Le phéochromocytome (PCC) est une tumeur neuroendocrine rare qui se développe principalement aux dépens des cellules chromaffines de la médullo-surrénale. Dans la majorité des cas, les PCCs sont caractérisés par une hypersécrétion de catécholamines responsables de divers effets délétères chez les patients dont le principal est une hypertension (phéochromocytomes symptomatiques, PS). Cependant, il existe également une forme particulière de PCCs asymptomatiques qui sécrètent des taux physiologiques de catécholamines (phéochromocytomes incidentaux, PI). Parmi les patients porteurs de PI, certains sont hypertendus (PIH) et d’autres non (PIN). Afin de mieux caractériser les différents profils sécrétoires de PCCs (PS et PI), nous avons recherché une implication potentielle des microARNs (miRNAs). Nous avons réalisé une analyse transcriptionnelle des miRNAs exprimés dans 32 échantillons de PCCs (12 PS, 12 PIN et 8 PIH). Le miRNome a été réalisé par qRT-PCR microfluidique (Taqman Low Density Array, TLDA) pour 671 miRNAs. L’analyse statistique (Limma) des données d’expression a permis d’identifier 4 miRNAs significativement sur-exprimés (hsa-miR-7-1-3p, 7-2-3p, 26a-1-3p et 550a-3p) et 3 miRNAs sous-exprimés (497-3p, 32-5p, 190b-5p) dans les tumeurs PIN par rapport aux PS. Pour identifier les cibles potentielles des miRNAs, de nombreux logiciels de prédictions bioinformatiques sont disponibles en ligne mais les résultats qu’ils génèrent sont très divergents. Afin de contourner ce problème nous avons développé miRabel, un nouvel outil de prédiction des cibles potentielles des miRNAs et des fonctions biologiques qui leurs sont associées. Le principe général consiste à agréger les résultats de 3 autres algorithmes de prédiction sélectionnés pour leur complémentarité. Au final, les analyses des courbes ROC (Receiver Operating Characteristic), de la précision et du Recall ont montré que cet outil est plus efficace i) que les algorithmes qu’il agrège et ii) que d’autres logiciels de prédictions couramment utilisés tels que miRWalk, MBSTAR et TargetScan. Une analyse d'enrichissement (Modular Enrichment Analysis ou MEA, Genecodis3) des cibles prédites pour les miRNAs différentiellement exprimés a révélé qu’ils peuvent moduler significativement l’activité de quelques dizaines de voies de signalisation dont celles du cytosquelette d’actine et des SNAREs (impliquées dans le transport vésiculaire). En se basant sur l’expression des miRNAs, leurs énergies d’hybridation avec leurs cibles ainsi que leurs effets physiologiques potentiels, les ARNm des gènes PAK3, MLCP, MLCK (cytosquelette d’actine), SNAP25 et STX1A (SNAREs) ont été retenus pour la suite de l’étude. Les essais luciférases ont mis en évidence une interaction entre la totalité de l’extrémité 3’UTR des ARNm de MLCK et miR-32, STX1A et miR-550a-3p, SNAP25 et miR-7-1-3p ainsi que miR-550a-3p. Les autres interactions testées se sont révélées négatives. Les analyses par RT-qPCR ont montré une diminution significative du niveau d’ARNm de MLCK et de STX1A suite à la transfection de miR-32-5p et miR-550a-3p respectivement. Concernant SNAP25, un effet inhibiteur de miR-550a-3p / 7-1-3p est observé. Cet effet a été confirmé au niveau protéique pour STX1A et SNAP25. / Pheochromocytomas (PCC) are rare neuroendocrine tumors which arise from chromaffin cells of the adrenal medulla. In most cases, PCCs are characterized by a hypersecretion of catecholamines, which is responsible for most of deleterious effects in the patients with hypertension being the main symptom (symptomatic pheochromocytomas, SP). However, some PCCs are asymptomatic and secrete physiological levels of catecholamines (Incidental Pheochromocytomas, IP). Among patients with an IP, some are hypertensive (HIP) and other are strictly normotensive (NIP). In order to better understand the different secretory profiles of PCCs (SP and IP), we investigated the potential role of microRNAs (miRNAs) in this process. We started by identifying differentially expressed miRNAs between 12 SP, 12 NIP and 8 SP. The miRNome was done by microfluidic qRT-PCR (Taqman Low Density Array, TLDA) for 671 miRNAs. Statistical analysis (Limma) of the expression results identified 4 miRNAs significantly over-expressed (hsa-miR-7-1-3p, 7-2-3p, 26a-1-3p et 550a-3p) and 3 under-expressed (497-3p, 32-5p, 190b-5p) in NIP tumors when compared to SP. To identify potential miRNAs’ targets, numerous bioinformatic prediction methods are available but their results are quite divergent. To circumvent this issue, we developed miRabel, a new miRNAs’ targets prediction tool and their associated biological functions. MiRabel aggregated the results of 3 other prediction algorithms selected for their features complementarity. The analysis of ROC, precision and recall curves showed that this tool is more efficient i) than the aggregated prediction methods and ii) than other recent or widely used tools such as miRWalk, MBSTAR and TargetScan. A Modular Enrichment Analysis (MEA, Genecodis3) of the miRNAs’ predicted targets revealed that they could potentially regulate the activity of a few pathways of which the actin cytoskeleton and the SNAREs (involved in vesicular transport). PAK3, MLCP, MLCK (Actin cytoskeleton), SNAP25 and STX1A (SNAREs) were selected to be experimentally validated based on miRNA’s expression, hybridization energy and potential physiological impact. Experimental validations of the selected interactions are achieved by luciferase gene reporter, RT-qPCR assays and western-blots following the transfection of studied miRNAs. Luciferase assays showed a direct interaction between the whole 3’UTR of MLCK mRNA and miR-32-5p, STX1A and miR-550a-3p, SNAP25 and miR-7-1-3p as well as miR-550a-3p. The other tested interactions came out to be negative. A significant decrease of MLCK mRNA and STX1A were observed by RT-qPCR analysis after transfecting miR-32-5p and miR-550a-3p respectively. As for SNAP25, the inhibitory effect of miR550a-3p/7-1-3p could be observed. This effect was confirmed at the protein level by western-blots for STX1A and SNAP25. We then evaluated the physiological effect of miR-550a-3p/7-1-3p on the regulated secretion of PC12 rat PCC cells. This was achieved using a nano-luciferase fused to growth hormone 1 (GH1). Once stimulated (59 mM potassium and 2 mM barium), miR-550a-3p over-expression decreased the secretory capacity of PC12 cells while miR-7-1-3p could not. This project represents the first study aiming to understand the regulation of the catecholamine secretion pathway by miRNAs in the pathophysiological context of PCC patients. Eventually, the characterization of this miRNA’s network should improve patient care in the field of hypersecreting neuroendocrine tumors.

En France, l’obésité touche 15% de la population et est en perpétuelle augmentation. Elle est une cause majeure du diabète de type 2. Elle se traduit par un accroissement du nombre de cellules de stockage du gras (adipocytes) et une résistance périphérique à l’insuline. Chez des individus obèses, l’augmentation du nombre d’adipocytes est associée à une diminution de l’expression de la sortiline, protéine transmembranaire dont le clivage entraine la formation du propeptide (PE) et sa libération dans la circulation sanguine. L’analogue synthétique du PE, la spadine, est connu pour moduler l’activité du canal potassique TREK-1. Ce canal étant exprimé dans la cellule bêta pancréatique qui sécrète l’insuline, une hormone participant à la régulation du taux de glucose dans le sang, il est possible que la spadine joue un rôle dans l’homéostasie du glucose. Mes résultats confirment cette hypothèse. En effet, la spadine améliore la tolérance au glucose des souris, en favorisant la libération d’insuline. La spadine est également connue pour interagir avec sortiline, indispensable au trafic du transporteur de glucose Glut4 vers la membrane des adipocytes. Cette interaction spadine-sortiline suggère que la spadine pourrait moduler l’entrée du glucose dans les adipocytes via la sortiline. Mes résultats montrent que la spadine ne modifie pas les capacités de stockage du glucose des adipocytes. En conclusion, la spadine joue un rôle dans la sécrétion de l’insuline et dans la régulation de la glycémie, ce qui peut présenter un intérêt pharmaceutique / In France, approximately 15% of the population is obese and this number keeps rising up every year. Obesity is a major cause of diabetes, inducing an increase of the number of fat-filled cells, called the adipocytes, and a peripheral insulin resistance. This increase of the number of adipocytes is associated with a decrease of sortilin expression, a transmembrane protein which is involved in the release of a propeptide (PE) in the blood circulation. Spadin, a synthetic PE analog, is known to modulate the potassium TREK-1 channel activity. Since, this channel is expressed in pancreatic beta cells which secrete insulin, a hormone involved in blood glucose regulation, spadin may play a role in glucose homeostasis. Consistent with this hypothesis, spadin improves glucose tolerance in mice, by stimulating insulin release. Spadin is a natural peptide derived from sortilin, which is known to control the glucose transporter Glut4 trafficking to the plasma membrane of adipocytes. This suggests that spadin may regulate glucose storage in adipocytes by affecting the sortilin function. However, my results show that spadin has no effect on glucose storage. In summary, spadin is involved in insulin secretion and glucose homeostasis and may be an alternative treatment against obesity and diabetes

Titre de l'écran-titre (visionné le 29 novembre 2023) / La Maladie d'Alzheimer (MA) est une maladie neurodégénérative dévastatrice et irréversible. Un changement majeur qui précède l'agrégation et pathologie de la protéine tau déclenche par sa phosphorylation sur des région qui ne doivent pas l'être (ce qu'on appelle une hyperphosphorylation). A court terme, l'état de phosphorylation de tau devient très volatile face à certaines conditions, notamment aux changements de températures corporels durant le sommeil. En nous inspirant de cet étendu de températures circadiens, nous avons postulé l'hypothèse qu'avec le modèle expérimental des cellules neuroblastomes humaines (SH3R), les variations de températures mèneraient aux changements d'activités de kinases et phosphatases (dont les majeures protéines responsables pour contrôler les niveaux de phosphorylation de tau), ceux qui, à leur tour impacteraient le clivage et la sécrétion de tau. Le rythme circadien, sans aucun traitement, a influencé tau en augmentant sa sécrétion durant la nuit comparée à son niveau durant la journée. En exposant les cellules à une température hypothermique légère (35°C), nous avons remarqué une hyperphosphorylation de tau, ainsi qu'une baisse de sa sécrétion. L'opposé a été observé face à une hyperthermie légère (38°). Par la suite, nous avons investigué si ces observations proviennent des changements sur la kinase (GSK-3B) et le phosphatase (PP2AC). En inhibant PP2AC (l'okadaïque acide et le LB100), et GSK-3B (AR-A014418), nous avons sélectionné les doses et temps de traitement optimaux. Ainsi, AR a réussi à empêcher l'hyperphosphorylation de tau induit par l'hypothermie. Le clivage de tau n'a par contre pas démontré un impact suffisamment causal entre les niveaux de phosphorylation et sécrétion dans les conditions testées. Des manipulations complémentaires avec les cellules et chez la souris soumis aux inhibiteurs et les modulations de température nous aideraient à comprendre davantage sur les indications précoces qui risquent traduire à des cascades pathologiques de tau durant les étapes neurodégénératives de la MA. / Alzheimer's Disease (AD) is a devastating and irreversible neurodegenerative disease that affects many cognitive faculties. A major hallmark of initial aggregation and pathogenetic stages of the tau protein at risk of developing into AD pathology is identified by its phosphorylation on certain regions of its sequence where it does not belong (termed as hyperphosphorylation). The phosphorylation state on tau transiently becomes very volatile against certain conditions including core temperature changes in the sleep-wake cycle. Based on this scale of circadian temperature variations, we hypothesized that using human neuroblastoma cells (SH3R) subjected to temperature modulations would induce changes in intracellular kinase and phosphatases (known as major proteins controlling tau phosphorylation), thus impacting tau cleavage and secretion. We observed that the circadian rhythm by itself induced a heightened level of tau secretion during the night compared to that during the daytime. Treating the cells to a mild hypothermic temperature (35°C) induced tau hyperphosphorylation, as well as reduced secretion levels. Conversely, the opposite was observed under mild hyperthermic temperature (38°C). We then assessed whether these changes were performed by the major tau kinase (GSK-3B) and phosphatase (PP2AC). We performed preliminary experiments on their inhibitors (AR-A014418 for kinase, okadaic acid and LB100 for phosphatase), which were required to then examine tau status under the same temperature modulations as above. Thus far, AR inhibitor successfully reduced the expected hypothermia-induced hyperphosphorylation. However, tau cleavage was not observed as a mediating stage between tau phosphorylation and secretion activities under the tested conditions. Complementary experiments with cells and mice are needed to assess tau phosphorylation, cleavage and secretion changes under the same temperature modulations and the remaining inhibitors mentioned to obtain a more comprehensive profile on early tau changes which risk cascading into its pathology in the brain and lead to neurodegenerative stages of AD.

Le virus de l'immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1), agent causal du syndrome d'immunodéficience humaine (SIDA), est rapidement devenu pandémique suite à son identification en 1981. Les données statistiques publiées par l'Organisation des Nations Unies pour le Syndrome d'Immunodéficience Acquise (ONUSIDA) démontrent que, parmi les 34,3 à 41,4 millions de cas d'infection recensés en 2014, près de 70 % d'entre eux ont été répertoriés en Afrique subsaharienne et environ 6,5 % en Europe et en Amérique du Nord. L'Agence de la santé publique du Canada estimait, quant à elle, à près de 75 500 le nombre de personnes vivant avec le VIH-1 sur son territoire en 2014, dont environ 18 000 résidant au Québec. Malgré l'avènement de trithérapies contrôlant l'infection, à ce jour, aucune médicamentation n'en permet la guérison. La complexité de la pathogenèse virale menant à l'établissement d'une infection latente et à des comorbidités associées à l'état d'inflammation chronique est si considérable qu'aucun traitement ne peut encore enrayer la maladie. La recherche fondamentale et translationnelle, permettant de mieux comprendre le fonctionnement du système immunitaire en réponse à l'infection et d'associer plus efficacement ces avancées faites en laboratoire à la pratique médicale, sont donc primordiales. Les résultats présentés dans cette thèse abondent dans ce sens, puisqu'ils mènent à une meilleure compréhension du rôle que peut avoir le microbiote sur la susceptibilité à l'infection au VIH-1 des lymphocytes T CD4+ primaires, ce qui pourrait inspirer l'élaboration de composés médicamenteux limitant le dialogue entre les bactéries et les cellules permissives au virus. En effet, l'infection au VIH-1 peut être associée à un désordre du tractus gastro-intestinal menant à une translocation de bactéries de la lumière intestinale vers les muqueuses avoisinantes. Cette migration bactérienne semble influencer la susceptibilité à l'infection des lymphocytes T CD4+, mais encore aujourd'hui, tous les mécanismes ne sont pas parfaitement connus. Les deux études présentées dans ce manuscrit contribuent donc à l'avancement des connaissances dans le domaine puisqu'elles démontrent que 1) l'engagement du TLR2 semble entraîner la production de virus par les lymphocytes T CD4+ activés en favorisant l'activité de NF-B et la réplication virale chez les cellules CCR6+ et que 2) la sécrétion d'acétate (petit acide gras produit par la fermentation de composés non digestibles par les bactéries du tractus gastro-intestinal) semble promouvoir l'activation cellulaire et la diminution de l'activité des HDAC de classe 1 et 2 de sorte à accentuer l'intégration de l'ADN proviral dans le génome des lymphocytes T CD4+.

Xanthomonas albilineans est l'agent causal de l'échaudure des feuilles de la canne à sucre. Peu d'éléments sont connus sur les bases moléculaires de l'invasion du xylème de la canne à sucre par cette bactérie. Nous manquons également d'informations sur l'écologie de X. albilineans qui, dans certaines zones de culture et dans des conditions climatiques particulières, est capable d'infecter la canne à sucre par voie aérienne. La découverte récente dans le génome de X. albilineans de clusters de gènes spécifiques à cette espèce ouvre de nouvelles perspectives. Bien qu'aucune association de X. albilineans avec un hôte animal n'ait été décrite à ce jour, cette bactérie possède un système de sécrétion de type III SPI-1 (Salmonella Pathogenicity Island-1). Nous avons montré que ce système n'est pas indispensable à la multiplication de X. albilineans in planta. Des analyses de phylogénie, de recombinaison et de sélection de ce système au sein de souches représentatives de la diversité de X. albilineans permettent de proposer de nouvelles hypothèses sur l'écologie de cette bactérie. X. albilineans possède aussi plusieurs clusters de gènes NRPS (NonRibosomal Peptide Synthetase), dont l'un est impliqué dans la biosynthèse de l'albicidine, une phytotoxine responsable de l'apparition de symptômes foliaires. Des analyses in silico ont permis de montrer que les autres clusters de gènes NRPS de X. albilineans sont impliqués dans la biosynthèse et la sécrétion de nouvelles petites molécules. Le rôle de ces molécules reste inconnu mais, d'après l'analyse fonctionnelle des NRPS de X. albilineans, au moins une de ces molécules influence la multiplication de la bactérie in planta. / Xanthomonas albilineans is a systemic, xylem-invading pathogen that causes leaf scald disease of sugarcane. Very little is currently known about the molecular bases of the invasion of the sugarcane xylem by this bacterium. Information is also lacking on the ecology of X. albilineans which is able, in certain geographical locations and under certain climate conditions, to infect sugarcane after aerial transmission. The recent discovery in the genome of X. albilineans of gene clusters specific to this species offers new research perspectives. X. albilineans, which is not known to be animal-associated, possesses a type III secretion system (T3SS) belonging to the SPI-1 (Salmonella Pathogenicity Island-1) injectisome family. Functional analyses confirmed that this system is not required by X. albilineans to spread within xylem vessels and to cause disease symptoms. Based on phylogenetic, recombination and selection analyses of T3SS SPI-1 sequences from strains spanning the genetic diversity of X. albilineans, new hypotheses were proposed regarding the ecology of this bacterium. X. albilineans possesses also several NRPS (NonRibosomal Peptide Synthetase) gene clusters, including a gene cluster which was previously shown to be involved in the biosynthesis of albicidin, a phytotoxin causing foliar symptoms. In silico analyses indicated that other NRPS gene clusters of X. albilineans are involved in biosynthesis and secretion of new small molecules with unknown function. However, functional analyses of NRPSs showed that at least one these new small molecules influence the spreading of X. albilineans in planta.

Introduction : La Fibrose Kystique (FK) est la maladie autosomique récessive la plus fréquente chez les Caucasiens et est due à une mutation du gène Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator (CFTR), codant pour un canal chlore. La principale mutation est la délétion de l'acide aminé phénylalanine en position 508. En raison de l’augmentation de l'espérance de vie, de nouvelles complications telles que le diabète associé à la FK (DAFK) ont vu le jour. Le DAFK semble principalement dû à un défaut de sécrétion d'insuline. Des études ont montré que les femmes et les personnes homozygotes ΔF508 ont un risque plus élevé de développer le DAFK. Objectifs : Comparer la sécrétion d'insuline entre les hommes et les femmes FK selon leur génotype CFTR. Notre hypothèse était que les femmes FK présentaient une sécrétion d'insuline moins élevée que des hommes. Méthodes : Deux cents sujets adultes sans diabète connu ont été recrutés dans la clinique de FK du CHUM et inclus dans cette étude. Cent seize ont été revus après un suivi de 24 ± 10 mois. Leur génotype CFTR a été extrait à partir des dossiers médicaux. Tous les sujets ont subi une hyperglycémie provoquée par voie orale de 2-h (HGPO) afin de déterminer leur tolérance au glucose : normale (NGT), intolérance (IGT) ou DAFK. Des échantillons de sang ont été prélevés aux temps 0, 30, 60, 90, et 120 min de l’HGPO. À partir de ces derniers, la sécrétion d'insuline et la sensibilité à l’insuline des sujets ont été évaluées en utilisant les indices de Stumvoll et les aires sous la courbe de l’insuline durant l’HGPO. Résultats : Pour une excursion glycémique comparable, il y avait des différences significatives dans les concentrations d'insuline entre les hommes et les femmes et selon le génotype CFTR. Ainsi, les femmes et les sujets hétérozygotes avaient des concentrations d’insuline plus élevées que les hommes et les sujets homozygotes. Cela restait significatif quelle que soit leur tolérance au glucose. Le calcul du disposition index représentant la sécrétion d'insuline ajustée pour le degré de sensibilité à l’insuline a suggéré une sécrétion d'insuline plus élevée chez les femmes que les hommes. Le suivi prospectif nous a permis de déterminer que cette sécrétion plus élevée d’insuline était associée à une évolution plus favorable pour la tolérance au glucose. Fait intéressant, cette constatation n'était vraie que pour les femmes. Conclusion : Dans une vaste cohorte prospective observationnelle de patients FK sans diabète connu, nous avons démontré qu’en dépit d’un âge et d’une fonction pulmonaire semblables, les femmes présentaient une sécrétion d'insuline supérieure à celle des hommes et que cela pourrait avoir un effet protecteur, à court terme, chez celles-ci pour le développement du DAFK. / Introduction: Cystic Fibrosis (CF) is the most common autosomal recessive disease among Caucasians and is caused by a mutation in the gene encoding for a chloride channel, the Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator (CFTR) gene. The main change is the deletion of the phenylalanine amino acid at position 508. Due to increasing life expectancy, new complications such as CF related diabetes (CFRD) have emerged. CFRD seems mainly due to a defect in insulin secretion. Studies have shown that women and people with homozygous ΔF508 have a higher risk of developing CFRD. Objectives: To compare insulin secretion between men and women according to their CFTR genotype. Our hypothesis was that, in CF, women had a lower insulin secretion than men. Methods: Two hundred adult subjects without known diabetes were recruited from the CF clinic at the CHUM and included in this study. One hundred and sixteen were reviewed after a follow-up of 24 ± 10 months. Their CFTR genotype was extracted from medical records. All subjects underwent a 2-h oral glucose tolerance test (OGTT) to determine their glucose tolerance: normal (NGT), intolerance (IGT) or CFRD. Blood samples were collected at 0, 30, 60, 90, and 120 min of the OGTT. Insulin secretion and insulin sensitivity were evaluated using the Stumvoll indices and the area under the curve (AUC) of insulin during the OGTT. Results: For a similar glycemic excursion, there were significant gender differences in insulin concentrations and according to the CFTR genotype. Thus, women and heterozygous subjects had insulin concentrations higher than men and homozygous. This remained significant regardless of their glucose tolerance. The calculation of the disposition index, representing insulin secretion adjusted for the degree of insulin sensitivity, suggested a higher insulin secretion in women than in men. Prospective follow-up showed that higher insulin secretion was associated with more favorable evolution of glucose tolerance. Interestingly, this finding was only applicable for women. Conclusion: In a large prospective observational cohort of CF patients without known diabetes, we demonstrated that, despite similar age and pulmonary function, women had a higher insulin secretion than men and that this could have a protective effect for the development of CFRD.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Legionella pneumophila est une bactérie gram/négative de l'environnement qui infecte et se multiplie au sein des protozoaires aquatiques, comme les amibes. Elle peut également infecter les macrophages pulmonaires humains, causant une forme sévère de pneumonie appelée légionellose (ou maladie du légionnaire). L'importance du Système de Sécrétion de Type IV (SST4) Icm/Dot est clairement démontrée, de même que celle du Système de Sécrétion de Type II (SST2) Lsp. Des études bioinformatiques ont suggéré l'existence d'un Système de Sécrétion de Type I (SST1), mais aucune étude n'a à ce jour démontré sa fonctionnalité, ni même un éventuel rôle dans la virulence. Ce travail consiste à étudier la fonctionnalité et le rôle dans la virulence d'un SST1 potentiel de L. pneumophila. La fonctionnalité de pompes d'efflux potentielles, possédant une structure très proche d'un SST1, est également investiguée. Des mutants de L. pneumophila invalidés pour les gènes codant pour ce SST1 potentiel (lssB, lssD et tolC) ont été construits : ils possèdent une virulence fortement atténuée vis-à-vis de plusieurs types de cellules hôtes. L'entrée dans la cellule est affectée chez ces mutants, bien que le reste du cycle intracellulaire ne soit pas altéré. La fonctionnalité de ce SST1 a été démontrée par la sécrétion de protéines hybrides entre un rapporteur et la protéine RtxA, qui fait partie de la famille des protéines RTX (Repeat/in ToXins), classiquement sécrétées par des SST1. Enfin, la fonctionnalité de plusieurs pompes d'efflux potentielles a été démontrée : des composés toxiques expulsés par ces pompes ont été identifiés, ainsi qu'une pompe majeure (HelA/HelB/HelC). D'autres analyses sont en cours pour caractériser plus précisément l'importance de ces pompes d'efflux / Legionella pneumophila is a gram/negative pathogen that infects and survives within protozoans, such as amoebas. It can also infect human lung macrophages, causing a disease called Legionnaire’s disease. The Type IV Secretion System Icm/Dot is known to be involved in the virulence of L. pneumophila, as well as the Type II Secretion System Lsp. Bioinformatics studies suggested the presence of a Type I Secretion System (T1SS), but its functionality and importance have not been demonstrated to date. This work aims to study the functionality and the implication in the virulence of the putative T1SS of L. pneumophila. Investigation efforts also concerned putative efflux pumps, which share high similarity with T1SS. Mutant strains of L. pneumophila were constructed by deletion of genes encoding the T1SS (lssB, lssD and tolC): they are defective for the entry into the host cells. The creation of the Legionella replicative vacuole is not altered though. Then the functionality of the LssB/LssD/TolC T1SS was demonstrated in a heterologous host: the reconstructed T1SS allows the secretion of hybrid proteins created by fusing a reporter with parts of the RTX protein RtxA. Finally, the functionality of several putative efflux pumps was also demonstrated: several substrates were identified for those efflux pumps, as well as a major pump (HelA/HalB/HelC). Investigations are currently made to decipher the importance of such efflux systems

Chlamydia trachomatis est une bactérie intracellulaire obligatoire. Ce pathogène de l’Homme est la première cause infectieuse de cécité ainsi que de maladies sexuellement transmissible d’origine bacterienne.Utilisant une souche de C. trachomatis L2 exprimant une protéine fluorescente, nous avons développé des méthodes de microscopie et de cytométrie en flux permettant de suivre les différentes étapes du développement de la bactérie. Ces méthodes faciliteront les futures études de l’infection par Chlamydia.Chlamydia interagit avec différents processus cellulaires, et plus particulièrement via la sécrétion d’effecteurs par le système de sécrétion de type 3 (ST3). Nous avons identifié une famille de protéines possédant un signal de ST3 qui partagent un domaine, le DUF582, présent uniquement chez les Chlamydia pathogènes.Nous avons montré que les 5 protéines DUF582 de C. trachomatis sont exprimées à partir du milieu du cycle infectieux. Nous avons démontré que la protéine Hrs interagit avec le DUF582 et que la protéine DUF582 CT619 interagit avec Tsg101. Hrs et Tsg101 sont d’importants composants de la machinerie ESCRT impliquée dans de nombreux processus de fission membranaire.Utilisant l’interférence ARN, nous avons montré que Hrs et Tsg101 ne sont requis ni pour l’entrée, ni pour le développement de la bactérie. Ceci suggère que les protéines DUF582 bloquent des processus dépendant de Hrs/Tsg101. A l’inverse, la bactérie pourrait utiliser la machinerie ESCRT mais l’existence de mécanismes redondants expliquerait l’absence de phénotype dans les expériences d’interférence. Nous discutons trois hypothèses concernant le rôle des protéines DUF582 dans l’infection. / Chlamydia trachomatis is an obligate intracellular human pathogen. It is the first infectious cause of blindness and the most common cause of sexually transmitted diseases of bacterial origin. Using a strain of C. trachomatis serovar L2 expressing a fluorescent protein we developed microscopy and flow cytometry based methods to quantify several steps of its developmental cycle. These methods will facilitate future studies aimed at testing anti-bacterial compounds or various culture conditions. Chlamydiae interfere with many cellular processes, in particular via the secretion of bacterial proteins through a type 3 secretion (T3S) system. We identified a family of proteins that possess T3S signals. They share a domain designated as DUF582, which is only found in pathogenic chlamydiae. We showed that the five DUF582 proteins of C. trachomatis are expressed from the mid phase of infection. We demonstrated that the protein Hrs is a common interactor for the DUF582. In addition the N-terminal part of the DUF582 protein CT619 interacts with Tsg101. Hrs and Tsg101 are both important components of the ESCRT machinery, which is an ancient machinery required for several processes involving membrane fission.Using RNA interference we showed that Hrs and Tsg101 are dispensable for bacterial entry and growth. This last result suggest that DUF582 proteins actually prevent Hrs and/or Tsg101 driven processes. Alternatively, the bacteria might highjack the ESCRT machinery but redundant mechanisms would explain the absence of phenotype on bacterial development observed in the silencing experiments. We discuss three hypotheses as to the possible role of the DUF582 proteins in infection.

La protéine kinase dépendante de l’ADN (DNA-PK) est une sérine-thréonine kinase qui est un élément essentiel dans la voie de réparation de l’ADN endommagé par recombinaison non-homologue (non-homologous end-joining; NHEJ). DNA-PK est également impliquée dans de nombreux processus cellulaires autre que la réparation de l'ADN. Plusieurs travaux ont montré que les protéines impliquées dans la réparation des dommages de l'ADN tels que BRCA-1, MRN-11, PARP-1 et également de DNA-PK jouent un rôle important dans la métastase du cancer. Dans ce travail, nous nous sommes concentrées sur le rôle de DNA-PK dans les métastases du mélanome. Dans un premier temps, en utilisant les molécules Dbait 32Hc comme un moyen d'activer DNA-PK dans le noyau et le cytoplasme, nous avons identifié plusieurs nouvelles cibles cytoplasmiques de DNA-PK, dont la vimentine. Nous avons montré que DNA-PK phosphoryle la vimentine sur Ser459 et que cette forme phosphorylée est la plupart du temps située au niveau des protrusion cellulaires des cellules migratrices. Nous avons ensuite démontré que la vimentine-Ser459-P induite par le traitement de Dbait32Hc participe à l'inhibition de l'adhésion et la migration cellulaire. Ainsi, cette approche a conduit à l'identification de nouvelles cibles cytoplasmiques de DNA-PK et a révélé un lien entre la signalisation des dommages de l'ADN et le cytosquelette. Ensuite, nous avons montré que DNA-PK joue un rôle important dans la migration et invasion cellules en régulant la sécrétion des facteurs associés à la métastase. Nous avons montré que l'absence ou l’inhibition de DNA-PK conduit à une régulation négative des facteurs pro-métastatique sécrétés et à la régulation positive de facteurs anti-métastatiques sécrétés tels que les inhibiteurs des métalloprotéinases matricielles. Nous avons confirmé le rôle de DNA-PK in vivo dans l'implantation de la tumeur primaire et dans la formation des métastases. Ainsi, nos études ont évalué le rôle de DNA-PK sur le contrôle du microenvironnement de la tumeur par le contrôle de la sécrétion de facteurs importants pour la métastase. En résumé, nos résultats mettent en évidence l'importance de la DNA-PK comme cible de traitement anti-métastatique. / The DNA-dependent protein kinase (DNA-PK) is a serine/threonine protein kinase, which is a critical component of the DNA-damage repair pathways through non-homologous end-joining (NHEJ). Besides DNA repair, it is also involved in numerous cellular pathways. Emerging results show that proteins involved in DNA damage repair such as BRCA-1, MRN-11, PARP-1 and also DNA-PK could play a role in cancer metastasis. In the current study, we demonstrated the role of DNA-PK in melanoma metastasis. Firstly using Dbait 32Hc molecules as a tool for specifically activating DNA-PK in a nucleus and cytoplasm, we identified several new cytoplasmic targets of DNA-PK including vimentin. We established that DNA-PK phosphorylates vimentin on Ser459 and that this phosphorylation was mostly located at cell protrusions of melanoma migratory cells. Following this, we confirmed that vimentin-Ser459-P induced by Dbait 32Hc treatment participates to the inhibition of cell adhesion and migration. Thus, this approach led to the identification of downstream cytoplasmic targets of DNA-PK and revealed a connection between DNA damage signaling and the cytoskeleton. Secondly, we show that DNA-PK plays an important role in cell migration and melanoma cell invasion through the regulation of secretion of metastasis-associated factors. Absence or inhibition of DNA-PK leads to down-regulation of pro-metastatic secreted factors and up-regulation of anti-metastatic secreted factors such as inhibitors of matrix metalloproteinases. We confirmed in vivo, that DNA-PK is required for efficient primary tumor implantation and metastases formation. Thus, our studies demonstrate for the first time that DNA-PK acts on tumor microenvironment by controlling secretion of important factors for cell migration and invasion. In summary, our findings highlight the importance of DNA-PK as a target of anti-metastatic treatment.