Made available in DSpace on 2016-04-04T12:35:28Z (GMT). No. of bitstreams: 2 karina_rebello_ioc_mest_2008.pdf: 6872283 bytes, checksum: a0cb112c96e6862c0ff341afeb28dbf5 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2008 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / No presente trabalho foram detectadas cisteína-proteinases (CPs) em promastigotas infectivas de Leishmania (Viannia). braziliensis. A estratégia de purificação consistiu na associação do método de extração por Triton X-114 com cromatografia em coluna de Concanavalina A-Sepharose, seguida por outra de DEAE-Sephacel. No ensaio das cromatografias, observamos um pico majoritário de atividade enzimática na presença do substrato pEFLpNan (165 x 10³² \03BCM de pNan/minuto) para cerca de 10¹0 parasitas, coincidentes com o pico majoritário da proteína eluído da coluna de troca iônica. A análise por SDS-PAGE do material eluído da coluna de troca iônica mostrou quatro principais bandas de proteínas com massas moleculares relativas de 63, 43, 30 e 27 kDa. Os ensaios da atividade enzimática após eletroforese mostraram que as bandas de 63 kDa e 43 kDa, hidrolisam substratos como gelatina em pH 7,0 e são sensíveis à presença de E-64. Além disso, as duas enzimas são capazes de hidrolisar o substrato pEFLpNan: 63 kDa (2,2 ± 0,3 \03BCM de pNan/minuto) e 43 kDa (0,05 ± 0,2 \03BCM de pNan/minuto), e são inibidas por 10\03BCM E-64 (47 % e 36 % respectivamente). Os ensaios de reconhecimento imunológico utilizando um anti-soro policlonal específico contra cisteína-proteinase B [anti-CPB de L. (L.) mexicana] revelaram que as enzimas de 63 kDa são reconhecidas por este anti-soro. Os experimentos de aglutinação, citometria de fluxo e imunocitoquímica utilizando esse mesmo antisoro revelaram que homólogos de CPBs estão localizados na superfície da membrana de promastigotas. Além disso, a incubação dos promastigotas com fosfolipase C (PLC) reduziu o número de células positivas pra os homólogos de CPB. Os anti-soros anti-CRD (cross reactive determinat) e anti-CPB reconhecem bandas de 63kDa e 43 kDa do sobrenadante das células tratadas com PLC em ensaios de immunoblotting sugerindo que isoformas destas proteínas são ancoradas por glicosilfostatidilinositol (GP (GPI) à membrana plasmática. Também observamos que os homólogos de CPBs são presos a membrana por âncora GPI e se concentram em plataformas lipídicas. Nós observamos que as proteínas homólogas a CPB não permanecem estáveis na superfície da membrana quando os parasitas são mantidos em culturas sucessivas, assim como a atividade enzimática total sobre o substrato pEFLpNan é alterada. Mostramos ainda através da técnica RT-PCR em tempo real um aumento da transcrição de cpb de L. (V.) braziliensis quando os parasitas foram submetidos a culturas sucessivas. De uma forma geral os dados apresentados suportam a hipótese de que o parasita estudado apresentam CPs de membrana ativas, além de homólogos de CPB intracelulares. / It was detected cysteine-pro teinases (CPs) in infective Leishmania (Viannia) braziliensis promastigotes . The purification strategy c onsisted of an association of Triton X-114 extraction method with chromatography in Concanavalin A-Sepharose column, followed by chromatography in DEAE-Sephacell column. In the assay pf chromatographic fractions, we observed a peak of enzymatic activity against the pEFLpNan substrate (165 x 10 -32 μM of pNan/minute) in over 10 10 parasites, coincident with the ma jor protein peak eluted from the column. SDS-PAGE analysis of the material eluted from the ionic exchange column showed four main protein bands with relative molecular mass of 63 , 43, 30 and 27 kDa. Gelatin-SDS-PAGE assays indicated that the 43kDa and the 63kDa bands can hydrolyze gelatin at neutral pH and are sensitive to E-64. Also, both enzymes can hydrolyze pEFLpNan substrate: 63 kDa (2,2 ± 0,3 μM of pNan/minute) and 43 kDa (0,05 ± 0,2 μM of pNan/minute) bei ng both inhibited by E-64 (47 % and 36 % inhibition, respectively) . Immunological recognition assays , with a specific polyclonal antibody against CPB from L. (L.) mexicana , showed that bands of 63 kDa and 43 kDa are recognized in the fractions of the ionic exchange column. Aggl utination, flow cytometry and immunocytochemistry assays performed with an ti-CPB antiserum revealed that homologous of CPB are located on the promastigote membrane surface. Moreover, the incubation of promastigotes with phospholipase C reduced th e number of CPBs homologues-positive cells. Both anti-cross-reacting determinant (CRD) a nd anti-CPB antisera recognized 63kDa and 43kDa bands in the supernatant of phospholipase C-treat ed cells, suggesting that isoforms of these proteins are attached to the plasma membra ne by glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchors. Also, our data suggest that GPI-anchored CPBs are present in the detergent - resistant lipid rafts. We observed that the CPB homologues do not remain stable on the membrane surface when the parasites are maintained under successive cultur es; also, the total enzymatic activity over the substrate pEFLpNan is altered. We add itionally showed by real-time RT-PCR that L. (V). braziliensis cpb genes are active and their relative expression is increased throughout the successive cultures. Thus, the presented data support the hypothesis of that studied parasite presents CPs of membrane active, beyond homologous of intracellular CPB.