Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2016-03-04T18:04:54Z No. of bitstreams: 1 Alana Alves Farias Análise da marcação...2015.pdf: 1042656 bytes, checksum: 8c570ad74d5f6150c8fb9527f324b2d4 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2016-03-04T18:05:20Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Alana Alves Farias Análise da marcação...2015.pdf: 1042656 bytes, checksum: 8c570ad74d5f6150c8fb9527f324b2d4 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-04T18:05:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Alana Alves Farias Análise da marcação...2015.pdf: 1042656 bytes, checksum: 8c570ad74d5f6150c8fb9527f324b2d4 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz, Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / ntrodução e objetivos: O glioblastoma multiforme é um glioma de alto grau que apresenta um prognóstico ruim. O diagnóstico definitivo é estabelecido pela avaliação histológica, porém este pode apresentar conflitos na classificação, com isso surge à necessidade de ferramentas que auxiliem o patologista em sua análise. Atualmente, maior ênfase tem sido dada a alterações na glicosilação, pois estão associadas a neoplasias, e a descoberta da capacidade de lectinas em reconhecer tais alterações fez destas, ferramentas aplicáveis para o diagnóstico biomédico. Dessa forma, o objetivo deste trabalho é analisar a marcação das lectinas CpL, WGA e Con A em células da linhagem C6 e astrócitos. Métodos: As células foram cultivadas em condições estéreis, a 37ºC em atmosfera com 5 % de CO2 até atingirem confluência. Em seguida, foram lavadas com PBS e marcadas com as lectinas CpL, WGA e Con A numa concentração de 1 mg/ml, o controle negativo foi obtido com adição do carboidrato inibidor das lectinas (D-galactose, β-N-acetilglucosamina e glicose), respectivamente, numa concentração de 0,1 M. A incubação se deu por uma hora com proteção da luz, a análise foi realizada em microscópio de fluorescência. Para a quantificação em citometria de fluxo, as células foram marcadas obedecendo ao mesmo protocolo anterior, com exceção do tempo de incubação que se deu por 15 minutos. Posteriormente, as células foram lavadas, centrifugadas, transferidas para tubos e ressuspensas em PBS para a realização da leitura em citômetro. Resultados: A lectina CpL apresentou melhor marcação para os astrócitos, porém, ainda assim, mostra baixo desempenho comparado com as demais lectinas. Já a lectina WGA apresentou marcação eficiente tanto para astrócitos quanto para as células C6, esta última apresentou o dobro de emissão. Desta forma, é possível inferir que as lectinas CpL e WGA não são capazes de reconhecer diferenças importantes no perfil de glicoconjugados nas membranas das células C6 e dos astrócitos. Entretanto, a lectina Con A revelou marcação eficiente em relação às células C6 capaz de definir a forma celular, mostrando que há uma distribuição quase uniforme destes carboidratos ao longo da superfície da membrana, e ainda exibiu mediana de fluorescência cerca de 99 vezes superior em relação aos astrócitos. Assim, a Con A mostrou ser um marcador capaz de diferenciar as células da linhagem de glioma murino das células de cultura primária. Conclusão: Com base nestes resultados podemos inferir que a lectina Con A pode auxiliar numa identificação mais eficiente com possibilidade de um diagnóstico mais seguro. / Introduction and objectives: Glioblastoma multiforme is a high-grade glioma that has a poor prognosis. The definitive diagnosis is established by histological assessment. However, this can present conflicts in grading gliomas, which justifies new tools to assist the pathologist in his analysis. Currently, it is known that there are changes in glycosylation pattern of molecules associated with cancer, and the discovery of the ability of lectins to recognize these changes made these tools applicable for biomedical diagnosis. Thus, the aim of this study is to analyze the labelling of C6 and astrocyte lineage cells with fluorescent lectins CpL, WGA and Con A. Methods: The cells were cultured under sterile conditions at 37°C in an atmosphere with 5% CO2 until they reached confluence. They were then washed with PBS and labeled with CpL, WGA, or Con A lectins in a concentration of 1 mg/ml. Negative controls were incubated with the carbohydrate that competitively inhibits the reaction (D-galactose, β-N-acetylglucosamine and glucose, respectively), at a concentration of 0.1 M. The incubation occurred for one hour with protection from the light, the analysis was performed on a fluorescence microscope. For flow cytometry quantitation, cells were labeled following the same previous protocol, except that the incubation time was 15 minutes. Subsequently, the cells were washed, centrifuged, transferred to tubes and resuspended in PBS to carry out the reading on a cytometer. Results: The CpL lectin better labeled astrocytes. However, it showed a poor performance compared to other lectins. On the other hand, the WGA lectin efficiently marked both astrocytes and C6 cells; the latter presented the double emission compared to the former. Thus, it is possible to infer that the CpL and WGA lectins are not able to recognize important differences in the glycosylation profile in the membranes of C6 cells and astrocytes. However, the lectin Con A efficiently marked C6 cells, defining their morphology and showing that there is a nearly uniform distribution of glucose along the surface of the membrane, which was not observed in astrocytes. This also exhibited a median fluorescence about 99 times greater than that obtained for astrocytes. Thus, Con A showed to be a marker capable of differentiate cells of murine glioma lineage from primary astrocytes. Conclusion: Based on these results we can infer that the Con A lectin may be a tool for a more efficient identification of glioma cells in histopathological analysis.

L'objectif de cette thèse a été de contribuer à la compréhension des stratégies d'infection du pathogène opportuniste Aspergillus fumigatus. Ce pathogène est une cause émergente de morbidité et de mortalité chez les patients dont l'immunité est compromise et dans les milieux hospitaliers. Une infection avec Aspergillus est en général appelée une Aspergillose et ellepeut se développer dans un certain nombre d'organes, le plus fréquemment dansl'appareil respiratoire (poumons et sinus). Outre les infections (Aspergillosis invasive), la colonisation par ce champignon peut causer des réactions allergiques (Aspergilloses broncho pulmonaire allergique) et de l'asthme. Le nombre de patients immunodéprimés augmente régulièrement à cause des avancées des traitements du SIDA, du cancer, de la mucoviscidose ainsi que par le nombre grandissant de transplantation d'organes. De nouveaux médicaments antifongiques et des médicaments préventifs sont nécessaires pour venir en soutienaux soins médicaux des patients. Bien que plusieurs fongicides existent déjà sur le marché, l'Aspergillosisinvasive reste souvent fatale. Ceci est lié d'une part à la difficulté d'établir le diagnostic, et d'autre part au fait que des résistances émergent rapidement. La motivation de cette thèse est de comprendre les mécanismes impliqués dans le premier contact entre les conidies et le tissu de l'hôte. Ces mécanismes d'adhésion initiaux sont souvent réalisés par des liaisons entre les lectines et les carbohydrates. Le tissu épithélial et la surface muqueuse du système respiratoire sont couverts de structures possédants des carbohydratestels que les glycoprotéines, les glycolipides et les glycosaminoglycanes. L'identification des lectines d'A. fumigatus et leurs caractérisations devraient dorénavant contribuer à la compréhension de la glycostratégie de ce pathogène opportuniste ainsi que des mécanismes impliqués dans l'adhésion et l'infection. L'analyse détaillée de la structure des lectines permettra d'établir le rôle de cesprotéinesdans la virulence et de guider la conception de glycomimétiques, afin d'inhiber le phénomène d'adhésion. Cettenouvelle approche consistant à bloquer l'adhésion de l'agent pathogène plutôt que sa prolifération, vise à diminuer les résistances par une réduction de la pression évolutive. Deuxstratégies différentes ont été utilisées pouridentifier de nouvelleslectines. Tout d'abord une purification des lectinesà partir d'extraits fongiques brutsa été tentée et d'autre part un criblage pour trouver des séquences similaires avec les protéines codées par A. fumigatusa été réalisé parmi une banque de lectines fongiques connues. / The aim of this thesis was to contribute to the understanding of infection strategies of the opportunistic pathogen Aspergillusfumigatus. This pathogenic mould is an emerging cause of morbidity and mortality in immuno-compromised patients and hospital environments. An infection with Aspergillus is generally referred to as Aspergillosis; it can develop in a variety of organs but the most common sites are the respiratory apparatus i.e. lungs and sinuses. Besides infections (invasive aspergillosis), colonization with the fungus can cause allergic reactions (allergic broncho pulmonary aspergillosis) and asthma. The number of immuno-suppressed patients is steadily increasing due to advancement in the HIV, cancer and cystic fibrosis medical care, as well as an increasing number of organ transplantations. Needless to say that new antifungal drugs and preventive medication is desperately needed to support medical care for those patients. Even though several fungicides already exist on the market, invasive aspergillosis remains to be often fatal. On one hand, this is due to difficulties in diagnosis and on the other hand, resistances are emerging rapidly. The motivation behind this thesis is to understand the underlying mechanisms that are involved in the first contact between conidial spores and host tissues. Initial adhesion steps often involve carbohydrate binding proteins, called lectins. They recognize glycoconjugates such as glycoproteins, glycolipids and glycosaminoglycans which cover the epithelial tissue and mucosal surface of the respiratory tract.. Identification and characterization of the lectins from A. fumigatus will therefore contribute to the understanding of the glycostrategy of this opportunistic pathogen and of the mechanisms involved in adhesion and infection. Detailed structural analysis of the carbohydrate-protein interactions will allow ascertaining the lectins role in virulence and guide the design of glycomimetics, as adhesion inhibitors. With this novel approach of targeting the pathogen adhesion rather than its proliferation, resistances are believed to be less frequent due to the lack of evolutionary pressure. In this work, two different strategies were employed to obtain novel lectins. Firstly, lectins were purified from crude fungal extracts and secondly the A. fumigatus genome was screened for encoded proteins showing sequence similarity with known fungal lectins. While lectin purification from the crude extracts was inconclusive due to low lectin activity in the starting material, genome screening showed that several putative lectins were present. One of these lectins, named AFL6, belonged to the cyanovirin-N homolog (CVNH) family and it was recombinantly expressed and purified. Glycan array and micro calorimetry techniques were carried out to investigate its carbohydrate binding specificityand the three dimensional structure was determined using X-ray crystallography. The structure showed an overall similarity with other CVNHs with slight differences in the presumed carbohydrate binding sites. Unlike other family members, it shows a low affinity for mannosides and an apparent affinity for lactosamine containing glycan structures.

Submitted by FABIANA DA SILVA FRANÇA (fabiana21franca@gmail.com) on 2017-11-09T15:00:32Z No. of bitstreams: 2 arquivototal.pdf: 1702586 bytes, checksum: 5715389a3db42245325c62c222830c1c (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-11-09T15:00:32Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivototal.pdf: 1702586 bytes, checksum: 5715389a3db42245325c62c222830c1c (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016-11-25 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Cancer is one of the biggest public health problems in the world, being the second cause of death worldwide. The search for new compounds that selectively promote cancer cells death is becoming a constant, as a strategy in the treatment of the disease. Lectins are a class of glycoproteins that recognize and bind specifically to carbohydrate clusters expressed on the plasma membrane. Carbon nanotubes have been gaining considerable attention because they are promising nanocarriers, enabling the conjugation of several molecules on their surface, improving drug delivery and specific cell recognition. In the present work, the cytotoxic activity of Concanavalin A and CFL lectins on chronic monocytic (K562) and acute monocytic (THP-1) promyelocytic leukemia cells was investigated. To evaluate cell viabillity, the MTT salt reduction was used, which show the metabolic ability of the cell to convert that salt to crystals. It was observed that lectins reduces the viability of the two tested cells lines. However, this cytotoxic effect was observed only after 72 hours of treatment. The lectins were also cytotoxic to non-cancerous HUVEC endothelial cells, but this response may have been due to the fact that these cells have several glycoconjugates expressed in their membrane. Using the trypam blue dye, which marks only cells with broken membranes, then unviable cells, it was also observed that the lectin-nanotube conjugate had no significant activity compare to that demonstrated by the lectin alone, suggesting that the nanotubes do not seem to improve the effect of the lectins. Investigating which way of death these lectins were activating by flow cytometer assays, it was observed that the cells demonstrate positive labeling for propidium iodide, indicating that the treatment of 72 hours caused damage to the cell membrane. However, using the tetramethylrhodamine methyl ester probe, it was seen that treatment with the lectins caused mitochondrial depolarization on K562 and THP-1 cells, a factor related to apoptosis. In addition, CFL lectin caused cell cycle arrest of THP-1 cells, promoting accumulation of cells in the G0/G1 phase. Thus, it was concluded that Concanavalin A and CFL lectins demonstrate a cytotoxic effect on leukemic cells, possibly through the induction of cell death by apoptosis in cells, due to the depolarization of the mitochondrial membrane, possibly blocking the expression of cyclins and CDKs, promoting cell cycle arrest in THP-1 cells. In K562, treatment with CFL for 72 hours may be activating some extrinsic pathway of apoptosis by membrane receptor, leading to depolarization of the mitochondria and consequently releasing apoptogenic factors, but without promoting cell cycle arrest. In this way, the lectins studied demonstrate an interesting antileukemic potential. / O câncer representa um dos maiores problemas de saúde pública mundial, sendo a segunda causa de morte em todo o mundo. A busca por novos compostos que promovam a morte seletiva de células cancerígenas vem se tornando constante, como uma estratégia no tratamento da doença. As lectinas constituem uma classe de glicoproteínas que reconhecem e se ligam especificamente à grupamentos de carboidratos expressos na membrana plasmática. Os nanotubos de carbono vêm ganhando bastante atenção por serem nanocarreadores promissores, possibilitando a conjugação de diversas moléculas em sua superfície e aumentando a eficácia no transporte e a especificidade no reconhecimento celular. No presente trabalho, foi investigada a atividade citotóxica das lectinas Concanavalina A e CFL sobre linhagens de células de leucemia promielocítica crônica (K562) e monocítica aguda (THP-1). Para avaliar a viabilidade celular, foi utilizando o ensaio de redução do sal de MTT, o qual avalia a capacidade metabólica da célula converter esse sal em cristais, foi observado um efeito citotóxico das lectinas nas duas linhagens testadas. Entretanto, só foi observada diminuição da viabilidade apenas após 72 horas de tratamento com as lectinas. As lectinas também foram citotóxicos às células endoteliais HUVEC, não cancerígenas, porém essa resposta pode ter se dado pelo fato de essas células apresentarem diversos glicoconjugados na sua membrana. Foi também observado, por meio do teste de incorporação do corante azul de tripam, o qual marca apenas em células com membrana rompida, que o conjugado lectina-nanotubo não apresentou atividade diferente da demonstrada pela lectina sozinha frente as linhagens celulares, sugerindo que os nanotubos parecem não melhorar o efeito das lectinas estudadas. Investigando qual a via de morte ativada pelas lectinas por meio de ensaios de citometia de fluxo, foi observado que as células marcaram positivamente para o iodeto de propídeo, indicando que o tratamento de 72 horas causou danos à membrana celular. Entretanto, utilizando a sonda tetrametilrodamina metil-éster, foi visto que o tratamento com as lectinas causou a despolarização da membrana mitocondrial das células K562 e THP-1, fator relacionado à apoptose. Além disso, a lectina CFL causou a parada do ciclo celular de células THP-1, promovendo um acúmulo de células na fase G0/G1. Dessa forma, concluiu-se que as lectinas Concanavalina A e CFL demonstram efeito citotóxico às células leucêmicas, possivelmente pela indução da morte celular por apoptose nas células, devido a despolarização da membrana mitocondrial, possivelmente bloqueando a expressão de ciclinas e CDKs, promovendo parada no ciclo celular de células THP-1. Já em células K562, o tratamento com a CFL por 72 horas pode estar ativando alguma via extrínseca de apoptose por receptor de membrana, levando a despolarização da mitocôndria e consequentemente liberando fatores apoptogênicos, mas sem promover parada no ciclo celular. Desta forma, as lectinas estudadas demonstram um interessante potencial antileucêmico.

Made available in DSpace on 2015-04-01T14:16:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 1211143 bytes, checksum: 23a2b34a9ee3ee070ebfce58519b026d (MD5) Previous issue date: 2013-05-24 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Canavalia brasiliensis belongs to the family of Leguminosae and known as feijão-bravo-do-Ceará, it s a species from Americas. In Brazil it can be found in the North, Northeast, Midwest and Southeast. Many species of plant contain carbohydrate-binding proteins which are commonly called lectins or agglutinins which are distributed in virtually all living organisms. That study aimed to detect, purify and characterize physico-chemically a ConBr new lectin from extract of the seeds of C. brasiliensis and to evaluate its relationship with pathogenic bacteria and inflammatory processes. The lectin, with affinity for rabbit erythrocytes, was isolated by affinity chromatography on matrix Sephadex G-50 followed by chitin, and molecular exclusion in HPLC system. The purity and the molecular weight of the lectin were determined by SDS-PAGE. The protein was characterized as to the nature glycoprotein, the specific sugars and glycoproteins, resistance to pH, temperature, denaturing agents, reducing, oxidizing and chelating agents. The lectin on SDS-PAGE showed two bands of 25 and 45 kDa and a content of 47 μg of carbohydrates. It was specific for mannose, fructose and maltose. It was inactivated when heated to 90 °C and 100 °C for 10 minutes and at pH 5,0 and 13.0. It had reduced their activity in the presence of urea 4 and 8 M and sodium metaperiodate, and increased with β-mercaptoethanol. It s a metalloprotein which depend of Mg2+ for stabilizing its carbohydrate biding site. It didn t present activity against Bacillus subtilis ATCC 0516, Escherichia coli ATCC 10536, Pseudomonas aeruginosa ATCC 8027, P. aeruginosa ATCC 25619, Staphilococcus aureus ATCC 6538 e S. aureus ATCC 25925 and in the carrageenan-induced peritonitis model in mice, the lectin didn t have toxicity to animals and showed anti-inflammatory effect reducing the blood vessel permeability and migration of neutrophils in the peritoneum of mice. / Canavalia brasiliensis pertence à família Leguminosae e sendo conhecida como feijão-bravo-do-Ceará, é uma espécie predominante do Continente Americano. No Brasil pode ser encontrada nas regiões Norte, Nordeste, Centro-Oeste e Sudeste. Muitas espécies de plantas contêm proteínas de ligação a carboidratos as quais são comumente chamadas de lectinas ou aglutininas as quais são distribuídas em praticamente todos os organismos vivos. O referido trabalho objetivou detectar, purificar e caracterizar fisico-quimicamente uma nova lectina ConBr do extrato das sementes de C. brasiliensis e avaliar sua relação com bactérias patogênicas e processos inflamatórios. A lectina com afinidade por eritrócitos de coelho foi isolada através de cromatografia de afinidade em matriz de sephadex G-50 seguida de quitina; e exclusão molecular em sistema HPLC. O grau de pureza e o peso molecular da lectina foram determinados por eletroforese SDS-PAGE. A proteína foi caracterizada quanto à natureza glicoproteica, especificidade a açúcares e glicoproteínas, resistência ao pH, temperatura, agentes desnaturantes, redutores, oxidantes e quelantes. A lectina apresentou na SDS-PAGE duas bandas de 25 e 45 kDa e um teor de 47 μg de carboidratos. Foi específica para manose, frutose e maltose. Foi inativada quando aquecida a 90 °C e 100 °C durante 10 minutos e em pH 5,0 e 13,0. Teve sua atividade reduzida na presença de ureia 4 e 8 M e do metaperiodato de sódio; e aumentada com o β-mercaptoetanol; é uma etaloproteína dependente de Mg2+ para a estabilização do seu sítio de ligação a carboidratos. Não apresentou atividade frente às bactérias Bacillus subtilis ATCC 0516, Escherichia coli ATCC 10536, Pseudomonas aeruginosa ATCC 8027, P. aeruginosa ATCC 25619, Staphilococcus aureus ATCC 6538 e S. aureus ATCC 25925 e no modelo de peritonite induzido por carragenina em camundongos, a lectina não se mostrou tóxica para os animais e exibiu efeito antiinflamatório através da redução da permeabilidade dos vasos sanguíneos e da migração dos neutrófilos no peritôneo dos animais.

Made available in DSpace on 2015-04-01T14:16:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 2925990 bytes, checksum: c09f8e05395a813c660d9c2568ea71c5 (MD5) Previous issue date: 2014-08-15 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Legume lectins are historically recognized as carbohydrate-binding proteins, and this property is roughly linked to the majority of their biological activities, such as pro and antiinflamatory processes, apoptosis and mitogenic mechanisms. However, several studies have demonstrated the capability of these proteins to bind diverse other compounds, such as phytohormones and hydrophobic molecules, although the biological relevance of these interactions remains elusive. Many biological reactions involve proteins interactions with nucleic acids and the protein interaction with DNA plays a key role in the cellular regulation and all vital functions. In the present work, it is reported the crystal structure of ConM, a lectin isolated from Canavalia maritima seeds, in complex with Interleukine 1β primer. A cubic crystal, belonging to the F23 space group, was obtained by the diffusion vapor method and submitted to X-ray diffraction. In the structure, an electron density map corresponding to four nucleotides from the interleukin-1β primer was found in the interface of ConM non-canonical dimer. The nucleotides stabilization involves H-bonds and electrostatic forces with the amino acids His127, Ser110, Lys114, Ser190, Asp192, Thr194, His51 and Ser190. Based on these crystallographic results and in a molecular docking simulation, it is hypothesized that the lectin may function as a transcription factor, which could help us to understand some of their biological activities. / Lectinas de leguminosas são historicamente reconhecidas como proteínas de ligação a carboidratos e essa propriedade é ligada à maioria das suas atividades biológicas, tais como pró e antiinflamatórias, apoptose e mecanismos mitogênicos. No entanto, vários estudos demonstraram a capacidade destas proteínas de se ligarem a diversos outros compostos, tais como fitohormônios e moléculas hidrofóbicas, embora a relevância biológica destas interações permaneça indefinida. Muitas reações biológicas envolvem a interação de proteínas com ácidos nucleicos e a interação da proteína com o DNA desempenha um papel chave em toda a regulação celular e das funções vitais. No presente trabalho relatamos a estrutura cristalina da ConM, uma lectina isolada de sementes de Canavalia maritima, em complexo com o primer da Interleucina 1β. Um cristal cúbico, pertencente ao grupo espacial F23, foi obtido através do método da difusão de vapor e submetido à difração de raios X. Na estrutura, o mapa de densidade eletrônica correspondente a quatro nucleotídeos do primer da interleucina-1β foi encontrado na interface do dímero não-canônico. A estabilização dos nucleotídeos envolve pontes de hidrogênio e forças eletrostáticas com os aminoácidos His127, Ser110, Lys114, Ser190, Asp192, Thr194, His51 e Ser190. Com base nestes resultados cristalográficos e em uma simulação de docking molecular, é hipotetizado que a lectina pode funcionar como um fator de transcrição, o que poderia nos ajudar a entender algumas de suas atividades biológicas.

Purpose: Lectins play an important role in many biological processes. The aim of this work was to analyse mainly the expression of endogenic lectins, such as galectins and plant lectin, e.g. Dolichos biflorus agglutinin (DBA), and their glycoligands in the tear fluid, human corneal and conjunctival epithelium in physiological and disease conditions. Further, we studied the human natural antibody against Galα1,3Gal-R, which is mainly responsible for hyperacute rejection of xenografts transplants. We tried to investigate its localization in human corneal epithelium, lacrimal gland and tears. Material and Methods: Human tissue (lacrimal gland, tear fluid, conjunctiva, cornea, epidermis, keratinocyte and cultured corneal epithelium), as well as porcine tissue (cornea, liver and epidermis) were examined. Endogenous galectins (galectins-1, -3 and -7) were detected using immunohistochemistry methods. Binding sites for galectins, as well as binding sites for plant lectin Dolichos biflorus agglutinin, were localized by lectin histochemistry. Reverse lectin histochemistry was used for the study of binding reactivity of endogenous lectins using labelled (neo)glycoligands. Employing biotinylated natural human IgG anti -galactosides, as well as anti -galactosides, we detected reactive epitopes in human...

Este trabalho trata da purificação em escala preparativa por técnicas cromatográficas, determinação de seqüência primária parcial, caracterização espectroscópica por dicroísmo circular, fluorescência, infravermelho e investigação de atividades biológicas de duas lectinas ligantes de quitina dos extratos salinos de Artocarpus integrifolia, jaca, e Artocarpus incisa, fruta-pão. Nossos resultados revelaram que as lectinas quitina-ligantes das sementes de jaca e fruta-pão, jackina e frutackina respectivamente, são homólogas entre si, constituindo-se por monômeros de cerca de 14 kDa formados por três subunidades, unidas por pontes S-S. Elas possuem 62% de identidade entre si, são ricas em cisteínas, aminoácidos básicos e serinas e não possuem similares identificadas até o momento, podendo constituir um novo grupo de lectinas na superfamília de lectinas quitina-específicas. Os espectros de dicroísmo circular de jackina e frutackina são similares: ambas são proteínas de estrutura toda-beta, com máximo em torno de 230 nm e mínimo em torno de 214 nm, este último, bastante distorcido por estruturas desordenadas. Os espectros de fluorescência de jackina e frutackina apresentaram máximos de emissão acima de 340 nm, sugerindo que os N-terminais de duas das 3 cadeias de jackina e frutackina (onde os triptofanos estão localizados) estão expostos. Frente a condições extremas de pH e temperatura, monitoradas por CD e fluorescência, observou-se que a estrutura de jackina é vulnerável a pH ácido e termicamente estável. Quanto às atividades biológicas, jackina e frutackina mostraram atividade inibitória de crescimento para Saccharomyces cerevisiae; jackina também mostrou promoção de adesão da linhagem de células de eritroleucemia K562, atividade inibitória para Fusarium moniliforme na concentração de 2,25 mg/mL e atividade hemaglutinante frente a células sangüíneas humanas do sistema ABO e de coelhos, que não foi inibida nem por N-acetilglicosamina, indicando sua preferência por quitina ou seus fragmentos. / This work deals with the preparative-scale purification by chromatographic techniques, the partial primary sequence determination, the spectroscopic characterization by circular dichroism, fluorescence, FT-IR and the investigation of biological activities of two novel chitin-binding lectins from the saline extracts of the seeds of Artocarpus integrifolia, jackfruit, and Artocarpus incisa, breadfruit. Our results revealed that the chitin-binding lectins from jackfruit and breadfruit, jackin and frutackin respectively, are homologous to each other, consiting of monomers of 14 kDa, made up of 3 subunits, linked by S-S bridges. They have 62% of identity between each other; they are rich in cysteines, serines and basic amino acids and they are no homologous to any other known protein, probably constituting a new group of lectins in the chitin-binding lectin superfamily. The CD spectra of jackin and frutackin are similar: both present a beta profile spectra, presenting a maximum about 230 nm and a minimum around 214 nm, this later one, distorted by unordered structures. The fluorescence spectra of jackin and frutackin presented maxima above 340 nm, suggesting that the N-terminals of the 2 up 3 chains of jackin and frutackin (where the tryptophans are) are exposed. Regarding the pH and temperature exposure, monitored by CD and fluorescence, it was observed that the structure of jackin is vulnerable to acid pH and thermally stable. When considered the biological activities, jackin and frutackin presented growth inhibition activity towards Saccharomyces cerevisiae; jackin also promoted the adhesion of the erythroleukemic cell line K562, presented growth inhibition activity towards Fusarium moniliforme at 2,25mg/mL and hemaggluting activity towards rabbit and human red cells from the system ABO, that was not inhibited even by N-acetilglucosamine, suggesting itspreference by oligomers of N-acetilglicosamine or chitin.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Biofilmes sÃo comunidades microbianas que encontram-se irreversivelmente associadas a uma superfÃcie e estÃo inseridas em uma matriz polimÃrica produzida por elas mesmas. Os biofilmes estÃo comumente relacionados a infecÃÃes nosocomiais que apresentam maior resistÃncia a agentes antimicrobianos quando comparadas com cÃlulas planctÃnicas, dificultando assim seus tratamentos e limitando as opÃÃes terapÃuticas. Nesse sentido a busca por novas molÃculas com aÃÃo antimicrobiana e antibiofilme tornou-se uma Ãrea ativa na pesquisa cientÃfica. Os vegetais sÃo fontes de uma variedade de molÃculas com propriedades antimicrobianas, dentre estas podemos citar as lectinas e os metabÃlitos secundÃrios. Diversos estudos tÃm relatado a aÃÃo antimicrobiana e antibiofilme dessas classes de molÃculas como forma alternativa ao uso de antibiÃticos. Assim, o objetivo desse trabalho foi avaliar a aÃÃo antimicrobiana e antibiofilme de diversas lectinas isoladas de leguminosas e algas, bem como de dois metabÃlitos secundÃrios isolados de plantas, derriotusona A (isolado de Lonchocarpus obtusus) e diterpeno casbano (isolado de Croton nepetaefolius). Os resultados demonstraram que algumas das lectinas testadas foram capazes de inibir o crescimento planctÃnico e/ou a formaÃÃo de biofilme de determinados micro-organismos. A lectina isolada de Vaitarea macrocarpa (VML) mostrou ser a lectina mais promissora, mostrando forte aÃÃo sobre o crescimento planctÃnico e formaÃÃo de biofilmes de Staphylococcus aures e Staphylococcus epidermidis. Derriobstusona A mostrou uma potencial aÃÃo antibacteriana e antibiofilme sobre S. aureus, enquanto que, Escherichia coli apresentou menor sensibilidade ao composto. Em adiÃÃo, derriotusona A demonstrou uma potencial aÃÃo antioxidante. Em relaÃÃo ao diterpeno casbano, em geral o composto foi capaz de inibir o crescimento planctÃnico, formaÃÃo de biofilmes e causar danos nos biofilmes prÃ-formados de S.aures, S. epidermidis, Candida albicans e Candida glabrata, e mostrou ainda ser efetivo contra biofilmes formados pela associaÃÃo entre estas bactÃrias e leveduras. Em conclusÃo, os resultados mostraram que algumas lectinas, assim como os metabÃlitos secundÃrios utilizados nesse estudo, podem ser consideradas potenciais agentes antimicrobianas e antibiofilmes, sugerindo assim o uso dessas molÃculas no tratamento de infecÃÃes associadas a diferentes micro-organismos. / Biofilms are microbial communities that are irreversibly attached to a surface and are embedded in a polymeric matrix produced by them. Biofilms are commonly related to nosocomial infections that showing an enhanced resistance to antimicrobial agents compared to planktonic cells, thus hindering their treatments and limiting therapeutic options. In this context, the search for new molecules with antimicrobial and antibiofilm action has become an active area of research. The plants are sources of a variety of molecules with antimicrobial properties, among them we can mention the lectins and secondary metabolites. Several studies have reported the antimicrobial and antibiofilm action of these molecules classes as an alternative to antibiotics. Thus, the aim of this study was to evaluate the antimicrobial and antibiofilm of various lectins isolated from leguminous and algae, as well as two secondary metabolites isolated from plants , derriotusone A (isolated from Lonchocarpus obtusus) and casbane diterpene (isolated from Croton nepetaefolius). The results showed that some lectins tested were able to inhibit the planktonic growth and/or the biofilm formation of certain microorganisms. The lectin isolated from Vaitarea macrocarpa (VML) showed to be the most promising lectin, showing strong action on the planktonic growth and biofilm formation of Staphylococcus aures and Staphylococcus epidermidis. The derriobstusone A showed potential antibacterial and antibiofilm activite on S. aureus, whereas Escherichia coli showed lower sensitivity to the compound. In addition, derriotusone showed a potential antioxidant activity. Regarding to casbane diterpene, in general the compound was able to inhibit planktonic growth, formation of biofilms and disrupt the preformed biofilms of the S.aures, S. epidermidis, Candida albicans and Candida glabrata, and also showed to be effective against biofilms formed by the association between these bacteria and yeasts. In conclusion, the results showed that some lectins, as the secondary metabolites used in this study, may be considered as potential antimicrobial and antibiofilm agents, thus suggesting the use of these molecules in the treatment of infections associated with different microorganisms.

CoordenaÃÃo de AperfeÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / The number of cases of morbidity and mortality in patients with chronic wounds has increasing every year. In this sense, wound healing has become one the major dermatological problems. Secondary metabolites from plants have been used in several assays as promising molecules on various diseases attracted importance on treatment of various diseases. However, there are few data about it effect on wound healing. Combretum leprosum Mart. is a native species of the Caatinga and its ethanolic extract is commonly used as a healing agent, as a sedative and treatment of haemorrhages. A of the aim of the study was to evaluate the effect of triterpene 3β, 6β, 16β-trihydroxylup-20(29)-ene (CLF-1) isolated from ethanolic extract from the leaves of Combretum leprosum on skin wounds induced in vitro and in vivo lesions was avaluated. In vitro assay, the CLF-1 (2.5 μg/mL) not showed toxicity to human dermal fibroblasts (HDF). Moreover, the CLF-1 induced fibroblasts migration to the healing of the artificial injury with most effectiveness than control at 24h. In addition, the molecular mechanism of the CLF-1 treatment was studied. The results suggest that migration of fibroblasts occurs by upregulated expression of TGF-β1 and reduced levels of the inflammatory cytokine TNF-α. In the in vivo study, experimental skin lesions were created in the back of mice and treatment with the ethanolic extract from C. leprosum (EECL) and CLF-1 was evaluated for 12 days. The treatment with EECL and CLF-1 induced a faster and more effective epithelialization when compared to control. The histopathological assessment showed that EECL and CLF-1 has similar profiles during the regenerative process. This result suggest that probably the active component in the EECL may be CLF-1. Beyond of the spend about the wound healing chronic diseases as cancer are estimated as one of the main causes of dead and one of the main spending factors to the health systems. The conventional treatments, such as surgery, chemotherapy and radio are effective against primary tumors, hence not have the same effect in the later stages of the disease. In this sense, several biomolecules has attracted interest from the researchers because its antitumor potential. Marine sponjes are a biological reservoir of biomolecules, especially lectins. Lectins are proteins that bind reversibel way to carbohydrate epitops without modified them. Unlike plant lectins, there are few reports describing the mechanism of action of lectins from marine sponges to induce apoptosis in tumor cells. The effect of a lectin isolated from the marine sponge Haliclona caerulea (H3) on human breast cancer MCF-7 cell line was evaluated. H3 caused MCF7 cell reduction of viability in more than 50% (IC50=100 μg/ml) at 6h, 24h and 48h. However, on normal cells, the treatment with H3 induced a reduction in over 50% only at the highest dose tested (500 μg/ml). Furthermore, H3 provoke arrest in the G1 cell cycle phase and induce MCF7 cells apoptosis in 24h and 48h. Lysotracker Red and real-time qPCR assays suggest that effect of H3 may be related to a dynamic balance between apoptosis and autophagic cell death mediated by increase of expression of caspase-9 and LC3. In conclusion, the results suggest that CLF-1 and H3 lectin may be promising biomolecules to treatment of acute and chronic wounds and rare diseases like cancers. / O nÃmero de casos de morbimortalidade em pacientes com feridas crÃnicas vem aumentando a cada ano. Nesse sentido, a cicatrizaÃÃo de feridas tem se tornado um dos principais problemas dermatolÃgicos. MetabÃlitos secundÃrios de plantas tem sido utilizados em vÃrios estudos como molÃculas promissoras no tratamento de vÃrias patologias. Entretanto, sÃo poucos os dados sobre seu efeito na cicatrizaÃÃo de feridas. Combretum leprosum Mart. à uma planta nativa da Caatinga e seu extrato etanÃlico à bastante utilizado na medicina popular para cicatrizaÃÃo de feridas, como sedativo ou tratamento de hemorragias. Um dos objetivos do presente trabalho foi avaliar o efeito do triterpeno 3β, 6β, 16β-trihydroxylup-20 (29)-ene (CLF-1) isolado do extrato etanÃlico de folhas de Combretum leprosum sobre lesÃes induzidas in vitro e in vivo. No ensaio in vitro, o CLF-1 (2,5 μg/mL) nÃo apresentou toxicidade a fibroblastos dermais humanos (HDF). AlÃm disso, o CLF-1 induziu a migraÃÃo de fibroblastos para o fechamento da lesÃo artificial de maneira mais efetiva, comparado ao controle, em 24h. AlÃm disso, o mecanismo molecular do efeito do CLF-1 foi estudado. Os resultados sugerem que a migraÃÃo de fibroblastos pode ocorrer pelo aumento da expressÃo de TGF-β1 e reduÃÃo nos nÃveis da citocina inflamatÃria TNF-α. No estudo in vivo, lesÃes experimentais foram induzidas na regiÃo dorsal de camundongos e o tratamento com o extrato etanÃlico de C. leprosum (EECL) e CLF-1 foi avaliado por um periodo de 12 dias. Os tratamentos com EECL e CLF-1 induziram uma reepitelizaÃÃo mais rÃpida e efetiva em comparaÃÃo ao controle. O estudo histopatolÃgico mostrou que EECL e CLF-1 apresentam perfis similares durante o processo regenerativo. Esses resultados sugerem que, provavelmente o componente ativo no EECL possa ser o CLF-1. AlÃm dos elevados custos relacionados a cicatrizaÃÃo de feridas, patologias crÃnicas como o cÃncer sÃo estimados como uma das principais causas de morte e um dos principais fatores dispendiosos para os sistemas de saÃde. Os tratamentos convencionais como cirurgia, quimioterapia e radioterapia sÃo efetivos contra tumores primÃrios, contudo, nÃo possuem o mesmo efeito nos estÃgios mais avanÃados da doenÃa. Nesse sentido, muitas biomolÃculas tem atraÃdo interesse da comunidade cientÃfica devido ao seu potencial antitumoral. Esponjas marinhas sÃo consideradas reservas biolÃgicas de vÃrias biomolÃculas, sobretudo lectinas. Lectinas sÃo proteÃnas que se ligam a carboidratos de maneira reversÃvel sem alterar sua estrutura. De modo diferente como relaÃÃo a lectinas de plantas, hà poucos relatos na literatura descrevendo o mecanismo de aÃÃo de lectinas de esponjas sobre a induÃÃo de apoptose de cÃlulas tumorais. O efeito antitumoral de uma lectina isolada da esponja marinha Haliclona caerulea (H3) sobre cÃlulas do adenocarcinoma de mama humano MCF7 foi avaliado. H3 induziu a reduÃÃo da viabilidade celular de MCF7 em mais de 50% (IC50=100 μg/mL) em 6h, 24h e 48h. Contudo, sobre cÃlulas normais, o tratamento com H3 induziu a reduÃÃo em mais de 50%, apenas na maior dose testada (500 μg/mL). AlÃm disso, H3 provoca arraste no ciclo celular na fase G1 e induz apoptose das cÃlulas MCF7 em 24 e 48h. Ensaios utilizando Lysotracker Red e PCR em tempo-real sugerem que o efeito de H3 pode estar relacionado a um balanÃo dinÃmico entre apoptose e autofagia, mediados pelo aumento da expressÃo de caspase-9 e LC3. Em conclusÃo, os resultados sugerem que o CLF-1 e H3 podem ser biomolÃculas promissoras para o tratamento de feridas agudas e crÃnicas e enfermidades como cÃncer.

FundaÃÃo Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientifico e TecnolÃgico / Lectinas sÃo proteÃnas ubÃquas na natureza, de origem nÃo imune, que possuem ao menos um domÃnio nÃo catalÃtico que se liga de forma especÃfica e reversÃvel a carboidratos. Em vegetais estÃo distribuÃdas em folhas, caules e sementes. A tribo Dalbergieae apresenta lectinas que mostram especificidade por diferentes carboidratos e apresentam atividades biolÃgicas diversas como induÃÃo de edema em pata de rato, liberaÃÃo de mediadores quimiotÃticos por macrÃfagos, atividade vasorelaxante em aortas de ratos, dentre outras. Este trabalho teve como objetivo isolar, purificar e caracterizar fÃsico-quimicamente uma lectina presente em sementes de Andira pisonis (tribo Dalbergieae). Sementes de Andira pisonis foram trituradas atà obtenÃÃo de fino pà e as proteÃnas totais foram extraÃdas em sulfato de amÃnio 1M. As proteÃnas solÃveis foram submetidas a atividade hemaglutinante, quantificaÃÃo pelo mÃtodo de Bradford e ensaios de inibiÃÃo da atividade hemaglutinante. A lectina de sementes de Andira pisonis (APL) foi purificada atravÃs de cromatografia de afinidade em matriz de Sepharose-Manose, eluÃda em tampÃo glicina 0,1M pH 2,6 com NaCl 0,15M. A fraÃÃo eluÃda foi dialisada contra Ãgua destilada, liofilizada e submetida a cromatografia de troca iÃnica em HiTrap SP XL 01. APL foi eluÃda com tampÃo acetato de sÃdio 20mM pH 4,5 em gradiente de NaCl 0-1M. APL hemaglutinou eritrÃcitos de coelho (tratados enzimaticamente), assim como outras lectinas da tribo Dalbergieae e apresentou especificidade por manose (25mM). AnÃlise em PAGE-SDS mostrou que APL à composta por uma banda de 34 kDA e uma dupla banda de 8 e 9 kDA. APL apresentou termoestabilidade atà 60ÂC. SÃo necessÃrios mais estudos de caracterizaÃÃo fÃsico-quÃmica para melhor caracterizar esta proteÃna. / Lectins are ubiquitous proteins in nature, of non-immune origin, which have at least one non-catalytic domain that binds carbohydrates specifically and reversibly. They can be found in vegetables leaves, stems and seeds. The Dalbergieae tribe has lectins which have specificity for different carbohydrates and also have several biological activities such as induction of rat paw edema, release of chemotactic mediators by macrophages, vasorelaxant effect in rat aortas, and others. This study aimed to isolate, purify and physiochemically characterize a lectin found in seeds of Andira pisonis (Dalbergieae tribe). Andira pisonis seeds were ground into a fine powder and subjected to total protein extraction in 1 M ammonium sulfate. Soluble proteins were subjected to hemagglutination activity, quantification by the Bradford method and essays of hemagglutination inibition activity by sugar. The lectin from Andira pisonis (APL) was purified by affinity chromatography on Sepharose- Mannose matrix eluted in 0.1 M glycine buffer pH 2.6 with 0.15 M NaCl. The eluted fraction was dialyzed against distilled water, lyophilized and subjected to ion exchange chromatography on HiTrap SP XL 01. APL was eluted on 20 mM sodium acetate buffer pH 4.5 gradient of 0-1M NaCl. APL hemagglutinated rabbit erythrocytes (enzymatically treated) and other lectins from the tribe Dalbergieae and showed specificity for mannose (25 mM). SDS-PAGE analysis showed that APL is composed of a major 34 kDa double band and a minor 8 and 9 kDa double band. APL showed thermostability at 60 C. Further studies are required in order to better physicochemically characterize this protein.