Submitted by Isaac Francisco de Souza Dias (isaac.souzadias@ufpe.br) on 2016-02-25T18:28:06Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) DISSERTAÇÃO Pollyanna Michelle da Silva.pdf: 1543877 bytes, checksum: 1ffd7e0ed02c76fe3fc79d12bf815053 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-02-25T18:28:06Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) DISSERTAÇÃO Pollyanna Michelle da Silva.pdf: 1543877 bytes, checksum: 1ffd7e0ed02c76fe3fc79d12bf815053 (MD5) Previous issue date: 2015-02-27 / CNPQ / Frutos da romãzeira (Punica granatum L.) são usados popularmente para tratar infecções causadas por microorganismos. Este trabalho descreve o isolamento da lectina da sarcotesta de P. granatum (PgTeL; P. granatum testa lectin) através de extração de proteínas utilizando NaCl 0,15 M, fracionamento salino utilizando sulfato de amônio (30 % de saturação) e cromatografia em coluna de quitina. A atividade hemaglutinante (AH) foi monitorada ao longo do processo de purificação utilizando eritrócitos de coelho. A massa molecular de PgTeL nativa foi determinada por cromatografia de gel filtração e o perfil eletroforético em condições desnaturantes foi avaliado em gel de poliacrilamida contendo sulfato sódico de dodecila (SDS-PAGE). Os efeitos do pH, temperatura e íons sobre a sua AH foram determinados e a atividade antimicrobiana contra bactérias e fungos de importância médica foi avaliada através da determinação das concentrações mínima inibitória (CMI), mínima bactericida (CMB) e mínima fungicida (CMF). Ainda, foi avaliado o efeito de PgTeL na capacidade de aderência e invasiva de bactérias em células HeLa. Tratamento do extrato que apresentou HA específica (18,3) da sarcotesta com sulfato de amônio resultou na precipitação de contaminantes proteicos, uma vez que a fração sobrenadante (FS 30%) apresentou maior AH específica (782) que a fração de proteínas precipitadas (13,92). O perfil da cromatografia de FS 30% em coluna de quitina apresentou um único pico proteico adsorvido, que foi eluído com ácido acético 1,0 M e, após diálise, aglutinou eritrócitos, correspondendo a PgTeL (AH específica: 19.430). A massa molecular relativa de PgTeL nativa em cromatografia de gel filtração foi 58 kDa. Em SDS-PAGE, PgTeL apresentou uma única banda polipeptídica de 58 kDa, indicando que sua estrutura não é formada por subunidades unidas por ligações nãocovalentes. A AH de PgTeL foi detectada em valores de pH de 5,0 a 8,0 e foi resistente ao aquecimento até 100°C durante 30 minutos. A AH de PgTeL foi estimulada por Ca2+ (10 mM) e Mg2+ (20 mM). PgTeL foi agente bacteriostático e bactericida contra Aeromonas sp., Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Micrococcus luteus, Salmonella enteritidis, Serratia marcescens, Staphylococcus saprophyticus e Streptococcus mutans (valores de CMI variando de 0,27 a 9,0 μg/mL e CMB de 0,27 a 68,4 μg/mL), enquanto apenas inibiu o crescimento de Klebsiella sp., Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis (valores de CMI variando de 16 a 20 μg/mL). PgTeL também inibiu a capacidade de aderência de S. enteritidis (40% de inibição) e a capacidade invasiva de E. coli e S. aureus (59% e 25% de inibição respectivamente) em células HeLa. PgTeL mostrou atividade antifúngica contra espécies de Candida (com CMI variando de 6,25 a 25 μg/mL e CMF variando de 6,25 a 50 μg/mL). Em conclusão, PgTeL é uma lectina ligadora de quitina, termoestável, ativa em ampla faixa de pH e com ação antibacteriana e antifúngica, bem como é capaz de interferir na aderência e capacidade invasiva bacteriana. / Fruits of pomegranate (Punica granatum L.) are used by people to treat infections caused by microorganisms. This work reports the isolation of a lectin from P. granatum sarcotesta (PgTeL) by protein extraction using 0.15 M NaCl, saline fractionation using ammonium sulfate (30% saturation) and chromatography on chitin column. Hemagglutinating activity (HA) was monitored during the purification process using rabbit erythrocytes. The molecular mass of native PgTeL was determined by gel filtration chromatography and the electrophoretic profile under denaturing conditions was evaluated using polyacrylamide gel containing sodium dodecyl sulphate (SDS-PAGE). The effects of pH, temperature and ions on its HA were determined and the antimicrobial activity against bacteria and fungi with medical importance was evaluated by determination of minimal bactericide (MBC), inhibitory (MIC) and fungicide (MFC) concentrations. In addition, it was evaluated the effect of PgTeL on the adherence and invasive abilities of bacteria on HeLa cells. Treatment of the sarcotesta extract which showed specific HA (18.3) with ammonium sulphate resulted in precipitation of proteic contaminants since the supernatant fraction (SF 30%) showed highest specific HA (782) than the precipitated protein fraction (13.92). Chromatography profile of SF 30% on chitin column showed a single adsorbed protein peak, which was eluted with 1.0 M acetic acid and, after dialysis, agglutinated erythrocytes, corresponding to PgTeL (specific HA: 19.430). The relative molecular mass of native PgTeL on gel filtration chromatography was 58 kDa. In SDS-PAGE, PgTeL appeared as a single polypepetide band with 58 kDa, indicating that its structure is not composed by subunits linked by non-covalent interactions. The HA of PgTeL was detected at pH values from 5.0 to 8.0 and was resistant to heating at 100°C for 30 minutes. The HA of PgTeL was stimulated by Ca2+ (10 mM) and Mg2+ (20 mM). PgTeL was bacteriostatic and bactericide agent against Aeromonas sp., Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Micrococcus luteus, Salmonella enteritidis, Serratia marcescens, Staphylococcus saprophyticus and Streptococcus mutans (MIC values ranging from 0.27 to 9.0 μg/mL and MBC from 0.27 to 68.4 μg/mL) while only inhibited the growth of Klebsiella sp., Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis (MIC values ranging from 16 to 20 μg/mL). PgTeL also inhibited the adherence ability of S. enteritidis (40% inhibition) and invasive ability of E. coli and S. aureus (59% and 25% inhibition respectively) on HeLa cells. PgTeL showed antifungal activity against Candida species (MIC values ranging from 6.25 to 25 μg/mL and MFC ranging from 6.25 to 50 μg/mL). In conclusion, PgTeL is a thermostable and chitin-binding lectin, active at a broad pH range, and with antibacterial and antifungal action, as well as is able to interfere with adherence and invasivive abilities of bacteria.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:53:11Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo5199_1.pdf: 1035498 bytes, checksum: d8abd52c3fde68ba11f48955570219c8 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2006 / Levanas, compostas por resíduos D-frutofuranosil unidos por ligações β-2,6 podem ser produzidas por diversas espécies de plantas e bactérias. Aplicações para estes polissacarídeos têm sido sugeridas na indústria alimentícia, farmacêutica e na medicina. As partículas magnéticas são largamente estudadas para suas aplicações nas áreas biológica e biomédica. As lectinas são proteínas amplamente distribuídas entre plantas, animais e microorganismos. Cramoll 1 é uma lectina glicose/manose e sua purificação é feita através de um extrato das sementes de Cratylia mollis a 10 % (p/v), posteriormente uma precipitação com sulfato de amônio a 40 a 60 % de saturação (F40-60). Esta foi então cromatografada em Sephadex G-75 (Cramoll 1,4), seguida por uma cromatografia de troca iônica em CM-cellulose (Cramoll 1 e Cramoll 4). Esta lectina tem uma grande variedade de aplicações biotecnológicas. Cramoll 3, lectina galactose específica, também purificada a partir do extrato das sementes de C. mollis e fracionamento com sulfato de amônio a 0 a 40 % de saturação (F0-40), foi cromatografada por exclusão molecular em Sephadex G-100. A Ressonância Magnética Nuclear já é referência mundial para a análise de estruturas moleculares em diversas áreas do conhecimento, sendo utililizada frequentemente para polissacarídeos. O objetivo deste trabalho foi avaliar o uso de levana de Zymomonas mobilis insolubilizada na sua forma magnetizada (FMZAG-12) para purificar lectinas fructose específicas usando preparações de lectinas de sementes de C. mollis. Testes de inibição da Atividade Hemaglutinante (AH) foram utilizados para avaliar a ligação específica de Cramoll 1, Cramoll 1,4, Cramoll 3 e Con A às levanas (ZAG-12, na sua forma nativa e fracionadas por etanol, Z-1-81, ZAP e CP-50). Estas mesmas lectinas e a F40-60 foram incubadas com a FMZAG-12 que foi usada como um suporte de afinidade; as proteínas adsorvidas foram eluídas com seus carboidratos específicos. Métodos eletroforéticos e AH foram utilizados para avaliar as lectinas obtidas. As levanas inibiram diferentemente a AH das lectinas. Con A e Cramoll 1,4 ligadas a FMZAG-12 foram eluídas com glicose, a eluição de Cramoll 1,4 mostrou o mesmo padrão eletroforético (duas bandas polipeptídicas). Cramoll 3 não se ligou ao suporte magnetizado. Quando a F40-60 foi incubada apenas a Cramoll 1 foi purificada, revelando uma banda polipeptídica (padrão). Levanas então inibiram diferentemente a AH das lectinas testadas e FMZAG-12 foi eficiente em purificar Cramoll 1 através de um protocolo mais rápido

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:53:31Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo4860_1.pdf: 2101436 bytes, checksum: 2a1f4e0a8307b77f15bc84782fc1e8a1 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2005 / Em Pernambuco, onde a esquistossomose é historicamente considerada endêmica na região rural, novos focos de infecção aguda têm sido evidenciados em áreas litorâneas. Um episódio epidêmico incomum de esquistossomose aguda em Porto de Galinhas, Pernambuco, Brasil, permitiu-nos estudar alguns aspectos imunológicos, hematológicos e parasitológicos em 36 pacientes antes e após o tratamento com oxamniquine. O sangue foi coletado e diluído em meio RPMI 1640 suplementado com penicilina (100U/ml) e estreptomicina (100&#956;g/ml), e as culturas de sangue total foram realizadas em 14 pacientes sob estimulação antigênica com antígeno solúvel de ovo (SEA) e antígeno solúvel de verme adulto (SWAP) e mitogênica com acetato de forbol miristato/Ionomicina (PMA/Iono) por 96 horas em atmosfera úmida com 5% de CO2. Os sobrenadantes foram coletados para determinação das citocinas Th1 (IFN-&#947;) e Th2 (IL-4) através de ELISA. Análises estatísticas foram realizadas através do teste não paramétrico de Wilcoxon para amostras emparelhadas e p<0,05 foi considerado significativo. A infecção com Schistosoma mansoni foi predominante na faixa etária de 5-15 anos (69,44%) e nos indivíduos do sexo masculino (63,89%). A carga parasitária, avaliada pelo método semi-quantitativo Kato-Katz, variou entre 24 a 1.656 ovos/g de fezes antes do tratamento e apenas 3 pacientes permaneceram positivos após o tratamento. Leucocitose e eosinofilia foram evidenciadas antes e após o tratamento. Os níveis de IgE mostraram-se elevados antes do tratamento, ocorrendo uma redução significativa após o tratamento (p=0,0119). Os níveis de IFN-&#947; dos pacientes agudos elevaram-se significativamente após o tratamento, sob estimulação com SEA (p=0,019), SWAP (p=0,019), PMA/Iono (p=0,0029) e sem estimulação (p=0,0088). Níveis da citocina IL-4, após tratamento, apresentaram-se significativamente elevados apenas sob estimulação com SEA (p=0,0277) e sem estimulação (p=0,043). Ambas as respostas Th1 e Th2 foram exacerbadas após o tratamento. Os resultados encontrados sugerem que a resposta imune na esquistossomose é modificada pelo tratamento, provavelmente devido à destruição dos parasitas e liberação de antígenos

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:53:32Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo4861_1.pdf: 3079056 bytes, checksum: e6c0431e41c9fcff4b8d65311e598f25 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2005 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Lectinas são proteínas que se ligam especificamente aos carboidratos sobre a superfície celular. Eugenia uniflora L. é uma planta Myrtaceae nativa do sul da América, Sudeste da Ásia e África. Triticum vulgaris é uma aglutinina (36 kDa) constituída por duas subunidades. Proteínas antimicrobianas têm sido isoladas de uma variedade de espécies de plantas. O objetivo deste estudo foi purificar uma lectina de sementes de Eugenia uniflora e avaliar o comportamento interfacial da lectina EuniLS através de medidas da pressão de superfície P e potencial de superfície DV em diferentes valores de pH do volume, detectar atividade e caracterizar a lectina de sementes de E. uniflora, EuniLS, bem como avaliar o efeito da lectina sobre as bactérias Gram-negativas e Gram-positivas. EuniLS foi purificada de um extrato de sementes (E) em tampão fosfato de sódio (pH 7,0) em cromatografia de DEAE-Sephadex. EuniLS (67 kDa) permaneceu estável na faixa de pH 2 a 9 e mostrou especificidade para açúcares complexos, assim como oligossacarídeos. Além do mais, EuniLS tem uma atividade hemaglutinante específica de 85,3. As isotermas de pressão de superfície (P) × área molecular (A) evidenciaram que o comportamento interfacial foi fortemente dependente do pH do volume. EuniLS apresentou uma alta atividade superficial (Pc=40 mN/m e DV=440 mV) que a lectina WGA (Pc=34 mN/m e DV =340 mV) no pH 2. O momento dipolar de EuniLS (&#956;^) aumentou em 1,3 vezes com o incremento de pH de 2 a 9, enquanto que WGA o (&#956;^) aumentou 3,8 vezes para a mesma variação de pH. Ambas as lectinas apresentaram uma contribuição negativa da dupla camada elétrica Y0=-68 mV a -64 mV para EuniLS e Y0=-117 mV -144 mV para WGA. Uma relação linear para Y0 e pH (faixa de 2 6) foi observada para EuniLS. Um ponto de quebra foi detectado em pH 6,0 e um platô foi observado até o pH 7,0, que corresponde ao ponto isoelétrico da EuniLS. Um comportamento similar foi observado para valores de z &#8722;7,5 a &#8722;30 mV. As variações ocorridas em DV ocorreram devido a contribuição da orientação da molécula de lectina na superfície (&#956;^), e a dupla camada elétrica (Y0). A eluição da proteína adsorvida foi realizada com TFS (pH 2,0) e sua atividade foi avaliada através de eritrócitos (coelho e humano), carboidratos e estabilidade em diferentes valores de pH (3,5-9,0). Uma eletroforese de EuniLS foi realizada através de gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) para definir o peso molecular. A atividade antimicrobiana do extrato e EuniLS foram investigados utilizando o teste de disco. O meio de cultura (100mL, 43º C) e 0,5 mL de inoculo foram adicionados e a solução foi distribuída em placas de Petri estéril em porções de 10 mL. Discos de 6 mm de diâmetro foram impregnados com 15 &#956;L de solução de lectina estéril e E em TFS (pH 7,0). A atividade de EuniLS foi parcialmente inibida pelas glicoproteínas (caseína e soro de coelho) e aglutinada por eritrócitos de coelho e humano (tipos A, B, AB e O). Eletroforeses das preparações de E. uniflora mostraram uma lectina de peso molecular de 67 kDa. A atividade de EuniLS foi aumentada no pH 6,5. EuniLS inibiu a maioria dos microrganismos testados: Klebsiella sp. (halo de 19,6 mm ± 2,5), Pseudomonas aeruginosa (halo de 18,6 mm ± 0,6), Staphylococcus aureus (20,0 mm ± 0,5) e Corinebacterium sp. (8,0 mm ± 0,1), com mínima concentração inibitória (MIC) de 1,5 e mínima concentração bactericida (MBC) de 16,5 &#956;g/mL. Extrato de sementes não mostrou atividade antibacteriana contra os microrganismos testados. Estes resultados indicam uma purificação de uma nova lectina e sua atividade antibacteriana; EuniLS pode ser utilizada como um adjuvante em terapia antibacteriana

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:53:51Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo4870_1.pdf: 3345694 bytes, checksum: 11a747aa1978117329875c264c0dfa0d (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2006 / Além do de interesse acadêmico, o conhecimento acerca do enovelamento de proteínas é empregado em muitas aplicações biotecnológicas com importância industrial. Lectinas são proteínas capazes reconhecer com especificidade diferentes sacarídeos, estando envolvidas em uma variedade processos biológicos. Diversos modelos de associações quaternárias levam as lectinas de leguminosas a apresentarem peculiaridades no reconhecimento de carboidratos. Cramoll 1 é a principal isolectina encontrada em sementes de Cratylia mollis. Essa lectina glucose/manose específica pode apresentar-se como dímeros ou tetrâmeros. Resultados expressivos como caracterização de células transformadas, atividade mitogênica e inibição tumoral estimulou a realização do presente estudo. Utilizando espectroscopia de fluorescência e dicroísmo circular, características do processo de desenovelamento de Cramoll 1 induzido por uréia e altas pressões hidrostáticas (HHP) foram obtidas. Em pH 7,0, o centro de massa de triptofano não apresentou qualquer alteração significativa até 3 M de uréia sugerindo que a proteína ainda está na sua forma nativa. Como esperado, uma vez que a lectina é um dímero naquele pH, o processo foi dependente de concentração. Bis-ANS é uma sonda fluorescente usada para detectar intermediários de enovelamento de proteínas. Interessantemente, a lectina mostrou um aumento na capacidade de ligação a bis-ANS, principalmente na faixa de 3-5 M de uréia. Na presença de 3 M de uréia, existiram pouquíssimas mudanças no espectro de dicroísmo circular, mostrando que a estrutura secundária de Cramoll 1 está quase intacta sob esta condição. Reunidos, esses resultados sugerem que o desenovelamento de Cramoll 1 é um processo que ocorre em mais de dois estágios, com acumulação de uma espécie intermediária (I3M) na presença de 3 M de uréia. 3,1 kbar a 37 e 1 oC não foi capaz de deslocar o centro de massa de triptofano, apontando que a lectina é pressão-resistente. A única condição em que o dímero de Cramoll 1 foi efetivamente dissociado foi quando 3 M de uréia foi adicionado ao tampão. Ao avaliar a ligação da proteína a bis-ANS sob pressão na presença de 3 M de uréia, observou-se que mesmo depois de 100 min, quando os triptofanos já foram expostos ao solvente, a lectina aumentou sua capacidade de ligar essa sonda. Essa observação implica que Cramoll 1 não está totalmente desenovelada sob HHP, exibindo mais uma espécie intermediária (IP). No entanto, é necessário salientar que IP é diferente de I3M uma vez que o último mantém seus triptofanos em seu ambiente nativo. Em conjunto, os dados descritos aqui sugerem que o processo de desenovelamento de Cramoll 1 pode ser esquematizado como: N &#1048774;&#61472;I3M &#1048774;&#61472;IP &#1048774;&#61472;U

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:55:35Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo79_1.pdf: 1037483 bytes, checksum: 2a3e04b13ef6daeac80ee5ef7f9b473f (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2010 / Anticorpos são largamente utilizados para caracterizar células leucêmicas dentre seus estágios de diferenciação. O uso de lectinas, (glico)proteínas que reconhecem especificamente carboidratos, como sonda de análise da superfície celular fornece informações sobre carboidratos na membrana celular. A diferenciação das células e sua transformação maligna são caracterizadas por mudanças nos resíduos de carboidratos de glicoconjugados de membrana celular as quais podem ser detectadas por lectinas. Neste estudo, células de medula óssea de pacientes com leucemia mielóide aguda (LMA) e linfóide aguda (LLA), recém diagnosticados no Centro de Oncohematologia Pediátrica do Hospital Universitário Oswaldo Cruz/UPE e Fundação de Hematologia e Hemoterapia de Pernambuco (HEMOPE), foram avaliadas usando um painel com cinco lectinas conjugadas ao isotiocianato de fluoresceina, FITC (fluorescein isothiocyanate), Wheat germ agglutinin (WGA), Lotus tetragonolobus agglutinin (LTA), Concanavalina A (Con A), Ulex europaeus (UEA I) e Arachis hypogaea (PNA), de acordo com o protocolo de marcação utilizado para o diagnóstico de rotina com anticorpos monoclonais. A WGA, específica para N-acetilglicosamina, marcou intensamente as células leucêmicas de pacientes com LLA e LMA, mas não foi capaz de diferenciá-las. Entretanto, a UEA-I (L-fucose) mostrou maior especificidade para as células de linhagem mielóide (LMA) do que para LLA, sendo capaz de diferenciá-las. A LTA marcou tanto as células de LMA quanto de LLA, embora apresente também especificidade para o carboidrato L-fucose. Não foi observada marcação seletiva para as lectinas PNA (D-galactose específica) e Con A (D-glicose/D-manose) para as células de LLA e LMA. Estes achados demonstram que lectinas são potenciais sondas para detectar mudanças no perfil sacarídico de glicoconjugados de membrana de células hematopoiéticas imaturas, sendo mais uma ferramenta para o diagnóstico dos diferentes tipos de leucemia

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:55:50Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo9636_1.pdf: 4358225 bytes, checksum: b9c45b7b0fdc16868d04beaf275ed5ad (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2012 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Este trabalho descreve a purificação em quantidades miligramas de uma lectina de raízes secundárias de Bauhinia monandra (BmoRoL) e suas atividades antifúngica, termiticida e aplicação eletroquímica. A BmoRoL (6,2 mg) foi isolado por meio de fracionamento com sulfato de amônio e cromatografia de afinidade em gel de guar. A lectina nativa foi resolvida como uma única banda na eletroforese em gel de poliacrilamida para proteínas básicas. Sob condições de desnaturação e redução as que apareceu como um polipeptídeo único glicosilado de 26 kDa. A mais elevada atividade de aglutinação de BmoRoL foi encontrado com eritrócitos de coelho tratado com glutaraldeído. BmoRoL mostrou atividade antifúngica contra espécies fitopatogênicas de Fusarium e foi mais ativa em Fusarium solani. A lectina também mostrou atividade termiticida sobre os trabalhadores e soldados Nasutitermes corniger com LC50 de 0,09 e 0,395 mg de 1 mL por 12 dias. BmoRoL foi imobilizada sobre a superfície de eletrodos de platina (Pt) e de grafite (C) e caracterizada por espectroscopia de impedância eletroquímica (EIE), demostrando que as reações do par redox da sonda eletroquímica para os eletrodos de Pt e C foram bloqueados devido a mudanças na impedância da interface eletrodo/solução. Os sistemas adsorvidos com BmoRoL foram em seguida utilizados para interação com carboidratos e glicoproteínas comerciais puras (ovoalbumina, fetuína, peroxidase e asialofetuína) bem como interação com glicoproteínas e/ou glicoconjugados em soros não contaminados e contaminados com Leishamania que evidenciaram o aumento da parte real da impedância (Zre). Em conclusão, BmoRoL é uma nova lectina antifúngica e termiticida, que poderá ser aplicada na construção de biosensores uma vez que os sistemas eletroquímicos testados apresentaram uma resposta impedimétrica em eletrodos de Pt e C

Submitted by Isaac Francisco de Souza Dias (isaac.souzadias@ufpe.br) on 2016-04-27T18:47:41Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) TESE Debora Maximo das Neves Luna.pdf: 3149214 bytes, checksum: 948556bb6aaf20df2b076b5191f11142 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-27T18:47:41Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) TESE Debora Maximo das Neves Luna.pdf: 3149214 bytes, checksum: 948556bb6aaf20df2b076b5191f11142 (MD5) Previous issue date: 2015-02-27 / FACEPE / A imobilização de lipídios em substratos sólidos tem sido amplamente utilizada no desenvolvimento de biossensores visando a uma alternativa simples e de baixo custo. Dessa forma, um ambiente favorável à imobilização de proteínas pode ser criado o que viabiliza a utilização destas moléculas como elemento de biorreconhecimento molecular. A finalidade deste estudo consiste em imobilizar a lectina Concanavalina A, em uma plataforma nanostruturada contendo moléculas fosfolipídicas a fim de identificar glicoproteínas presentes no soro contaminado com dengue (DENV-1, DENV-2 e DENV-3). A resposta foi avaliada por técnicas eletroquímica (Espectroscopia de Impedância Eletroquímica [EIE] e Voltametria Cíclica [VC]) e piezoelétrica (Microbalança de Cristal de Quartzo [QCM]). O biossensor eletroquímico apresentou maior resposta para DENV-3 (RCT = 180%) em relação aos DENV-1 (RCT = 60%) e DENV-2 (RCT = 80%). Por outro lado, o biossensor piezoelétrico identificou de forma qualitativa da presença do DENV. Com o objetivo de aumentar a especificidade na identificação do DENV, quatro imunossensores eletroquímicos constituídos por camada auto-organizada de cisteína, nanopartícula de ouro e anticorpo monoclonal (Anti-DENV-1, Anti-DENV-2, Anti-DENV-3 e Anti-DENV-4) foram desenvolvidos e avaliados após exposição ao vírus da dengue DENV-1, DENV-2, DENV-3 e DENV-4. Os imunossensores demonstraram eficácia, linearidade e especificidade para todos os sorotipos analisados. Além disso, técnicas de microscopia de força atômica e microscopia eletrônica de varredura caracterizaram satisfatoriamente a imobilização na superfície de todos os biossensores desenvolvidos. / Immobilization of lipids on solid substrates has been extensively used in the development of biosensors, aiming a simple and low-cost alternative. Thus, a favorable environment for immobilization of proteins can be obtained and these molecules can be used as a molecular element for biorecognition. The purpose of this study is to conduct the immobilization of the Concanavalin A lectin on a nanostrutured platform containing phospholipid molecules with the aim of identify serum infected with dengue virus (DENV-1, DENV-2 and DENV- 3). The response was evaluated by electrochemical technique (Electrochemical Impedance Spectroscopy [EIS] and Cyclic Voltammetry [CV]) and piezoelectric technique (Quartz Crystal Microbalance [QCM]). The electrochemical biosensor showed greater response for DENV-3 (RCT = 180%) compared to DENV-1 (RCT = 60%) and DENV-2 (RCT = 80%). Moreover, piezoelectric technique identified qualitatively the presence of DENV. In order to increase the specificity in the identification of DENV, four electrochemical immunosensors based on self-organized layer of cysteine, gold nanoparticles and monoclonal antibody (Anti- DENV-1, Anti-DENV-2, Anti-DENV-3 e Anti-DENV-4) were developed and evaluated after exposure to dengue virus (DENV- 1, DENV-2, DENV-3 and DENV-4). The immunosensors demonstrated efficacy, linearity and specificity for all serotypes analyzed. In addition, atomic force microscopy and scanning electron microscopy techniques, satisfactorily characterized the immobilization on the surface of all developed biosensors.

Submitted by Alice Araujo (alice.caraujo@ufpe.br) on 2018-04-12T20:10:08Z No. of bitstreams: 1 TESE Kézia Santana de Moura.pdf: 5302858 bytes, checksum: d80168b021f26923f250d62a588dd228 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-12T20:10:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TESE Kézia Santana de Moura.pdf: 5302858 bytes, checksum: d80168b021f26923f250d62a588dd228 (MD5) Previous issue date: 2017-02-22 / FACEPE / A ampla utilização das sementes de Moringa oleifera no tratamento de água torna necessários estudos para determinação da segurança do uso para a população. As sementes de M. oleifera contêm lectinas (proteínas hemaglutinantes que ligam carboidratos). Dentre elas, há a lectina WSMoL (do inglês water-soluble M. oleifera lectin), que é um dos agentes responsáveis pelas propriedades coagulantes e que possui atividade larvicida contra Aedes aegypti. Os objetivos deste trabalho foram: (1) determinar a toxicidade do extrato de sementes sobre células humanas normais GN1 (linhagem celular não-tumorigênica derivada de fibroblastos) e HaCaT (linhagem não-tumorigênica derivada de queratinócitos humanos); (2) avaliar a cinética de coagulação promovida por WSMoL em modelo de água turva utilizando caolin, através de medidas de densidade óptica e variação de resistência elétrica, na ausência e presença de carboidratos e íons; (3) investigar o efeito de WSMoL na sobrevivência e atividade de enzimas digestivas de larvas de Culex quinquefasciatus, mosquito vetor da filariose e chikungunya. O extrato aquoso de sementes de M. oleifera reduziu o número de células viáveis com CE50 (48 h) de 1,32 e 1,23 μg/mL de proteínas para HaCaT e GN1, respectivamente. A análise por citometria de fluxo revelou que o extrato induziu a morte de GN1 por necrose enquanto que as células HaCaT não apresentaram marcação para necrose ou apoptose. A avaliação da expressão do antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA) revelou uma redução de 45,4±1,3% em células HaCaT tratadas, confirmando um efeito antiproliferativo. O tratamento de GN1 e HaCaT com o extrato aumentou os níveis mitocondrial e citosólico de espécies reativas de oxigênio, bem como causou uma diminuição do consumo de O2. A detecção de toxicidade do extrato de sementes sobre células humanas normais indica cautela em relação à dosagem utilizada para o tratamento da água. WSMoL apresenta massa molecular nativa de 60 kDa e ponto isoelétrico 5,5. Em SDS-PAGE, foram observados três bandas polipeptídicas com aproximadamente 30, 20 e 10 kDa. Foi detectada redução tanto da densidade óptica quanto da resistência elétrica na suspensão de caolin tratada com WSMoL, o que indica que a atividade coagulante se deve à desestabilização das partículas em suspensão, seguida por interações químicas entre as partículas e a lectina. A incubação da lectina com os monossacarídeos N-acetilglicosamina, glicose e frutose (em concentrações que inibiram a atividade hemaglutinante) ou com íons cálcio e magnésio promoveram a redução da atividade coagulante de WSMoL. Esses resultados sugerem que grupos presentes no domínio de ligação a carboidratos podem estar envolvidos na atividade coagulante de WSMoL, bem como que a conformação da lectina necessária para essa propriedade é afetada pela ligação de carboidratos e íons. WSMoL revelou-se larvicida sobre C. quinquefasciatus com CL50 de 1,05 mg/mL. A incubação de extratos do intestino das larvas com a lectina não afetou a atividade de α-amilase e tripsina, porém reduziu significativamente a ação catalítica de protease, sugerindo que a atividade larvicida pode-se estar ligada à interferência no processo de digestão e absorção de nutrientes. / The wide use of Moringa oleifera seeds in the treatment of water makes studies necessary to determine the safety for the population. The seeds of M. oleifera contain lectins (hemagglutinating proteins that bind carbohydrates). Among them, there is the WSMoL (water-soluble M. oleifera lectin), which is one of the agents responsible for the coagulant properties and that has larvicidal activity against Aedes aegypti. The aims of this work were: (1) to determine the toxicity of the seed extract on normal human cells GN1 (non-tumorigenic cell line derived from fibroblasts) and HaCaT (non-tumorigenic line derived from human keratinocytes); (2) to evaluate the kinetics of coagulation promoted by WSMoL in turbid water model using kaolin, through measurements of optical density and of electrical resistance variation, in the absence and presence of carbohydrates and ions; (3) to investigate the effect of WSMoL on the survival and activity of digestive enzymes of Culex quinquefasciatus larvae, vector mosquito of filariasis and chikungunya. The aqueous extract of M. oleifera seeds reduced the number of viable cells with EC50 (48 h) of 1.32 and 1.23 μg/mL of proteins for HaCaT and GN1, respectively. Flow cytometry analysis revealed that the extract induced the death of GN1 by necrosis while HaCaT cells showed no labeling for necrosis or apoptosis. Evaluation of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) expression revealed a 45.4±1.3% reduction in treated HaCaT cells, confirming an antiproliferative effect. The treatment of GN1 and HaCaT with extract increased the mitochondrial and cytosolic levels of reactive oxygen species, as well as a decrease in O2 consumption. The detection of toxicity of the seed extract on normal human cells indicates caution regarding the dosage used for the treatment of water. WSMoL has a native molecular mass of 60 kDa and isoelectric point 5.5. In SDS-PAGE, three polypeptide bands with approximately 30, 20 and 10 kDa were observed. Reduction of both the optical density and the electrical resistance were detected in the kaolin suspension treated with WSMoL, indicating that the coagulant activity is due to the destabilization of the suspended particles, followed by chemical interactions between the particles and the lectin. Incubation of the lectin with the monosaccharides N-acetylglucosamine, glucose and fructose (at concentrations that inhibited hemagglutinating activity) or with calcium and magnesium ions promoted the reduction of the coagulant activity of WSMoL. These results suggest that groups present in the carbohydrate binding domain may be involved in the coagulant activity of WSMoL, as well as that the conformation of the lectin required for this property is affected by the binding of carbohydrates and ions. WSMoL showed to be larvicidal on C. quinquefasciatus with LC50 of 1.05 mg/mL. Incubation of larval intestinal extracts with lectin did not affect α-amylase and trypsin activity, but significantly reduced the catalytic action of protease, suggesting that larvicidal activity may be linked to interference in the digestion and absorption of nutrients.

Submitted by Alice Araujo (alice.caraujo@ufpe.br) on 2018-04-16T21:39:34Z No. of bitstreams: 1 TESE Thâmarah de Albuquerque Lima.pdf: 2857467 bytes, checksum: bb3a68bcfa7cd5f2b12742db8b1210a3 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-16T21:39:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TESE Thâmarah de Albuquerque Lima.pdf: 2857467 bytes, checksum: bb3a68bcfa7cd5f2b12742db8b1210a3 (MD5) Previous issue date: 2016-03-29 / FACEPE / Lectinas, proteínas que interagem com carboidratos, isoladas da entrecasca (MuBL), cerne (MuHL) e folha (MuLL) de Myracrodruon urundeuva apresentaram atividade termiticida contra cupins operários da espécie Nasutitermes corniger. O presente trabalho teve como objetivo investigar mecanismos da ação termiticida dessas lectinas. Inicialmente, foi realizado um estudo de caracterização das atividades enzimáticas encontradas no trato digestivo de operários, de forma comparativa com os soldados da mesma espécie. Extratos de intestinos dos cupins foram avaliados quanto à presença de celulases (endoglucanases, exoglucanase e β-glicosidades), hemicelulases (β-xilosidases, α-L-arabinofuranosidase e β-D-xilanase), amilases e proteases (proteases totais, tripsina, quimotripsina e queratinase). A primeira avaliação dos mecanismos de ação correspondeu à determinação do efeito de MuBL e MuLL sobre as atividades enzimáticas detectadas no intestino dos operários. Na segunda etapa, foram investigadas possíveis proteínas que sejam alvos de ligação das lectinas no intestino dos operários. Para tanto, extratos de intestino foram submetidos à cromatografia em matrizes MuBL-Sepharose e MuLL-Sepharose. As proteínas que adsorveram à matriz foram submetidas à eletroforese e espectrometria de massas para separação e identificação. Na última etapa, operários foram submetidos por 48 h a dietas artificiais compostas por matriz de celulose e suplementadas ou não com MuBL, MuHL ou MuLL (em suas respectivas CL50); em seguida, os insetos tiveram seu intestino médio dissecados, fixados e submetidos à análise histológica, contagem de células digestivas e regenerativas e visualização de células em proliferação, células enteroendócrinas, células em apoptose e da matriz peritrófica. Todas as atividades enzimáticas avaliadas foram detectadas nos extratos de operários e soldados, sendo endoglucanase e β-D-xilanase as principais atividades detectadas. As atividades enzimáticas de operários e soldados foram detectadas em níveis diferentes e apresentaram diferentes respostas a variações de temperatura e pH indicando que as castas possuem aparatos digestivos distintos. MuBL e MuLL foram capazes de modular diferentemente as atividades enzimáticas do trato digestivo dos operários. A atividade de exoglucanase foi neutralizada por MuBL enquanto MuLL promoveu aumento dessa atividade. Atividade de α-L-arabinofuranosidase foi inibida por MuLL e não afetada por MuBL. Ambas as lectinas estimularam a atividade de α-amilase e inibiram as atividades de proteases. As matrizes MuBL-Sepharose e MuLL-Sepharose ligaram a proteína apolipoforina. MuBL-Sepharose também ligou proteína com homologia a transportadores do tipo ABC (ATP-binding cassette) e tripsina. MuBL, MuHL e MuLL causaram forte desorganização no epitélio do intestino médio dos operários, reduzindo o número de células digestivas, regenerativas e enteroendócrinas. A ingestão das lectinas resultou em morte das células intestinais por apoptose. A matriz peritrófica foi visualizada nos tratamentos controle e com as lectinas, contudo a marcação foi menos intensa em intestinos de cupins que ingeriram MuBL. Os resultados mostram que as lectinas foram capazes de cruzar essa matriz peritrófica e causar danos às células do epitélio intestinal. Em conclusão, podemos afirmar que: 1) operários e soldados de N. corniger apresentam aparatos digestivos diferenciados, com elevada eficiência para digerir biomassa celulósica; 2) a ação termiticida das lectinas MuBL e MuLL pode estar relacionada com a modulação de processos digestivos e absortivos no trato intestinal de operários, tendo como alvos enzimas digestivas, a proteína transportadora apolipoforina e transportadores ABC; 3) MuBL, MuHL e MuLL atuam promovendo desestruturação do epitélio intestinal de operários, causando morte de células digestivas, regenerativas e enteroendócrinas. Esses resultados constituem os primeiros relatos sobre alvos moleculares e celulares de lectinas termiticidas. / Lectins, proteins that interact with carbohydrates, isolated from the bark (MuBL), heartwood (MuHL) and leaf (MuLL) of Myracrodruon urundeuva showed termiticidal activity against workers of Nasutitermes corniger termite. This study aimed to investigate mechanisms of the termiticidal action of these lectins. Initially, a study was conducted in order to characterize the enzyme activities found in the digestive tract of workers, in comparison with the soldiers of the same species. Termite gut extracts were assessed for the presence of cellulases (endoglucanase, exoglucanase, and β-glucosidase), hemicellulases (β-xylosidase, α-L-arabinofuranosidase and β-D-xylanase), amylases and proteases (total protease, trypsin, chymotrypsin and keratinase). The first evaluation of the action mechanisms corresponded to the determination of MuBL and MuLL effects on the enzyme activities detected in the gut of the workers. In the second step, we investigated possible proteins that would be lectin binding targets in the gut of workers. Therefore, worker gut extracts were subjected to chromatographies on MuBL-Sepharose and MuLL-Sepharose matrices. Proteins that adsorbed to the matrices were submitted to electrophoresis and mass spectrometry for separation and identification. In the last step, workers were submitted for 48 h to artificial diets composed of cellulose matrix and supplemented or not with MuBL, MuHL or MuLL (at their respective LC50); then, the insects had their midguts dissected, fixed and evaluated by histological analysis, counting of digestive and regenerative cells, and visualization of proliferative, enteroendocrine and apoptotic cells, as well as of peritrophic matrix. All the enzyme activities evaluated were detected in worker and soldier extracts, being endoglucanase and β-D-xylanase the main activities detected. The enzyme activities of workers and soldiers were detected at different levels and showed different responses to temperature and pH, indicating that these castes have different digestive apparatuses. MuBL and MuLL were able to modulate differently the enzyme activities from the digestive tract of workers. MuBL neutralized the exoglucanase activity while MuLL promoted increase in this activity. α-L-arabinofuranosidase activity was inhibited by MuLL and was not affected by MuBL. Both lectins stimulated the α-amylase activity and inhibit the activity of proteases. The MuBL-Sepharose and MuLL-Sepharose matrices bound the protein apolipophorin. MuBL-Sepharose also bound proteins with homology to ABC (ATP-binding cassette) transporters and trypsin. MuBL, MuHL and MuLL caused strong disorganization in the midgut epithelium of workers, reducing the number of digestive, regenerative and enteroendocrine cells. Ingestion of lectins resulted in death of intestinal cells by apoptosis. The peritrophic matrix was visualized in the control and lectin treatments but the labeling was less intense in gut of termites that ingested MuBL. These results show that the lectins were able to cross this peritrophic matrix and cause damage to the cells of the midgut epithelium. In conclusion, we can state that: 1) N. corniger workers and soldiers have different digestive apparatus, with high efficiency to digest cellulosic biomass; 2) the termiticidal action of MuBL and MuLL can be linked to modulation of digestive and absorptive processes in the intestinal tract of workers, targeting digestive enzymes, the transporter protein apolipophorin and ABC transporters; 3) MuBL, MuHL and MuLL promoted disruption of the midgut epithelium of workers, causing death of digestive, regenerative and enteroendocrine cells. These results are the first reports on molecular and cellular targets of termiticidal lectins.