CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Muitos compostos isolados de plantas apresentam diversos tipos de atividades biolÃgicas, como tem sido o caso de proteÃnas conhecidas como lectinas. Essas proteÃnas fazem parte de um grupo de molÃculas que reconhecem e se ligam a carboidratos contidos na superfÃcie das cÃlulas de forma especÃfica e reversÃvel. Nas Ãltimas dÃcadas as lectinas vÃm se tornando ferramentas promissoras com aÃÃo antitumoral e antiviral. Esse trabalho objetivou investigar a possÃvel aÃÃo anticancerÃgena e antiviral das lectinas isoladas das sementes de Canavalia brasiliensis (ConBr), Canavalia marÃtima (ConM), Dioclea lasiocarpa (DLasiL) e Dioclea sclerocarpa (DSclerL), o possÃvel mecanismo inicial de aÃÃo anticancerÃgena da lectina DLasiL, alÃm de estudar a estrutura da DLasiL atravÃs das tÃcnicas de fluorescÃncia e dicroÃsmo circular e seu mecanismo para atividade anticÃncer. A lectina DLasiL foi particularmente caracterizada, apresentando 237 resÃduos de aminoÃcidos com alta similaridade com as lectinas da subtribo Diocleinae. RessonÃncia paramagnÃtica de elÃtrons mostrou sinal caracterÃstico da presenÃa do Ãon manganÃs (Mn2+), enquanto medidas de ICP-MS confirmaram a quantidade deste Ãon, alÃm de cÃlcio (Ca2+), cuja quantidade foi inferior ao medido nas outras lectinas. Estudos de fluorescÃncia intrÃnseca indicaram melhor acessibilidade aos triptofanos por molÃculas neutras, provando que a vizinhanÃa possuui carÃter nÃo carregado, enquanto que fluorescÃncia extrÃnseca usando Bis-ANS ilustrou a alteraÃÃo conformacional provocada pela interaÃÃo a aÃÃcares, concluindo que à possÃvel utilizar esse tipo de medida para a constataÃÃo desse fenÃmeno. Medidas de DicroÃsmo Circular confirmam a significativa estabilidade tÃrmica da DLasiL no qual perdeu 50% de sua atividade a 72 oC. Para investigar a aÃÃo antitumoral das lectinas em estudo, cÃlulas de carcinoma de ovÃrio humano (A2780), carcinoma caucasiano de pulmÃo humano (A549), carcinoma de mama humano (MCF7), carcinoma de prÃstata humano (PC3) foram cultivadas com DLasiL. AlÃm disso, foi determinada a viabilidade celular. Os resultados mostraram que as lectinas foram efetivas em inibir o crescimento celular das linhangens testadas utilizando concentraÃÃo nanomolar. Dentre as lectinas testadas, a mais efetiva em inibir o crescimento celular foi a DLasiL, demonstrando um maior Ãndice de citotoxicidade contra cÃlulas da linhagem A2780 com IC50 de 52 nM. O mecanismo de aÃÃo da DLasiL foi investigado atravÃs de ensaios especÃficos de apoptose. Dados de ciclo celular mostraram que a DLasiL apresenta mudanÃas significativas nos nÃveis S e G2/M. Adicionalmente, ensaios com uma sÃrie de conjuntos de vÃrus apresentaram resultados bastante promissores. / Several compounds isolated from plants, including proteins called lectins, have exhibited many types of biological activities. These proteins are specific recognizing and binding to carbohydrates found onto the cell surface. During the last decades, lectins have become promising sources for antitumor and antiviral studies. This study aimed to investigate legumineous lectins, ConBr (Canavalia brasiliensis), ConM (Canavalia maritima), DLasiL (Dioclea lasiocarpa) and DSclerL (Dioclea sclerocarpa) as potential anti-cancer and anti-viral agents, as well as studying structurally DLasiL using fluorescence, circular dichroism and its initial mechanism of anticancer activity. DLasiL lectin was characterized showing 237 amino acid residues with high similarity to lectin from the Diocleinae subtribe. Electron paramagnetic resonance of DLasiL showed a typical signal for manganese (Mn+2), while ICP-MS provided its actual amount along with calcium (Ca2+), whose values were below those found for the other lectins. Intrinsic fluorescence studies using three quenchers showed a better accessibility of neutral species to tryptophans of DLasiL, while extrinsic fluorescence using bis-ANS exhibited a dose-dependent conformational changes promoted by sugars. Circular dichroism showed very expressive thermal stability of DLasiL with mid-point for thermal denaturation at 72 ÂC. These lectins were used to treat human ovarian carcinoma (A2780), Human Lung Carcinoma (A549), Human Breast Carcinoma (MCF7), Human Prostate Carcinoma (PC3) and cell viability was determined. These proteins showed potent activity on inhibiting cell growth at nanomolar concentrations. Among these lectins, DLasiL was the most effective showing potent cytotoxicity against A2780 cell line with IC50 of 52 nM. The mechanism of cytotoxicity action of DLasiL was investigated by specific apoptosis assay. Cell cycle studies showed DLasiL causes significant changes in the levels of S and G2/M. A virus screening investigation was carried out showing promissing antiviral activity.

Introdução: A Galectina-1 (Gal-1) é uma proteína multifuncional capaz de reconhecer, de modo específico, glicanas compostas por resíduos de -galactosídeos, por meio de domínios de reconhecimento de carboidrato (CRD). A Gal-1 é um homodímero de 14.900 daltons, pI = 5.6, apresenta uma topologia molecular do tipo jelly-roll composto por duas folhas- anti-paralelas. Além disso, esta proteína não apresenta peptídeo sinal e possui 6 cisteínas, 7 ácidos glutâmicos, 9 ácidos aspárticos e 4 histinas por monômero. A Gal-1 liga-se a diferentes moléculas biológicas contidas nas superfícies celulares, núcleo e componentes da matriz extracelular. O zinco é um importante metal em sistemas biológicos. Aproximadamente 10% do proteoma humano é potencialmente capaz de complexar zinco. Este íon exibe propriedades adequadas tanto para funções catalíticas, quanto estruturais em proteínas. Os sítios de ligação a zinco, nas proteínas, podem ser divididos em catalíticos, estruturais, co-catalíticos e sítios na interface protéica. Geralmente, os resíduos de cisteína, histidina, ácido glutâmico e ácido aspártico são alvos preferênciais de interação com Zn. Há na literatura dados que mostram a interação da Gal-1 humana com íons orgânicos, porém não há relatos sobre a interação Gal-1/Zn . Objetivos: O presente trabalho teve como objetivo avaliar a existência e as implicações da interação entre o íon Zn2+ e a proteína Gal-1. Materiais e Métodos: Foi efetuada a produção, purificação e padronização do uso das formas dimérica e monomérica da Gal-1 recombinante humana. A interação Gal-1/Zn foi avaliada através de ensaios biofísicos e biológicos. A análise in vitro e in silico dos paramêtros biofísicos, foi feita através de espectrofluorimetria, de dicroísmo circular, de ensaio de precipitação, do método GRID e por dinâmica molecular. A análise in vitro dos parâmetros biológicos, foi realizada por meio de ensaio de hemaglutinação e interação com laminina por ELISA. Resultados e Discussão: A adição de ZnCl2 numa solução de Gal-1 causa aumento da emissão por fluorescência do triptofano e uma alteração para o vermelho, altera o espectro de dicroísmo circular e causa precipitação protéica da Gal-1. Estes eventos ocorreram de forma seletiva e dependente da concentração desse íon. As análises in silico indicam que o provável sítio de complexação Zn/Gal-1 é distinto do CRD e é formado pelos aminoácidos Glu-15, Asp-92 e Asp-134, assumindo a conformação trigonal bipiramidal e tendo número de coordenação igual a 5. Conclusão: As análises biofísicas in vitro e in silico, nos indicam que a Galectina-1 tem a capacidade de se complexar com o íon Zn2+. / Introduction: Galectin-1 (Gal-1) is a multifunctional protein that specifically recognizes glycans with -galactosides through carbohydrate recognition domains (CRD). Gal-1 is a homodimeric protein of 14.900daltons, pI=5.6, shows a jelly-roll molecular topology composed of two anti-parallels - sheet, has no signal peptide and contains 6 cysteines, 7 glutamic acids, 9 aspartic acids and 4 histidines per monomer. This lectin binds to different biological molecules contained in the cell surface, nucleus and extracellular matrix components. Zinc is an important metal in biological systems because can participate in the maintenance of protein structure and biological activity. Usually, cysteine , histidine, glutamic acid and aspartic acid residues are preferential targets for interaction with Zn. Approximately 10% of the human proteome is potentially capable to forming complexes with Zn. The Zn2+ ion exhibits properties suitable for both catalytic and structural protein functions. Proteins zinc binding sites can be divided into catalytic, structural, co-catalytic and protein interface sites.There are reports in the literature that shows the interaction between galectin-1 and organic ions. However, were not found reports about Zn-Gal-1 complexes. Objective: The aim of this study was to evaluate the existence and implications of the interaction between galectin-1 and Zn2+ ion. Materials and Methods: Human recombinant Gal-1 (monomer and dimmer) was obtained and purified. Also, the conditions for the use of Gal-1 were standardized. The interaction Zn/Gal-1 was assessed by biophysical an biological procedures. The analysis in vitro and in silico was made by spectrofluorimetry, circular dichroism, precipitation test, method of GRID, and molecular dynamics. The in vitro analysis of biological parameters were performed by hemmaglutination and laminin binding (ELISA) tests. Results and Discussion: The addition of ZnCl2 in Gal-1 solution causes increased fluorescence emission of tryptophan-70 and a red shift, alters the circular dichroism spectrum and causes precipitation of Gal-1 protein. These events occurred in a selective manner dependent of Zinc concentration. The in silico analysis indicates that the probable site of Zn/Gal-1 complexation is distinct from the CRD and is formed by the amino acids Glu-15, Asp-92 and Asp-134, assuming trigonal bipyramidal conformation and with coordination number equal to 5 . Conclusion: The biophysical in vitro and in silico findings suggests that Galectin-1 has the ability to complex with the Zn2+ ion.

Orientadores: Francisco Carlos Groppo, Maria das Graças Machado Freire / Dissertação (mestrado profissional) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-06T09:31:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_MaraRubeaTinocoRodriguesde_M.pdf: 229602 bytes, checksum: 5369ca1218480e5687d9ee3827b671ce (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: A medicina natural e complementar, especialmente a fitoterapia, suprem as necessidades em saúde de grande parte da população, particularmente nos países em desenvolvimento. Dentre os fitoterápicos, as lectinas podem ter valia como agentes antiplaca, uma vez que podem estar intimamente relacionadas com a aderência de microrganismos. O objetivo deste estudo foi testar in vitro a capacidade de inibição das lectinas isoladas (TEL - derivada da semente de Talisia esculenta e LABRAMIN - purificada da planta Labramia bojeri), na adesão e crescimento de microrganismos orais (Streptococcus sanguinis, S. mitis, S. oralis, S. mutans, S. sobrinus). A atividade antimicrobiana das duas lectinas foi determinada pelo teste convencional da macrodiluição de caldo, sendo testada as concentrações de 400, 200, 100, 50, 25 µg/mL contra 105 CFU/mL dos microrganismos em estudo. Os tubos foram incubados (10% CO2, 37oC, 18h) e submetidos à leitura de densidade óptica (OD a 600nm). A MBC foi determinada pela adição das amostras de cada tubo em placas de petri contendo agar BHI (10% CO2, 37oC, 18h). Para avaliação de aderência foi feito um ensaio semiquantitativo de aderência em placas de microtitulação de poliestireno, onde foi adicionado 100 µL de saliva clarificada e incubada por 2h a 37°. Após lavagem com PBS, foram adicionadas às placas em triplicata 100 µL de lectinas (6.25, 12.5, 25, 50 e 100 µg/mL) e incubados durante 1h. A seguir foi adicionada 100 µL de suspensão bacteriana (106 UFC/mL) e incubado a 37ºC em uma atmosfera de 10% de CO2. A aderência foi revelada e quantificada por tintura com cristal violeta. A absorção do cristal violeta foi determinada por um leitor de placa (575nm). Nem a TEL nem a LABRAMIN foram capazes de inibir ou matar os microorganismos estudados. No teste de inibição de aderência, a LABRAMIN reduziu significativamente a aderência de S. mutans e S. sobrinus, na concentração de 100µg (p< 0,05). A TEL não inibiu a aderência dos estreptococos e ainda favoreceu a aderência do S. mitis. Concluiu-se que embora nenhuma das lectinas estudadas tenham atividade antimicrobiana, a LABRAMIN foi capaz de inibir a aderência de estreptococos cariogênicos / Abstract: Natural and complementary medicine, with special regard to phytotherapy, provide care for health needs of a great part of the world¿s population, particularly in developing countries. Among phytotherapic compounds, lectins could be of value as anti-plaque agents, once they can be closely related to microorganisms¿ adherence. Our study intended to test, in vitro, the capacity of two isolated lectins ¿ TEL (derived from Talisia esculenta seeds) and LABOL (purified from the plant Labramia bojeri ¿ for inhibiting the adherence and growth of oral microorganisms (Streptococcus sanguinis, S. mitis, S. oralis, S. mutans, S. sobrinus). Both lectins¿ antimicrobial activities were determined by a conventional macrodilution broth test. Study¿s microorganisms concentrations were tested for 400, 200, 100, 50, 25 µg/mL against 105 CFU/mL. Tubes were incubated (10% CO2, 37oC, 18h) and submitted to optical density reading (OD at 600nm). MBC was determined by the addition of samples from each tube to petri dishes containing agar BHI (10% CO2, 37oC, 18h). A semiquantitative assay was performed for adherence assessment in polystyren microtiter plates. A hundred microliter (100µL) of clarified saliva were added and incubated for 2h at 37°. Following PBS wash, 100 µL lectins (6.25, 12.5, 25, 50 e 100 mg/mL) were added to the triple plates and incubated for 1h. Then, 100 µL of bacterial suspension (106 UFC/mL) were added and incubated at 37ºC in a 10% CO2 atmosphere. Adherence was revealed and quantified by crystal violet staining. A plate reader (575nm) determined crystal violet absorbance. Nor TEL nor LABOL were able to inhibit or kill the studied microorganisms. Regarding adherence inhibition, 100µg concentration of LABOL showed statistically significant (p < 0.05) on S.mutans and S. sobrinus. TEL did not inhibt streptococci adherence; yet, it favored S. mitis adherence. It was concluded that, although none of the studied lectins had presented antimicrobial activity, LABOL was capable of inhibiting cariogenic streptococci adherence. Further studies will be necessary to assess such lectins¿ potential over other microorganisms and over oral biofilm / Mestrado / Mestre em Odontologia em Saúde Coletiva

Orientador: Maria Ligia Rodrigues Macedo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-06T16:03:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Coelho_MirelaBatista_D.pdf: 2076971 bytes, checksum: 2ad2d77c61af65420ba1c0a4c66e5571 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: As lectinas são um grupo de proteínas e/ou glicoproteínas que se ligam específica e reversivelmente a carboidratos. Estudos têm demonstrado que essas proteínas possuem importantes atividades biológicas como atividade inseticida contra insetos e respostas imunológicas e fisiológicas em animais. Neste trabalho, tivemos como objetivos comparar os efeitos da lectina de sementes de Annona coriacea (ACLEC), com massa molecular de aproximadamente 14 kDa, sobre o desenvolvimento dos lepidopteras Anagasta kuehniella e Corcyra cephalonica assim como o estudo dos índices nutricionais desses insetos, e investigar a habilidade dessa lectina em induzir a migração de leucócitos em camundongos e os mecanismos farmacológicos delineadores desse processo, utilizando peritonite como modelo experimental. Os resultados da atividade inseticida de ACLEC mostraram que a lectina não produziu efeitos significativos sobre a sobrevivência e o peso larval de Corcyra cephalonica alimentada em dieta contendo até 2,0% de ACLEC, porém, para Anagasta kuehniella, em uma dieta artificial contendo 1,5% e 1,0% de ACLEC produziu um LD50 e WD50, respectivamente. Os resultados dos experimentos do consumo alimentar dos insetos apresentaram apenas uma redução na eficiência de conversão do alimento ingerido (ECI) e do alimento digerido (ECD) em larvas de A. kuehniela. A presença de ACLEC (2,0%) na dieta alimentar em ambos os insetos não modificou a digestibilidade aproximada (AD), mas promoveu um aumento no custo metabólico (CM) e um aumento da atividade proteolítica nas fezes do lepidóptero A. kuehniella. Este mecanismo pode promover uma modificação no meio ambiente da membrana e consequente disrupção do mecanismo de reciclagem ede enzimas, idicando a possibilidade de utulizar esta lectinas como uma estratégia biotecnológica para o manejo de insetos. Para a análise da atividade proinflamatória de ACLEC, camundongos Swiss machos foram injetados intraperitonealmente com ACLEC (3-100 µg/cavidade), de 4 a 96 h e logo após a contagem de leucócitos no fuído do lavado peritoneal foi avaliado. ACLEC induziu uma acumulação de neutrófilos dose-dependente, alcançando a respsota máxima a 16 h após a injeção (aproximadamente um aumento de 40x para 30 µg/cavidade). Uma significante acumulação de células mononucleares foi observada a 72 h (aumento de 2,7x). O carboidrato manose aboliu o inlfuxo de neutrófilos, porém sacarose e glicose não tiveram efeito. Dexametasona, o inibidor de ciclooxigenase-2 celecoxibe e o antagonista do receptor PAF PCA4248 significantemente reduziram o influxo de neutrófilos induzido por ACLEC. O antagonista de taquicinina NK1 SR140333, o antagonista de taquicinina NK2 SR48968, o inibidor não seletivo de NO L-NAME, o inibidor seletivo de NOS Aminoguanidina e o inibidor de lipoxigenase AA861 todos falharam em modificar a resposta induzida por ACLEC. Em conclusão, ACLEC é capaz de atrair neutrófilos na cavidade peritoneal de camundongos por mecanismos envolvendo interações da lectinas com o reconhecimento específico de resíduos de manose presentes nas células, induzindo a liberação de mediadores derivados de COX-2 e PAF / Abstract: Lectins are a group of proteins and/or glycoproteins, which exhibit specific and reversible carbohydrate-binding activities. Studies have demonstrated that such proteins possess important biological activities including insecticide activity as well as immunological and physiological responses in animals. In this investigation, our aim was to compare the effects of lectin isolated of Annona coriacea (ACLEC) seeds, with a molecular mass of 14 kDa, on the development of Anagasta kuehiella and Corcyra cephalonica Lepidopteras, as well as the study of their nutritional index. Since plant lectins are known to present inflammatory activity, this study also sought to investigate the leukocyte migration induced by ACLEC, and inflammatory mediators involved in this phenomenon. The results of insecticide activity of ACLEC showed that the lectin did not produce significant effects on survival and weight of C. cephalonica on an artificial diet of 2,0% of ACLEC, however, for A. kuehniella,on an artificial diet containing 1.5% and 1.0% ACLEC, it produced a LD50 and WD50, respectively. The results from dietary utilization experiments carried out with caterpillars presented only a reduction in efficiency of conversion of ingested food (ECI) and digested food (ECD) in A. kuehniella. ACLEC in the diet did not modify the approximate digestibility (AD) of any insect, but an increase of CM (metabolic cost) and an increase of proteolytic activity in the faeces were observed in A. kuehniella. These results indicate that ACLEC possesses an insecticide effect only towards A. kuehniella larvae, possibly through the binding of lectin on chitin components of membrane peritrophic or glycosylated proteins in the insect midgut. This mechanism can promote a change in membrane environment with the consequent disruption of enzyme recycling mechanisms, indicating the possibility of using this lectin in a biotechnological strategy for insect management. To test proinflammatory activity of ACLEC, male Swiss mice were intraperitoneally injected with ACLEC (3-100 µg/cavity), and at 4 to 96 h thereafter the leukocyte counts in peritoneal washing fluid were evaluated. ACLEC induced a dose-dependent neutrophil accumulation, reaching maximal responses at 16 h after injection (approximately 40-fold increase for 30 µg/cavity). Significant accumulation of mononuclear cells was observed at 72 h (2.7-fold increase). The carbohydrate mannose nearly abolished the neutrophil influx, whereas sucrose and glucose had no effect. Dexamethasone, the cyclooxygenase-2 inhibitor celecoxib and the PAF receptor antagonist PCA4248 significantly reduced ACLEC-induced neutrophil influx. The tachykinin NK1 antagonist SR140333, the tachykinin NK2 antagonist SR48968, the non-selective NO inhibitor L-NAME, the selective inducible NOS inhibitor aminoguanidine and the lypoxygenase inhibitor AA861 all failed to modify the ACLEC-induced responses. In conclusion, ACLEC is able to attract neutrophils into the mice peritoneal cavity by mechanisms involving interactions of the lectin with cell-specific mannose recognition, leading to the release of COX-2-derived mediators and PAF / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / As sementes de Platymiscium floribundum Vogel, uma espÃcie pertencente à famÃlia Leguminosae, subfamÃlia Papilionoideae, tribo Dalbergieae, possuem uma lectina manose/N-acetil-D-glicosamina especÃfica, que aglutina eritrÃcitos nativos ou tratados com enzimas proteolÃticas de coelho. A lectina de sementes de P. floribundum foi purificada por precipitaÃÃo com sulfato de amÃnio seguida por cromatografia de afinidade em matriz de Sepharose-manose. Esse procedimento resultou na lectina purificada, nomeada de PFL. O processo de purificaÃÃo da PFL foi monitorado por SDS-PAGE e atividade hemaglutinante especÃfica, observou-se que a lectina purificada à caracterizada por um perfil eletroforÃtico composto por uma Ãnica banda, com massa molecular aparente de aproximadamente 29 kDa, tanto na presenÃa quanto na ausÃncia de um agente redutor. A anÃlise por espectrometria de massa indicou que PFL possui massa molecular de 27.054  2 Da, e teve sua estrutura primaria parcialmente sequenciada atravÃs de espectrometria de massa sequencial. PFL à uma glicoproteÃna e demonstra elevada estabilidade, sendo capaz de manter sua atividade hemaglutinante apÃs exposiÃÃo a temperaturas de atà 60  C por 1 hora e na faixa de pH de 7,0 a 9,0. A PFL nÃo apresentou atividade anti-inflamatÃria.em modelo de edema de pata. PFL foi cristalizada em diferentes condiÃÃes de cristalizaÃÃo. / Platymiscium floribundum Vogel seeds, a species of the Leguminosae family, Papilionoideae subfamily, Dalbergieae tribe, have a lectin mannose/N-acetyl-D-glucosamine specific rabbit erythrocytes that agglutinate native or treated with proteolytic enzymes. The lectin from P. floribundum was purified by precipitation with ammonium sulfate followed by affinity chromatography on Sepharose-mannose. This procedure resulted in a purified lectin, named PFL. PFL purification process was monitored by SDS-PAGE and showed that the purified lectin is characterized by an electrophoretic profile consists of a single band with apparent molecular mass of approximately 29 kDa, in both presence and absence of an reducer agent. The analysis by mass spectrometry indicated that PFL has a molecular mass of 27,054 Da, and its primary structure was partially sequenced. PFL is a glycoprotein and shows high stability, being able to maintain its haemagglutinating activity after exposure to temperatures up to 60 ÂC for one hour and at pH 7.0 to 9.0. The PFL showed no anti-inflammatory activity in paw edema model. PFL was crystallized under different crystallization.

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Les lectines spécifiques du rhamnose ont été découvertes comme nouvelle classe de lectines dans les années 1990. La plupart de ces lectines a été isolée à partir d'animaux aquatiques. Des récepteurs spécifiques du rhamnose sur les kératinocytes ont été découverts en 1991 quand les reconnaissances entre des glycoprotéines synthétiques incorporées dans des liposomes et des kératinocytes ont été étudiées. Nous avons synthétisé des nouveaux dérivés de rhamnose à cibler ces lectines. / Rhamnose binding lectines were discovered as new class of lectines in 1990's. Most of these lectines has been isolated from aquatic animals. It was discovered in 1991 that rhamnose specific receptors may be present in human skin while studying the interaction between liposomes incorating synthesitic glycoproteins and keratinocytes. We have synthesized new derivatives of rhamnose to target these lectines.

Procambarus clarkii hemocytes have been shown to bind to both LPS and a mannose containing neoglycoprotein conjugated to fluorescent probes. A decrease in the observed number of fluorescent hemocytes indirectly indicated that the binding of FITC-LPS to these cells is impaired by initial incubation with LPS. Prior treatment of hemocytes with horseradish peroxidase, a mannose rich glycoprotein, decreased their capacity to bind mannose. Mannan had no inhibitory effect on the binding of either ligand. Mixed hemocytes and hemocyte subpopulations separated by buoyant density were incubated with both ligands and revealed that a subpopulation of granular hemocytes bound both LPS and mannose. These results suggest the possible presence of two different pattern recognition cell surface receptors on this subpopulation of granular hemocytes from the red swamp crayfish, Procambarus clarkii, which may specifically recognize and bind to both LPS from gram-negative bacteria and to mannose containing glycoproteins found on microbial surfaces.

Experiments were conducted to test for ricin content in tissue samples from four castor cultivars, developing castor seed, germinating castor seedlings, and chemically and heat treated seed meal. Ricin content of each sample was examined via Western blotting with ricin A-chain specific antibodies. Results indicate that ricin is present solely within castor endosperm and is not present any other tissues. Samples from developing seed and germinating seedlings indicate ricin production begins around day 28 post pollination, and ricin is absent from the seedling 6 days after the onset of radicle emergence. This would seem to indicate that the purpose of ricin is to protect the seed and not the entire plant. Ricin content of seed meal treated separately with heat and chemicals was tested. It was found that hot-pressing of the seed was sufficient to denature ricin in the seed meal.

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