with no difference between segments (p = 0.0849) nor interaction between segment and treatment (p = 0.7135). The main difference was statistically only for the nitrite + vitamin C between the average of the segments. They conclude that, comparing all colonic segments evaluated the various groups, it was observed that the animals that received sodium nitrite plus vitamin C had a lower rate of mitosis. Furthermore, it was found that vitamin C did not show an inhibitory effect was statistically significant to the preservation of the mucosa and the index of mitos / Doutorado / Pesquisa Experimental / Doutor em Cirurgia

Des composés de type 3-arylpyrroles appelés pyakols ont montré une activité antimitotique sur des cellules tumorales murines, avec en particulier un effet sur les microtubules. Ce type d’activité biologique présentant un intérêt important en cancérologie, le travail présenté dans ce manuscrit est consacré à l’étude de ces hétérocycles. La première partie a pour objectif de développer une stratégie de synthèse permettant d’accéder efficacement au composé chef de file (pyakol I), basée sur la cyclisation d’intermédiaires α-amino-ynols catalysée par des complexes d’or. L’évaluation de l’activité biologique du pyakol I sur le cycle cellulaire et le cytosquelette de diverses lignées tumorales humaines a été réalisée. Les premiers résultats ont révélé une action originale du pyakol I sur le cytosquelette, provoquant une désorganisation du réseau de microtubules et un défaut de positionnement du fuseau mitotique. La séquence réactionnelle a ensuite été validée en l’appliquant pour la réalisation de modulations autour du motif 3-arylpyrrole ainsi que pour l’obtention de molécules marquées. La deuxième partie concerne un travail de méthodologie basée sur la réaction de cyclisation à l’or pour la synthèse de nouveaux pyrroles trifluorométhylés polysubstitués. La stratégie utilisant le trifluoroacétaldéhyde comme substrat de départ permet d’accéder à divers 3-trifluorométhylpyrroles avec de bons rendements, dans des conditions douces. / A family of 3-arylpyrroles named pyakols have shown antimitotic properties on murine cell lines, displaying in particular an effect on microtubules. Given the interest of these properties in cancerology, this work is focused on these heterocycles. The objective of the first part was to develop a synthetic strategy based on the gold-catalysed cyclisation of α-amino-ynols intermediates in order to access the lead (Pyakol I). Then, the evaluation of the biological activity of this molecule on the cell cycle and on the cytoskeleton of various human tumoral cell lines was carried out. The first results revealed an original effect on the organization of the microtubules network and the positioning of the mitotic spindle. The developed strategy was then validated by modulating the 3-arylpyrrole moiety on diverse positions, and used for the synthesis of labelled derivatives. The second part of this manuscript focused on the development of a methodology to synthesize new polysubstituted 3-trifluoromethylpyrroles, based on the gold-catalyzed cyclisation reaction. Using trifluoroacetaldehyde as building-block, various trifluoromethylated pyrroles were obtained in mild conditions with good yields.

La mitose assure la répartition égale du génome. La kinase mitotique Aurora B y joue un rôle majeur en contrôlant la fidélité de la ségrégation des chromosomes de par sa localisation aux centromères et aux microtubules, qui nécessite son ubiquitination par CUL3. Cependant, le mécanisme conduisant la forme ubiquitinée d’Aurora B sur ces structures mitotiques reste à déterminer. Dans ce contexte, j’ai pu identifier la protéine UBASH3B, qui contient un domaine de liaison à l’ubiquitine (UBD) comme un régulateur essentiel de la ségrégation chromosomique, agissant comme un récepteur de l’ubiquitine pour Aurora B. UBASH3B interagit directement avec Aurora B et cette interaction est dépendante de la modification d’Aurora B par l’ubiquitine ainsi que de CUL3. UBASH3B ne régule pas le niveau d’expression d’Aurora B. En revanche, UBASH3B se localise aux fuseaux mitotiques et est à la fois nécessaire et suffisant pour transférer Aurora B aux microtubules. De plus, la redistribution d’Aurora B des centromères vers les microtubules contrôle le déroulement et la fidélité de la ségrégation des chromosomes et donc le contenu correct du matériel génétique des cellules. Ainsi, mes résultats expliquent comment la modification par l’ubiquitine régule la localisation et la fonction d’Aurora B, reliant une voie de signalisation impliquant un récepteur à l’ubiquitine à la mitose. / Mitosis ensures equal segregation of the genome. The major mitotic kinase Aurora B controls fidelity of chromosome segregation by its localization to centromeres and microtubules, which requires CUL3-mediated ubiquitylation. However, it remains unknown how ubiquitylated Aurora B is targeted to mitotic structures. Here, I identify ubiquitin-binding domain (UBD) protein UBASH3B that critically regulates chromosome segregation, acting as ubiquitin receptor for Aurora B. UBASH3B directly binds Aurora B, and this interaction is dependent on CUL3 and on ubiquitin recognition. UBASH3B does not regulate protein levels of Aurora B. Instead, UBASH3B localizes to the mitotic spindle and is both required and sufficient to transfer Aurora B to microtubules. Moreover, redistribution of Aurora B from centromeres to microtubules controls timing and fidelity of chromosome segregation and thereby euploidy of cells. Thus, my findings explain how ubiquitin attachment regulates localization and function of Aurora B, linking receptor-mediated ubiquitin signaling to mitosis.

Mps1 est une protéine kinase à double spécificité impliquée dans le point de contrôle du fuseau mitotique et l'alignement des chromosomes. L'augmentation de l'activité de Mps1 est corrélée avec une augmentation de son niveau de phosphorylation lors de l'entrée en mitose. Cependant, les mécanismes contrôlant cette activation sont inconnus. Nous avons donc cherché à identifier les sites de phosphorylation de Mps1 afin d'étudier leur contribution à la régulation de Mps1. Par spectrométrie de masse, nous avons identifié jusqu'à 27 sites, et nous avons choisi de mutagéniser 11 d'entre eux individuellement en acides aminés non-phosphorylables (alanine), sur la base de leur conservation entre la protéine humaine et de xenope. Nous montrons que trois de ces sites de phosphorylation (S283, T697 et T707) sont essentiels pour l'activité kinase de Mps1, et pour son rôle dans le checkpoint mitotique. Deux de ces sites (T697 et T707) sont localisés dans la boucle d'activation du domaine kinase de Mps1 et sont des sites d'autophosphorylation. La phosphorylation sur le troisième site (S283) requiert une autre kinase. S283 est localisée dans le domaine non-catalytique de Mps1 qui est peu caractérisé et est impliqué dans le recrutement de Mps1 au kinétochore. Nous montrons par immunofluorescence que l'absence de phosphate sur le site S283 ne perturbe pas significativement le recrutement de Mad2 au kinétochore. Enfin, en utilisant des inhibiteurs et l'anticorps spécifique de la phosphorylation du site S283 que nous avons développé, nous montrons que le site S283 est phosphorylé en mitose par CDK, suggérant que les fonctions de Mps1 qui sont spécifiques de la mitose soient régulées par une phosphorylation dépendante des CDKs. / Mps1 is a dual-specificity protein kinase involved in the spindle assembly checkpoint and chromosome alignment. Mps1 phosphorylation state and activity increase in mitosis. However, the regulatory mechanisms underlying these observations are unknown. We therefore sought to identify Mps1 phosphorylation sites and to study their contribution to Mps1 regulation. By mass spectrometry we identified up to 27 phosphorylation sites on Mps1. We chose 11 sites that were conserved between Xenopus and human Mps1, and constructed 11 non-phosphorylatable single point mutants. We show that three phosphorylation sites (S283, T697 and T707) are essential for the kinase activity and the checkpoint signalling function of Mps1. Two of these sites (T697 and T707) are located in the activation loop of Mps1 kinase domain and are autophosphorylation sites. Phosphorylation on the third site (S283) results from the activity of an upstream kinase. S283 is located in the less characterized non-catalytic domain that is responsible for the kinetochore localization of Mps1. By immunofuorescence we show that the absence of the phosphate at S283 does not significantly perturb the kinetochore recruitment of the spindle assembly checkpoint component Mad2. Finally, using inhibitors and our developed phosphospecific antibody we demonstrate that Mps1 is phosphorylated at S283 in mitosis by cyclin-dependent kinase (Cdk), suggesting that mitosis specific functions of Mps1 kinase are regulated by Cdk-dependent phosphorylation.

La kinase Aurora A est une protéine essentielle au cycle cellulaire et plus particulièrement lors de la mitose. En effet, Aurora A est nécessaire à l'entrée en mitose et joue un rôle dans la maturation des centrosomes. Elle participe à l'assemblage du fuseau mitotique et est nécessaire à la réussite de la cytodiérèse. Elle est également nécessaire à l'égale répartition des mitochondries dans les cellules filles et joue un rôle dans l'épissage alternatif des ARNm de facteurs apoptotiques. Au-delà de ses fonctions mitotiques, plusieurs études récentes indiquent qu'Aurora A présente des fonctions supplémentaires dans les cellules en interphase. Elle est notamment essentielle au désassemblage du cil primaire et joue un rôle dans la dynamique des microtubules et la migration cellulaire. Enfin, une dérégulation de son expression, de sa stabilité et/ou de son activité perturbe le déroulement du cycle cellulaire ce qui conduit à la transformation des cellules et favorise l'apparition de cancers. Ses fonctions normales ainsi que ses fonctions lors de la carcinogenèse sont conduites à travers les nombreux partenaires protéiques qui entrent en interaction avec elle. Ils modulent son activité, sa localisation et sa stabilité. En retour Aurora A phosphoryle un bon nombre d'entre eux régulant ainsi leur activité, localisation et stabilité. Cependant, l'analyse des interactions déjà connues d'Aurora A ne permet pas d'expliquer tous les phénotypes observés lors de sa dérégulation. Afin de mieux comprendre les fonctions d'Aurora A, les mécanismes qui la régulent et mettre en évidence ses multiples rôles au sein de la cellule, j'ai construit puis analysé un interactome d'Aurora A généré à partir d'une méthode de purification d'affinité couplée à la spectrométrie de masse en tandem. J'ai identifié 477 partenaires potentiels dont 180 présentant une forte probabilité d'être des partenaires directs de la kinase. L'analyse bioinformatique approfondie de cet interactome a permis de révéler les partenaires associés à des mécanismes liés à la mitochondrie et l'épissage des ARN messagers mettant en évidence une implication potentielle d'Aurora A dans ces mécanismes. Pour valider cet interactome, j'ai choisi d'étudier plus précisément deux partenaires identifiés dans cette étude : les protéines WDR62 et CEP97. J'ai montré que ces deux partenaires co-localisent avec Aurora A et sont phosphorylés par la kinase. Ainsi, ce travail de thèse a permis de mettre en évidence un nombre important de nouveaux partenaires d'Aurora A associés à de nouvelles fonctions. L'étude de ces nouvelles fonctions liées aux mitochondries et à l'épissage des ARN, constitue deux nouveaux projets actuellement menés par des collaborateurs au sein de notre institut. / The kinase Aurora A is an essential mitotic cell cycle protein. Aurora A is necessary for mitotic entry and for the maturation and separation of centrosomes. It participates in mitotic spindle assembly and chromosome biorientation, and it is essential for the completion of cytokinesis. Furthermore, Aurora A activity is necessary for the equal distribution of mitochondria to daughter cells and, through its role in the alternative splicing of mRNA of apoptotic factors, it provides a link between cell cycle control and apoptosis. Beyond its mitotic functions, several recent studies suggest that Aurora A is also important during interphase. Notably, it influences microtubule dynamics, promotes cell migration and polarity control and is essential for primary cilia disassembly. Reflecting the fact that Aurora A is found to be up-regulated in many cancers, deregulation of Aurora A activity can result in an aberrant cell cycle, ultimately leading to malignant transformation of cells. The crucial regulation of Aurora A’s numerous functions is achieved through its interaction with several protein partners, which modulate its activity, localisation and stability. Aurora A in turn phosporylates a number of them, thus regulating their activity, localisation and stability. However, the known interactions of Aurora A cannot explain all the phenotypes that have been described of its deregulation.To better understand the functions of Aurora A, the regulation mechanisms governing it, and to expose its multiple roles in the cell, I have built and analysed an Aurora A interactome using tandem affinity purification coupled with mass spectrometry. This resulted in the identification of 477 potential interacting partners, of which, 180 were determined to have a high probability of interacting directly with the kinase.In-depth bioinformatic analysis of this interactome has revealed the associated partners to be related to mitochondria and mRNA splicing, highlighting the potential involvement of Aurora A in these mechanisms. To validate the interactome, two of the proteins identified in this study, WDR62 and CEP97, were examined in detail. Here I show that these two proteins colocalise with Aurora A, and are phosphorylated by the kinase.WDR62 is implicated in microcephaly and is deregulated in certain cancers. I have shown that Aurora A phosphorylates WDR62 during mitosis, and that this phosphorylation is necessary for its localisation to the centrosomes. CEP97 is a poorly charactarised protein of the primary cilium, abnormalities of which are associated with ciliopathies. I have shown that Aurora A phosphorylates CEP97 in vitro, and that the inhibition of Aurora A activity in vivo perturbs the localisation of CEP97 to cilia and centrosomes.This study has identified a number of new Aurora A-interacting proteins, implicating the kinase with novel functions. These functions, related to mitochondria and mRNA splicing have opened up a new area for further investigation.