Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Les infections par les nématodes gastro-intestinaux entrainent des baisses en productions animales et des pertes économiques majeures pour les éleveurs. Les lactones macrocycliques (LMs) sont parmi les antiparasitaires les plus utilisés dans la lutte contre les nématodes gastro-intestinaux en médecine vétérinaire. De part une utilisation intensive, des résistances aux LMs chez les parasites gastro-intestinaux se sont développées au sein des élevages du monde entier mettant en péril l'efficacité thérapeutique de ces molécules. Par ailleurs, le développement de nouveaux antiparasitaires est limité. Ainsi, un des enjeux pour assurer le contrôle de ces parasites est de ralentir les phénomènes de résistance aux LMs afin de prolonger leur efficacité. Le succès d'une telle stratégie repose sur les connaissances précises des mécanismes impliqués dans la résistance. Parmi eux, la modulation des systèmes de détoxification est décrite lors de phénomènes de résistance aux LMs. Au cours de ces travaux, nous avons étudiés la régulation des systèmes de détoxification, en réponse à l'ivermectine chez l'hôte. Nous avons montré, en comparaison à une administration unique, qu'une administration répétée d'ivermectine par voie orale chez la souris est responsable de l'induction de l'expression de certains gènes transporteurs ABC et cytochromes impliqués dans son métabolisme. Ceci entraîne, à la fois, une diminution de la concentration de la molécule parentale et une augmentation de la teneur de son métabolite principal dans le plasma et l'intestin. Ensuite, nous avons étudié l'implication des mécanismes de régulation des systèmes de détoxification, et notamment les récepteurs nucléaires, dans la tolérance à l'ivermectine chez le nématode C.elegans. Nous avons montré que le récepteur nucléaire nhr-a est important pour la tolérance et le développement de la résistance à l'ivermectine. Enfin, nous avons étudié l'impact d'inhibiteurs des transporteurs ABC sur l'efficacité de l'ivermectine. Nous avons mis en évidence la capacité de certains flavonoïdes et de l'ivermectine aglycone à potentialiser l'efficacité de l'ivermectine chez le nématode. Une exposition d'ivermectine induit la surexpression des systèmes de détoxification chez l'hôte. Ceci pourrait être la base des mécanismes moléculaires de la résistance chez le nématode. Cibler les systèmes de détoxification ou les mécanismes de résistance, par des inhibiteurs adaptés, représente une stratégie pertinente pour potentialiser l'efficacité de l'ivermectine. / Infections with gastrointestinal nematodes (GINs) in livestock leads to major losses in production and consequently impact economically farmers. Their intensive use has led to widespread anthelmintic resistance which is nowadays the main threat on the sustainable control of GINs in livestock. The development of new anthelmintic is limited due to the cost of such process. Then, the challenge remains in optimizing the use of existing molecules. Therefore, it is urgent to limit and control MLs resistance in order to extend their efficacy and to avoid therapeutic failure. Resistance mechanisms remain to be elucidated. In that context, we investigated regulatory mechanism of detoxification systems of ivermectin implicated in therapeutic efficacy in host and resistance development in nematode. Therapeutic combinations of ivermectin with flavonoïds have been evaluated to potentiate its efficacy in nematode. We showed that repeated oral administration of ivermectin induced gene expression encoding some ABC efflux transporters and cytochromes involved in its metabolism. Compared with single administration, repeated ivermectin administration lowered plasma, liver and intestine drug concentration, while increasing main metabolite content in plasma and intestine. We have also shown that nuclear receptor nhr-a was important for ivermectin tolerance and ivermectin development of resistance in C. elegans. Finally, we demonstrated the ability of the flavonoïd phloretin to potentiate ivermectin efficacy in the nematode C. elegans. Taken together, these data suggest that induction of detoxification systems impact on ivermectin distribution and targeting their regulation could be an appropriate strategy to potentiate ivermectin efficacy in host and to reverse resistance in nematode.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

La résistance aux lactones macrocycliques (LM) constitue une préoccupation croissante dans le contrôle des nématodes parasitaires, notamment l'Haemonchus contortus chez les ruminants. Parmi les mécanismes étudiés dans la résistance aux LM chez les nématodes d’importance en santé animale, il y a les pompes ABC, principalement les glycoprotéines-p, connues pour leur rôle dans la détoxification des LM chez les strongles. Il n'existe toutefois aucune étude sur l'extrusion des lipides par les pompes ABC en tant que produits excrétoires/sécrétoires provenant d'H. contortus (Hc-PES). Nous émettons l’hypothèse que les pompes ABC chez H. contortus sont à la fois impliquées dans l’extrusion de LM (contribuant à la résistance aux antihelminthiques) et dans l’efflux de lipides secrétés par le parasite. Notre objectif était de caractériser le rôle des pompes ABC chez H. contortus dans le contexte de la résistance aux LM et de l'extrusion des lipides. L'efficacité de l'ivermectine, un membre de LM, a été évaluée dans 8 fermes étudiées par un test de réduction de la numération des œufs dans les selles (TRNOS). Les niveaux d'expression des pompes ABC ont été évalués dans des isolats de champ d’H. contortus avec des résultats TRNOS faibles (présumé souches résistantes). D’ailleurs, des vers adultes d’H. contortus ont été incubés avec trois inhibiteurs de pompes ABC, dont le Fumitremorgin C, le Kétoconazole et le Mk-571 à concentrations différentes. Les lipides ont été identifiés par CL/SM dans les milieux de culture récupérés à 2 h, à 4 h et à 8 h après l'incubation d’H. contortus dans les groupes contrôle et traités. L'expression des gènes Hco-pgp-2 et Hco-pgp-3 était augmentée chez les isolats de champ d’H. contortus. Nous avons identifié 1045 lipides appartenant à diverses catégories. L'extrusion des lipides en Hc-PES a changé en présence d'inhibiteurs de pompes ABC, en particulier pour les lipides composés de structures correspondant à celles pour le transport par les pompes ABC. Nous avons donc conclu que les pompes ABC chez H. contortus représentent un système de multi-extrusion et sont impliquées dans la sécrétion de lipides avec importance dans l’interaction avec l’hôte, mais aussi dans la résistance aux LM chez le nématode. / Macrocyclic lactones (MLs) resistance is a growing concern in controlling parasitic nematodes, particularly Haemonchus contortus in the ruminants’ industry. ABC transporters are known to participate in translocating various lipophilic molecules, including MLs and lipids. Some ABC transporters, mostly P-glycoproteins are known to be involved in MLs detoxification in parasitic nematodes; but there is no data about extrusion of lipids by ABC transporters as Excretory/Secretory Products in H. contortus (Hc-ESP). We hypothesize that ABC transporters in H. contortus have a dual role participating in the efflux of MLs, thus contributing to anthelmintic resistance, and in the extrusion of lipids out of the parasite. This study aimed to characterize the role of H. contortus ABC transporters in the context of ML resistance and the extrusion of lipids. Ivermectin (a member of MLs) efficacy was evaluated in 8 studied farms by the fecal egg count reduction test (FECRT). The expression levels of ABC transporters were evaluated in field isolates of H. contortus with low FECRT results (suspected of resistance). H. contortus adult worms were incubated with three ABC inhibitors, such as Fumitremorgin C, Ketoconazole and Mk-571 with different concentrations. Lipids were identified by LC/MS in culture media at 2h, 4h and 8h post incubation with H. contortus in control and treated groups. Hco-pgp-2 and Hco-pgp-3 were found upregulated in H. contortus field isolates. We identified 1045 lipid molecules belonging to different categories. Interestingly, the lipid profile in Hc-ESP was altered in the presence of ABC transporter inhibitors, which shows structural features compatible as substrates for nematode transporters’ activity. Therefore, ABC transporters in H. contortus participate in extrusion of lipids and also may help in detoxification of MLs, becoming a multipurpose pumping system involved in ML resistance and secretion of lipids at the interplay with the host and among nematodes.

Les lactones macrocycliques (LM) sont des anthelminthiques (AH) à effet paralysant très utilisés chez les animaux et les humains contre les nématodes parasites. Cependant, leur succès thérapeutique est compromis par la résistance croissante aux LM, qui pourrait être en partie dû aux ABC transporteurs P-glycoprotéines (Pgps) sélectionnés et surexprimés chez les nématodes résistants aux LM. Dans ce travail, nous avons étudié plus précisément la P-glycoprotéine 13 du parasite de petits ruminants, Haemonchus contortus. Son orthologue chez le modèle nématode C. elegans, Cel-Pgp-13, est exprimé dans les amphides, structures qui ont été associées à la sensibilité aux AH chez C. elegans et H. contortus. Pour prédire la capacité des Pgps de nematode à transporter des drogues, incluant des LM et autres AH, nous avons développé un modèle de docking in silico. Nous avons utilisé la structure cristallographique de C. elegans Pgp-1 (Cel-Pgp-1), et nous avons montré la liaison avec une forte affinité de plusieurs ligands décrits comme activateurs de sa fonction ATPasique. Nous avons aussi décrit une forte affinité des LM, et un site spécifique de liaison de ces composés à Cel-Pgp-1. Cette approche représente un outil important pour prédire les interactions entre AH, et pour concevoir rationnellement de nouveaux inhibiteurs compétitifs des Pgps de nématode, dans le but d'améliorer les stratégies thérapeutiques. Sur la base de cette approche, nous avons prédit la structure 3D de Hco-Pgp-13 à partir du cristal de Cel-Pgp-1 afin d'étudier son intéraction avec des substrats potentiels, en particulier les LM. Nous avons trouvé des affinités similaires pour différents composés précédemment testés sur Cel-Pgp-1. In vitro, la mesure de l'activité ATPasique montre que l'actinomycine D est un substrat de Hco-Pgp-13. Nos données démontrent la présence possible d'un domaine de reconnaissance multispécifique sur ce transporteur de parasite. La détermination par immunofluorescence de l'expression de Hco-Pgp-13 a montré une distribution tissulaire large indiquant que Hco-Pgp-13 pourrait jouer un role important dans le transport de substrats endogènes et/ou exogènes. En conclusion, ce travail permet de mieux comprendre le rôle des Pgps de nématodes dans le transport de médicaments AH, tant au niveau de l'organisme modèle C. elegans que du nématode parasite H. contortus. Cette étude suggère la conservation de la fonction de tranporteur ABC multidrogue dans ces espèces. La localisation de Hco-Pgp-13 sur les structures amphidiales, et son éventuelle implication dans la résistance aux médicaments et à la survie de H. contortus à l'exposition à des composés AH, restent à préciser. / Macrocyclic lactones (ML) are paralyzing anthelmintics used in animals and humans against parasite nematodes. However, their therapeutic success is compromised by the spread of ML resistance. This might be at least partly due to P-glycoproteins (Pgps) ABC transporters that are selected and overexpressed in ML-resistant nematodes. Deciphering the role of the 10 Pgps expressed in the parasite of small ruminants Haemonchus contortus is thus of major importance to guaranty anthelmintic (AH) efficacy of various drugs. Here we focused on Hco-Pgp-13 due to the expression in the amphids of its closest ortholog in the model nematode C. elegans. Indeed, the amphids represent a putative entry route of drugs to reach AH targets in the nervous system and have been linked to AH susceptibility in C. elegans and H. contortus. In order to predict the capacity of nematode Pgps to transport drugs, including ML and otherAH, we have developed an in silico drug docking model. We have used C. elegans Pgp-1 (Cel-Pgp-1) crystal structure and have showed a high affinity binding of several ligands that have been shown to be activators of its ATPase function. ML were also found to bind with high affinity to Cel-Pgp-1, on a specific binding site. This approach provides a valuable tool to predict drug-drug interactions and to rationally design new competitive inhibitors of nematode Pgps, in order to improve anthelmintic therapeutics. We then predicted a putative 3D structure of Hco-Pgp-13 based on the recently released crystal of Cel-Pgp-1, with which it presented a high homology. This allowed the study of the interaction of Hco-Pgp-13 with potential substrates, in particular ML. We found similar affinities for various drugs previously tested on Cel-Pgp-1, supporting the good homology of these two proteins. Together with in vitro ATPase assay experiments that confirmed the substrate status of actinomycin D, this indicates a possible multispecifc recognition capacity of this parasitic transporter. The determination of Hco-Pgp-13 localization using immunohistochemistry showed a wide tissue expression consistent with a critical role for Hco-Pgp-13 in endogenous and/or exogenous substrate transport. In conclusion, this work provides insights into the role of nematode Pgps in transporting AH drugs, both at the level of the model organism C. elegans and of the parasitic nematode H. contortus. This suggests a high homology of function conserved between ABC tranporters in these species. The localization of such protein on amphidial structures and its possible involvement in drug resistance and survival of H. contortus to exposure to AH compounds remain to be precised.