Dissertação (mestrado)-Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2011. / Submitted by Shayane Marques Zica (marquacizh@uol.com.br) on 2011-11-09T17:16:21Z No. of bitstreams: 1 2011_GracianaSouzaLordelodeCarvalho.pdf: 1196473 bytes, checksum: d8518b130278d039d040202e0b50596d (MD5) / Approved for entry into archive by Elzi Bittencourt(elzi@bce.unb.br) on 2011-11-23T14:25:55Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_GracianaSouzaLordelodeCarvalho.pdf: 1196473 bytes, checksum: d8518b130278d039d040202e0b50596d (MD5) / Made available in DSpace on 2011-11-23T14:25:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_GracianaSouzaLordelodeCarvalho.pdf: 1196473 bytes, checksum: d8518b130278d039d040202e0b50596d (MD5) / A leucemia mielóide crônica é uma doença de células hematopoiéticas na qual ocorre a proliferação celular descontrolada dos leucócitos. Embora os aspectos clínicos e biológicos estejam bem documentados, pouco se sabe sobre a susceptibilidade individual à doença. Neste trabalho foi realizado um estudo caso-controle analisando a prevalência dos polimorfismos MTHFR C6777T e A1298C, GSTM1, GSTT1 e haptoglobina em 105 pacientes com leucemia mielóide crônica (LMC) e em 273 controles saudáveis, por meio das técnicas de reação em cadeia da polimerase (PCR), seguida ou não por digestão com enzimas de restrição (RFLP). Uma associação com risco de desenvolver LMC foi encontrada para os genótipos MTHFR 1298AA (OR = 1,794 IC 95% = 1,14-2,83) e GSTM1 não nulo (OR = 1,649; IC 95% = 1,05-2,6; p = 0,031), enquanto os genótipos MTHFR 1298AC (OR = 0,630; IC 95% = 0,40-0,99, p=0,047) e GSTM1 nulo (OR = 0,606; IC 95% = 0,21-0,77, p = 0,031) diminuiram este risco. Verificou-se para o genótipo MTHFR 1298AA, um aumento do risco para o sexo feminino (OR=2,052; 95% CI=1,08-3,92; p=0,028), como também para faixa etária de 20-40 anos (OR=1,980; 95% CI=1,06-4,65; p=0,047) e para indivíduos de pele branca (OR=2,218; 95% CI=1,09-4,51; p=0,026). Em relação a GSTM1, o aumento do risco foi também associado ao sexo feminino (OR=2,505; 95% CI=0,21-0,77; p=0,031) e para indivíduos >60 anos (OR=6,222; 95% CI=1,63-23,76; p=0,006). Indivíduos Hp1F-1S de pele negra também apresentaram aumento do risco (OR=7,200; 95% CI=0,94-54,94; p=0,037).A diminuição do risco anteriormente apresentada para MTHFR 1298AC e GSTM1 nulo foram também relacionados ao sexo feminino, para MTHFR (OR=0,520; 95% CI=0,27-0,99; p=0,046) e para GSTM1 (OR=0,399; 95% CI=0,21-0,77; p=0,005). Também se observou para GSTM1 nulo, a diminuição do risco para >60 anos (OR=0,161; 95% CI=0,04-0,61; p=0,006). Uma diminuição do risco para indivíduos de pele negra foi observada para o genótipo Hp1S-2 da haptoglobina (OR=0,619; 95% CI=0,44-0,87; p=0,011). Uma diminuição do risco no sexo masculino ocorreu apenas para o genótipo MTHFR 677CC (OR=0,495; 95% CI=0,26-0,95; p=0,032).Os resultados indicaram também a seleção a favor dos heterozigotos para o loco MTHFR 1298. A variabilidade em populações humanas pode refletir, em parte, processos distintos de seleção natural e adaptação às condições ambientais variáveis. A população brasileira é muito heterogênea e miscigenada, e nossos resultados indicaram que, pelo menos para esta população, esses dois polimorfismos são importantes no contexto da LMC, necessitando de maiores investigações em associação com dosagens de folato e dados clínicos. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Chronic myeloid leukaemia is a haematopoietic stem cell disorder causing uncontrolled cell proliferation of white blood cells. Although these clinical and biological aspects are well documented, little is known about individual susceptibility to the disease. We conducted a case-control study analysing the prevalence of the polymorphisms MTHFR C6777T, MTHFR A1298C,GSTM1, GSTT1 and Haptoglobin in 105 patients with chronic myeloid leukaemia (CML) and 273 healthy controls, using polymerase chain reaction (PCR)-based methods. An association with risk of developing CML was found for MTHFR 1298AA (OR= 1.794; 95% CI= 1.14−2.83) and GSTM1 non-null (OR= 1.649; 95% CI= 1.05−2.6; p=0.031) genotypes, while MTHFR 1298AC (OR= 0.630; 95% CI= 0.40−0.99; p=0.047) and GSTM1 null (OR= 0.606; 95% CI= 0.21−0.77; p=0.031) genotypes decreased this risk. For MTHFR 1298AA, this risk was particularly related to females (OR= 2.052; 95% CI= 1.08-3.92; p=0.028), age group of 20-40 years (OR= 1.980; 95% CI= 1.06-4.65; p=0.047) and white skin colour (OR= 2.218; 95% CI= 1.094.51; p=0.026); for GSTM1, it was related to females (OR=2.505; 95% CI= 0.210.77; p=0.031) and the age group >60 years (OR= 6.222; 95%CI= 1.63-23.76; p=0.006). Results also showed an increased risk for individuals of black skin colour carrying Hp1F-1S genotype, despite the small sample size and the large confidence interval (OR= 7.200; 95% CI= 0.94-54.94; p=0.037). A decreased CML risk was observed for the genotypes MTHFR 1298AC (OR= 0.630; 95% CI= 0.40-0.99; p=0.047) and GSTM1 null (OR= 0.606; 95% CI= 0.21-0.77; p=0.031), and both were also related to females (OR= 0.520; 95% CI= 0.27-0.99; p=0.046 for MTHFR; and OR= 0.399; 95% CI= 0.21-0.77; p=0.005 for GSTM1). For GSTM1 null genotype, it was also related to the age group >60 years (OR= 0.161; 95% CI=0.04-0.61; p=0.006). For males, a decreased risk was observed only for MTHFR 677CC genotype (OR= 0.495; 95% CI= 0.26-0.95; p=0.032). A decreased risk was also observed for individuals of black skin colour carrying Hp1S-2 genotype (OR= 0.619; 95% CI= 0.44-0.87; p=0.011). For males, a decreased risk was observed only for MTHFR 677CC genotype (OR= 0.495; 95% CI= 0.26-0.95; p=0.032).Results also indicated selection in favour of heterozygous for MTHFR 1298 loco. The considerable range of variation in human populations may reflect, in part, distinctive processes of natural selection and adaptation to variable environmental conditions. The Brazilian population is very mixed and heterogeneous, and our results indicated that, at least for this population, these two locus are important in the context of CML, needing further investigation in association with folate dosages and clinical data.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2011. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2011-05-06T13:24:18Z No. of bitstreams: 1 2011_CarlosAlbertoPintoSilveira.pdf: 5518240 bytes, checksum: 757cb0184d2aada5bbe9321ff8efa9a3 (MD5) / Approved for entry into archive by Luanna Maia(luanna@bce.unb.br) on 2011-05-07T13:13:09Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_CarlosAlbertoPintoSilveira.pdf: 5518240 bytes, checksum: 757cb0184d2aada5bbe9321ff8efa9a3 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-05-07T13:13:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_CarlosAlbertoPintoSilveira.pdf: 5518240 bytes, checksum: 757cb0184d2aada5bbe9321ff8efa9a3 (MD5) / A leucemia mielóide crônica é doença mieloproliferativa crônica, caracterizada pela presença do cromossomo Filadélfia, que é o resultado da translocação balanceada entre os cromossomos 9 e 22. A conseqüência molecular desta translocação é a formação de um gene híbrido BCR-ABL, que codifica uma proteína quimérica com atividade tirosina quinase, diretamente implicada na patogênese da doença. O mesilato de imatinibe (Glivec®) é um inibidor seletivo dessa enzima. O presente estudo realizou uma análise descritiva, observacional e retrospectiva de pacientes atendidos no ambulatório de Hematologia do Hospital de Base de Brasília, no período compreendido entre maio de 2002 a abril de 2009 e teve como objetivo, avaliar a eficácia do tratamento com mesilato de imatinibe como opção de primeira linha, em portadores de leucemia mielóide crônica em fase crônica, através das respostas hematológica e citogenética, assim como pela avaliação de desfechos de longo prazo, como a sobrevida global e sobrevida livre de progressão para fases mais adiantadas da doença. Cento e cinco pacientes foram elegíveis, sendo que 98 (93,3%) deles, em fase crônica precoce, isto é, menos de um ano entre diagnóstico e início do tratamento. Cinquenta e cinco (70,5%) de 78 pacientes foram classificados como de risco intermediário ou alto risco, de acordo com o escore prognóstico de Sokal. A taxa de resposta hematológica foi de 96,4% ao longo do estudo. Aos doze meses, as respostas citogenéticas maior e completa foram de 71,7% e 65,9%, respectivamente, enquanto aos 48 meses, de 83,7% e de 80,5%, respectivamente. A resposta molecular maior apresentou taxa crescente de resposta acumulada, chegando a 59,5% aos 48 meses. A sobrevida global foi de 92,1% aos 48 meses, com 89,3% dos pacientes apresentando sobrevida livre de progressão para fases mais avançadas da doença, no mesmo período. A resposta citogenética maior aos 12 meses correlacionou-se, significativamente, com a sobrevida global (p = 0,010) e com a sobrevida livre de progressão (p = 0,032). Não houve diferenças significativas nas taxas de resposta citogenética completa aos 12 meses (p = 0,592), na sobrevida global (p = 0,489) e na sobrevida livre de progressão (p = 0,306), de acordo com o escore prognóstico de Sokal. A dose utilizada foi de 400mg ao dia, em média. A medicação foi bem tolerada, com apenas 2 (1,9%) dos pacientes mostrando toxicidade hematológica graus 3 – 4. A mediana de seguimento foi de 23 meses (variação de 3 a 97 meses). Ao término da avaliação 73 (69,5%) dos pacientes ainda faziam uso do mesilato de imatinibe e 32 (30,5%) tinham descontinuado a medicação, sendo que 18 (17.1%), por resposta insatisfatória. O tratamento de pacientes portadores de Leucemia Mielóide Crônica em fase crônica, com mesilato de imatinibe, proporcionou taxas de respostas inferiores às dos principais estudos clínicos, mas relacionou-se com sobrevida livre de progressão e sobrevida global em significativa proporção de pacientes. Seguimento por tempo mais prolongado será necessário para melhor avaliação dos desfechos de sobrevida, dado o relativo curto período de observação. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Chronic myeloid leukemia is a myeloproliferative disorder characterized by Philadelphia chromossome, which is the result of a balanced translocation between chromosomes 9 and 22. The molecular consequence of this translocation is a hybrid BCR-ABL gene, which encodes a chimeric protein with tyrosine kinase activity, directly implicated in the pathogenesis of the disease. Imatinib mesylate (Glivec®) is a selective inhibitor of such protein. This was a descriptive, observational and retrospective analysis of patients in Hospital de Base, Brasília-Brazil, followed from May 2002 to April 2009. The aim was to assess the efficacy of imatinib mesylate as front-line therapy in chronic-phase chronic myeloid leukemia patients, with hematologic and cytogenetic response, as well the long-term outcomes, such overall survival and progression-free survival to later stages of the disease. One hundred and five patients were eligible and 98 (93.3%) were in late chronic-phase, that is, less than one year, from the start of therapy. Fifty-five (70.5%) out of 78 patients were in intermediate or high risk group of Sokal score. The hematologic response rate was 96.4% at any time during the observation period. The cumulative rates of major and complete cytogenetic responses at 12 months were 71.7% and 65.9%, respectively, while at 48 months, they were 83.7% and 80.5%, respectively. Molecular response rate improved slowly and steadily over time, reaching 59.5% at 48 months. The 4-year overall survival and progression free survival rates were 92.1% and 89.3%, respectively. Cytogenetic response by 12 months significantly correlated with overall survival (p = 0.010) and progression-free survival (p = 0,032). There were no significant differences in the rates of complete cytogenetic response at 12 months (p = 0.592), in overall survival (p = 0.489) and in progression free survival (p = 0.306), according to Sokal risk score. The dose of imatinib was 400 mg daily on average and the drug was well tolerated, with only 2 (1.9%) patients showing hematological toxicity grades 3-4. The median follow-up was 23 months (range 3 – 97). At the end of the evaluation 73 (69.5%) of patients were still using imatinib mesylate and 32 (30.5%) had discontinued the medication, eighteen (17.1%) for unsatisfactory response. Treatment with imatinib mesilate as frontline therapy in chronic-phase chronic myeloid leukemia patients, induced lower response rates than published data, but was related to satisfactory rates of survival and event-free survival. Best analysis of long-term outcomes requires extended follow-up, given the short observation period.

As leucemias são neoplasias que afetam o sistema hematopoiético e compreendem 2,53% dos casos de câncer relatados. Entre as leucemias, 27,95% correspondem a casos de leucemia mielóide crônica (LMC), que apresenta como marcador genético o cromossomo Philadelphia (Ph). Presente em mais de 80% dos casos, o cromossomo Ph é derivado da translocação t(9;22) (q34;q11), que origina um gene híbrido entre a região 5´ do gene bcr e 3´do gene abl. O produto deste gene é uma proteína Bcr-Abl na qual a atividade reguladora e nuclear do domínio tirosina quinase, originado da proteína Abl, torna-se constitutiva e citoplasmática. Estas mudanças na atividade tirosina quinase afetam diferentes vias de sinalização, com consequências em vários processos celulares como adesão, proliferação e apoptose. Em nível fisiológico, foi mostrado tanto in vitro quanto in vivo que as células hematopoiéticas precursoras Ph+ se diferenciam principalmente em células eritróides. Entretanto, quase 70% dos pacientes com LMC sofrem anemia, mostrando que, as células Ph+ diferenciadas em células eritróides não conseguem amadurecer até hemácias funcionais. Isto faz da LMC um bom modelo para o estudo da diferenciação de células eritróides e suas características, como os fatores que afetam a sintese de hemoglobina (Hb). A linhagem K562 é uma linhagem celular eritroleucêmica Ph+, amplamente utilizada como modelo para estudar drogas com capacidade anti-proliferativa e/ou indutoras da síntese de hemoglobina fetal. Entre estas drogas encontram-se a aclarrubicina (ACLA) e doxorrubicina (DOX) que, embora sejam análogos químicos pertencentes à família das antraciclinas, possuem mecanismos de ação diferentes e ainda não completamente esclarecidos. Neste trabalho, foram investigados vários aspectos da biologia das células K562 durante o tratamento com estas drogas. Foi observado que o tratamento com DOX produz um aumento de tamanho nas células e bloqueio do ciclo celular na fase G2/M, afetando também grandemente a viabilidade celular, com 70% de células mortas no sétimo dia de tratamento. Já durante o tratamento com ACLA a viabilidade, tamanho e ciclo celular foram menos afetados, com aproximadamente 15% de células mortas no sétimo dia de tratamento e um bloqueio transitório do ciclo na fase G1. No entanto, as duas drogas causaram um aumento significativo da síntese de hemoglobina, principalmente DOX que induziu um aumento quase duas vezes maior que o induzido por ACLA. A análise da expressão gênica realizada através da técnica de differential display mostrou várias bandas diferencialmente representadas e com diversas cinéticas de expressão, apresentando semelhanças e diferenças quando são comparados os dois tratamentos ou células tratadas e controle. Destas bandas, 26 estão sequenciadas mostrando genes envolvidos em vários processos celulares como dano do DNA, resistência a drogas, processamento do RNA e codificação de proteinas relacionadas com ferro. Das bandas sequenciadas, 7 foram validadas por RT-PCR (ndrg1, erk2, nf2l2, atp6ap1, rfc1, phf20 e zkscan) sendo observado um aumento na sua expressão durante o tratamento, com exceção de ndrg1 para o qual a expressão foi induzida em vez de aumentada e nf2l2 onde a diferença com o controle foi pequena e não permitiu validar este gene como diferencialmente expresso. Com o objetivo de procurar por mecanismos comuns entre os vários indutores da síntese de hemoglobina em células K562, estes genes foram também analisados durante o tratamento destas células com os indutores hidroxiuréia e dGTP. Além de induzirem a expressão de hemoglobina, os dois tratamentos provocaram um aumento no tamanho das células tratadas e um bloqueio no ciclo celular na fase S. Visando futuros trabalhos envolvendo os genes diferencialmente expressos, foi ainda otimizado um sistema de transferência gênica por eletroporação. Para isto foram testados varios parâmetros como campo elétrico, resistência, capacitância, meios de eletroporação, manipulação das células e uso de inibidores de DNAses. Como resultado, foi alcançado com o eletroporador padrão uma eficiência de transfecção de 81%, similar àquela alcançada pelo nucleoporator (eletroporador de última geração). As condições estabelecidas foram 750 V/cm, resistência infinita, 500 μF, meio RPMI1640, centrifugação e sulfato de zinco pós-pulso. A relação das antraciclinas e a hidroxiuréia, assim como de outros indutores da síntese de hemoglobina, com o ferro intracelular, juntamente com a diferença na expressão, durante o tratamento, de genes afetados direta ou potencialmente pela não disponibilidade de ferro intracelular, nos permitiu gerar uma hipótese para a via de sinalização que leva à síntese de hemoglobina. Nesta, sinais de falta ou não disponibilidade de ferro nas células ativariam a maquinaria celular para a captação e internalização do ferro extra-celular, simultaneamente com síntese de proteínas que utilizam o ferro para realizar as suas funções biológicas, entre elas a hemoglobina. Do mesmo modo, propomos a via de sinalização do ferro como um alvo potencialmente afetado por drogas indutoras da síntese de hemoglobina, como as antraciclinas, cujos alvos são ainda pouco conhecidos. Contudo, mais genes desta via de sinalização, bem como outros indutores, deveram ser estudados para saber se a síntese de hemoglobina pode ser induzida por drogas mais específicas e com menos efeitos colaterais que aquelas usadas atualmente para o tratamento de câncer e outras doenças.

A quimioterapia é uma das principais estratégias no tratamento do câncer. No entanto, muitos tumores apresentam resistência, tornando o tratamento parcial ou totalmente ineficaz. Existem alguns mecanismos que podem estar relacionados ao desenvolvimento desse perfil de resistência, sendo o mais estudado o aumento do efluxo das drogas através de proteínas de membrana celular. Por outro lado, uma alteração nas vias de reparo de DNA também contribui para a resistência tumoral, uma vez que as lesões são removidas antes mesmo de se tornarem citotóxicas para as células, reduzindo assim a efetividade do quimioterápico. Dentre as vias de reparo de DNA, a via do Reparo por Excisão de Nucleotídeos (NER) é uma das mais versáteis, e há estudos que demonstram seu envolvimento em resposta às lesões geradas por antraciclinas. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a contribuição dos mecanismos de resposta à dano no DNA, bem como da via NER, na resistência à Mitoxantrona (MXT), um análogo de antraciclinas, na linhagem celular de leucemia HL-60/MX2. Para isso, analisou-se a sobrevivência celular, pelo método de exclusão por azul de tripan, o perfil de ciclo celular e a fosforilação da histona H2AX (γH2AX), por citometria de fluxo, além da análise de expressão gênica da via NER e proteínas de efluxo por qPCR. Os resultados indicam um perfil de resposta diferente entre a linhagem resistente e a linhagem sensível, observado pelo teste de sobrevivência e pelos diferentes perfis de ciclo celular e fosforilação de H2AX. Além disso, a análise de expressão gênica demonstra um aumento na expressão de genes da via NER, como ERCC1 já antes do tratamento e XPA após os tratamentos, na linhagem resistente. Estes resultados demonstram portanto envolvimento desta via de reparo de DNA na resistência tumoral da linhagem HL- 60/MX2. / Chemotherapy is one of the main cancer treatment strategies; however, tumors can show resistance, which makes the treatment partial or totally inefficient. Among the mechanisms that may be related to the resistant profile, the most studied is increased drug efflux through ABC transporter permeases. On the other hand, altered DNA repair pathways may contribute to cancer resistance, since the lesions are removed before they become toxic to cells, which reduces chemotherapy effectiveness. Among DNA repair pathways, Nucleotide Excision Repair (NER) is one of the most versatile, and there are studies showing its involvement in removal of anthracyclines-induced lesions. Thus, our aim was to evaluate the contribution of DNA damage response mechanisms, focusing on NER, to the resistance to Mitoxantrone (MXT), an anthracycline analog, using the mitoxantrone-resistant leukemia cell line HL-60/MX2 as a model. After treatment with MXT and Etoposide (ETO), a topoisomerase II inhibitor, cell survival was assessed by trypan blue exclusion method; cell cycle profile and H2AX histone phosphorylation (γH2AX) were evaluated by flow cytometry; and gene expression levels of NER and efflux proteins were determined by RT-qPCR. Results indicate a different response between the resistant HL-60/MX2 and the sensitive HL-60 cells, as observed in the survival assay, cell cycle, and H2AX phosphorylation profile. Furthermore, in the resistant cells, RTqPCR analysis showed an increase in the expression of NER genes, with ERCC1 expression increased before treatments, and XPA after the treatments. Therefore, our results indicate the contribution of NER machinery in the resistance of leukemia cells to Mitoxantrone.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:55:35Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo79_1.pdf: 1037483 bytes, checksum: 2a3e04b13ef6daeac80ee5ef7f9b473f (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2010 / Anticorpos são largamente utilizados para caracterizar células leucêmicas dentre seus estágios de diferenciação. O uso de lectinas, (glico)proteínas que reconhecem especificamente carboidratos, como sonda de análise da superfície celular fornece informações sobre carboidratos na membrana celular. A diferenciação das células e sua transformação maligna são caracterizadas por mudanças nos resíduos de carboidratos de glicoconjugados de membrana celular as quais podem ser detectadas por lectinas. Neste estudo, células de medula óssea de pacientes com leucemia mielóide aguda (LMA) e linfóide aguda (LLA), recém diagnosticados no Centro de Oncohematologia Pediátrica do Hospital Universitário Oswaldo Cruz/UPE e Fundação de Hematologia e Hemoterapia de Pernambuco (HEMOPE), foram avaliadas usando um painel com cinco lectinas conjugadas ao isotiocianato de fluoresceina, FITC (fluorescein isothiocyanate), Wheat germ agglutinin (WGA), Lotus tetragonolobus agglutinin (LTA), Concanavalina A (Con A), Ulex europaeus (UEA I) e Arachis hypogaea (PNA), de acordo com o protocolo de marcação utilizado para o diagnóstico de rotina com anticorpos monoclonais. A WGA, específica para N-acetilglicosamina, marcou intensamente as células leucêmicas de pacientes com LLA e LMA, mas não foi capaz de diferenciá-las. Entretanto, a UEA-I (L-fucose) mostrou maior especificidade para as células de linhagem mielóide (LMA) do que para LLA, sendo capaz de diferenciá-las. A LTA marcou tanto as células de LMA quanto de LLA, embora apresente também especificidade para o carboidrato L-fucose. Não foi observada marcação seletiva para as lectinas PNA (D-galactose específica) e Con A (D-glicose/D-manose) para as células de LLA e LMA. Estes achados demonstram que lectinas são potenciais sondas para detectar mudanças no perfil sacarídico de glicoconjugados de membrana de células hematopoiéticas imaturas, sendo mais uma ferramenta para o diagnóstico dos diferentes tipos de leucemia

Orientador: Christine Hackel / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-25T23:45:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Marcolan_CleberFontoura_M.pdf: 3154802 bytes, checksum: d168e706cbc62d8d92fa0091bd7eaf18 (MD5) Previous issue date: 1999 / Resumo: Do ponto de vista citogenético, as associações entre alterações cromossômicas específicas e diferentes tipos de neoplasias hematológicas estão bem estabelecidas. Porém, as associações teloméricas (tas), que são associações que envolvem as regiões terminais dos cromossomos, conhecidas como telômeros, são observadas esporadicamente em processos neoplásicos, questionando-se seu potencial como indicador biológico de exposição ocupacional à agentes genotóxicos do meio ambiente. Tais associações podem ser derivadas da redução do comprimento do telômero e da inibição da telomerase, refletindo-se em instabilidade cromossômica. Com o objetivo de analisar o cariótipo e verificar a ocorrência das tas em SMD e leucemias mielóides, foram analisadas metáfases de células de aspirado de medula óssea de 30 pacientes (10 SMD, 10 LMA e 10 LMC), em sua maioria, provenientes da zona rural. A comparação dos dados relativos a freqüência de tas nos diferentes grupos de neoplasias hematológicas foi realizada pelo teste não paramétrico de Kruskal Wallis, adotado o nível de significância de 5%. Na análise do cariótipo das SMD, as alterações clonais encontradas foram a monossomia do cromossomo 7, associada à monossomia dos cromossomos 13 e 20, a trissomia dos cromossomos 21, 15 e 19 e a tetrassomia do cromossomo 22. Também foram observados novos rearranjos estruturais envolvendo as regiões 2q37, 4q35, 7p22, 9p11, 12p13, e 12q24. Dentre as alterações cromossômicas de natureza clonal encontradas em LMA, destacaram-se a trissomia do cromossomo 14 e as monossomias dos cromossomos 1, 7 e 22, a deleção do braço longo do cromossomo 7 e a presença do cromossomo Philadelphia. Nas LMC, os resultados da análise do cariótipo revelaram a presença do cromossomo Philadelphia (Ph), como principal alteração de natureza clonal, sendo observado também, um segundo cromossomo Ph e a nulissomia do Y como alterações cromossômicas secundárias em alguns pacientes. Outras alterações de natureza não-clonal foram observadas ocasionalmente, como poliploidias, hipo e hiperdiploidias, cromossomos marcadores, quebras cromatídicas e separação precoce de centrômero. Em relação às tas, nossos resultados mostraram a presença desse fenômeno em todos os pacientes com SMD e LMA e em 8 dos 10 pacientes com LMC. A freqüência de tas foi mais elevada nas SMO; as LMA apresentaram freqüência intermediária e as LMC apresentaram freqüência mais baixa. A comparação das freqüências de metáfases com associações teloméricas entre os três grupos de neoplasias hematológicas apresentou diferença significativa entre SMO e LMC (p <0.01), enquanto não foram observadas diferenças significativas das LMA em relação às SMO (p > 0.05) e das LMA em relação às LMC (p > 0.05). Tendo em vista os resultados obtidos, é possível que os agroquímicos possam ser inibidores da atividade de telomerase, atingindo preferencialmente as células tronco da medula óssea, desencadeando assim uma perda de repetições teloméricas, cuja expressão citogenética inicial seria representada pelas tas. Desse modo, as tas poderiam ser consideradas indicadores de instabilidade cromossômica relacionada à exposição aos genotóxicos do meio ambiente. No entanto, nossos dados são apenas indicativos, pois na casuística por nós examinada há um predomínio de indivíduos do meio rural, não sendo possível comparar os dados com indivíduos não-expostos ocupacionalmente a esses produtos, sendo necessário posteriores estudos citogenéticos e moleculares para a investigação do encurtamento dos telômeros e da atividade da telomerase nas tas, em indivíduos expostos e não expostos a agroquímicos / Abstract: The associations between specific chromosomal abnormalities and different types of hematological neoplasias are well established. However, telomeric associations (tas), which are associations between termini regions of chromosomes (telomeres), are sporadicly observed in neoplasias, leading to the question about their role as a biological indicator of occupational exposure to environmental genotoxic agents. These associations can arise in consequence of shortening telomere length and the inhibition of telomerase activity, reflecting in chromosomal instabiblity The objective of this work was to determine the karyotype and to verify the occurrence of tas in MOS and acute or chronic myeloid leukemias (AML and CML). Metaphases of bone marrow cells of 30 patients (10 with MOS, 10 with AML and 10 with CML) were analyzed. The comparison of tas frequency data in these different hematological neoplasias was realized by the Kruskal Wallis test with significance levei of 5%. In the MOS patients, the clonal cytogenetic abnormalities findings were: monosomy of chromosome 7 in association with monosomy of chromosomes 13 and 20, trisomy of chromosomes 15, 19, 21, and tetrasomy of chromosome 22. New structural rearrangements were observed involving the 2q37, 4q35, 9p11, 12p13, 7p21 and 12q24 regions. Non-clonal chromosomal abnormalities were observed in AML,such as the trisomy of chromosome 14 and monosomy of chromosomes 1, 7 and 22, deletion of short arm of chromosome 7 and the presence of Philadelphia (Ph) chromosome. In CML, the results showed the presence of Ph chromosome as the principal clonal abnormality, as expected. An extra Ph chromosome and monosomy of chromosome Y, which are secondary chromosomal abnormalities, were also observed in some patients. Other non-clonal abnormalities such as poliploidy, hipodiploidy, hiperdiploidy, marker chromosome, chromatid break and precoce centromere division were occasionally observed. Wrth regard to tas, our results showed the presence this phenomenon in ali patients with MOS, AML and in eight among ten patients with CML. The frequency of metaphases with tas was higher in MOS; AML showed intermediate frequency and CML lower frequency. The comparison of these data showed significative difference between MOS and CML (p<O.O1), whereas no significative levels between AML regard to MOS (p>O.O5) and CML (p>O.O5) were detected. Considering our results, it's possible to suppose that agrochemicals can be inhibitors of telomerase activity, preferentially attaining the stem cells of bone marrow, leading to the loss of telomeric sequences and to the cytogenetic expression of tas. Thus, tas can be considered an indicator of chromosomal instability, related to environmental exposure to pesticides. However, our data are only indicative, because in the present study, there was a predominancy of individuais from rural zone, not allowing us to compare these data with occupational non-exposed individuais. Additional cytogenetics and molecular studies should be performed to investigate the relationship between telomerase activity and shortening telomere length with tas, in patients with hematological disease, exposed or non-exposed to environmental genotoxic agents such as pesticides / Mestrado / Biologia Celular / Biologia Celular e Estrutural

Submitted by Fernanda Rodrigues de Lima (fernanda.rlima@ufpe.br) on 2018-10-05T20:29:57Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Karen Yasmim Pereira dos Santos Avelino.pdf: 6866829 bytes, checksum: 3b10de120d677d5b8d273efaa4afd552 (MD5) / Approved for entry into archive by Alice Araujo (alice.caraujo@ufpe.br) on 2018-11-14T19:29:03Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Karen Yasmim Pereira dos Santos Avelino.pdf: 6866829 bytes, checksum: 3b10de120d677d5b8d273efaa4afd552 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-11-14T19:29:03Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Karen Yasmim Pereira dos Santos Avelino.pdf: 6866829 bytes, checksum: 3b10de120d677d5b8d273efaa4afd552 (MD5) Previous issue date: 2017-02-23 / CNPq / A avaliação da presença do oncogene quimérico BCR/ABL possibilita um diagnóstico precoce do câncer e o monitoramento de células leucêmicas residuais, especialmente, após o transplante de medula óssea. O desenvolvimento de ensaios moleculares efetivos para a detecção do oncogene quimérico BCR/ABL é de grande interesse para a promoção da saúde de pacientes com leucemia. Diante desta problematização, esta dissertação tem o objetivo de desenvolver dois tipos de biossensores eletroquímicos utilizando diferentes nanomateriais com a finalidade de obter baixos limites de detecção, necessários para o diagnóstico ultrassensível e monitoramento do oncogene quimérico BCR/ABL. Os biossensores foram obtidos a partir das seguintes metodologias: a) imobilização eletrostática de uma sonda de DNA sobre uma superfície transdutora de ouro modificada com compósito híbrido de nanopartículas de ouro e polianilina (AuNpsPANI) e b) imobilização química de uma sonda de DNA aminada sobre uma superfície de ouro modificada com cisteína (Cys), nanotubos de carbono de paredes múltiplas com grupos carboxílicos (cMWCNT) e nanopartículas de óxido de zinco funcionalizadas com aminopropiltrietoxisilano (ZnONp/NH₂). As técnicas de voltametria cíclica (VC) e espectroscopia de impedância eletroquímica (EIE) foram utilizadas para a caracterização e compreensão dos processos físico-químicos interfaciais. Ao avaliar o desempenho analítico dos sistemas sensores com amostras de plasmídeos recombinantes contendo o oncogene quimérico BCR/ABL, foram observadas alterações nas correntes amperométricas e nos valores de resistência à transferência de carga (RCT). Em oposição, nenhuma resposta significativa foi obtida durante o estudo de seletividade com sequências gênicas não-complementares. As micrografias de microscopia de força atômica (AFM) demonstraram mudanças nos perfis topográficos dos biossensores após sua exposição ao oncogene quimérico BCR/ABL. Apesar de ambos os biossensores apresentarem elevada reprodutibilidade, rápido tempo de resposta e efetividade para a identificação do oncogene quimérico BCR/ABL em amostras de cDNA de pacientes com leucemia, o biossensor baseado em Cys-cMWCNT-ZnONp/NH₂ demonstrou sensibilidade superior com um limite de detecção de 6,94 aM. Portanto, as plataformas biossensíveis desenvolvidas podem ser consideradas ferramentas promissoras para o diagnóstico do oncogene quimérico BCR/ABL e monitoramento de níveis mínimos de doença residual. / The evaluation of the presence of the BCR/ABL fusion gene allows an early diagnosis of cancer and the monitoring of residual leukemic cells, especially after the bone marrow transplantation. The development of effective molecular assays for the detection of the BCR/ABL fusion gene is of great interest for the promotion of the health of patients with leukemia. In view of this problematization, this dissertation aims to develop two types of electrochemical biosensors using different nanomaterials in order to obtain low detection limits, necessary for the ultrasensitive diagnosis and monitoring of the BCR/ABL fusion gene. The biosensors were obtained from the following methodologies: a) electrostatic immobilization of a DNA probe on a gold transducer surface modified with hybrid composite of gold nanoparticles and polyaniline (AuNpsPANI) and b) chemical immobilization of an aminated DNA probe on a gold surface modified with ) cysteine (Cys), carboxylated multiwalled carbon nanotubes (cMWCNT) and aminopropyltriethoxysilane functionalized zinc oxide nanoparticles (ZnONp/NH₂). The techniques of cyclic voltammetry (CV) and electrochemical impedance spectroscopy (EIS) were used for the characterization and understanding of the interfacial physico-chemical processes. When evaluating the analytical performance of the sensor systems with samples of recombinant plasmids containing the BCR/ABL fusion gene, were observed changes in the amperometric currents and in the charge transfer resistance (RCT) values. In opposition, none significant response was obtained during the selectivity study with non-complementary gene sequences. The micrographs of atomic force microscopy (AFM) demonstrated modifications in the topographic profiles of the biosensors after their exposure to the BCR/ABL fusion gene. Although both biosensors showed high reproducibility, fast response time and effectiveness for the identification of the BCR/ABL fusion gene in cDNA samples of patients with leukemia, the biosensor based on Cys-cMWCNT-ZnONp/NH₂ demonstrated superior sensitivity with a detection limit of 6.94 aM. Hence, the developed biosensitive platforms can be considered promising tools for the identification of the BCR/ABL fusion gene and monitoring of minimum levels of residual disease.

Orientadores : Carmen Verissima Ferreira, Nora Marcela Haun Quiros / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-02T23:38:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Freire_AnaClaudiaGalvao_D.pdf: 5573587 bytes, checksum: 42953ae5b64a43727a0686fe5fb30d9c (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: A linhagem celular da leucemia promielocítica humana (HL60) foi estabelecida a partir do sangue periférico de uma paciente com leucemia promielocítica aguda. Essa cultura prolifera continuamente em suspensão, consiste predominantemente de promielócitos e tem sido utilizada como alvo para o estudo do efeito citotóxico de drogas, diferenciação e morte celular. Neste trabalho foi avaliada a citotoxicidade de inibidores de proteínas fosfatases (ácido okadáico e pervanadato) e da desidrocrotonina (t-DCTN) através dos seguintes parâmetros de viabilidade, após 24h de tratamento: redução do MTT (integridade mitocondrial), dosagem do teor de proteínas (indicação do número de células) e atividade fosfatásica (metabolismo celular). Os dois inibidores de proteínas fosfatases apresentaram efeito citotóxico sobre as células HL60. Em relação à função mitocondrial e atividade fosfatásica, as células apresentaram somente 20% de viabilidade em presença do ácido okadáico (100 nM) e pervanadato (200 11M). Para a t-DCTN foram obtidos os seguintes valores de ICso: 500 e 300 11M para o teor de proteína e redução do MTT, respectivamente. Outro aspecto abordado foi a relação entre o estado redox celular com uma possível indução da diferenciação e morte celular. Para este propósito foram determinados: redução do NBT, fragmentação do DNA, perda da assimetria da membrana plasmática e conteúdo total de GSH. A t-DCTN apresentou uma baixa capacidade de indução de diferenciação (20%). No entanto, na presença dos inibidores de proteínas fosfatases este efeito foi observado. A apoptose foi induzida na presença do ácido okadáico (34%) e este efeito foi aumentado em combinação com a t-DCTN (65,28%). De acordo com os resultados obtidos, sugere-se a importância da modulação química das proteínas fosfatases em diversos processos celulares, uma vez que os efeitos citotóxicos apresentados por estes compostos podem ser explicados pela alteração do estado redox celular e/ou efeito direto (formação de adutos) sobre estas enzimas ou outras macromoléculas / Abstract: patient with acute myeloid leukemia. This culture proliferates continuously in suspension and predominantly consists of promyelocytes and has been used as tool for cytotoxic studies of drugs, differentiation and cell death. ln this work was evaluated the cytotoxicity of protein phosphatases inhibitors (okadaic acid and pervanadate) and dehydrocrotonin (tDCTN) through following viability parameters, after 24h of the cells treatment: MTT reduction (mitochondrial integrity), protein determination (cell number indication) and fosfatase activity (cell metabolism). Both inhibitors presented cytotoxic effect on HL60 cells. In relation to mitochondrial function and phosphatase activity, these cells presented only 20% of viability in presence of okadaic acid (100 nM) and pervanadate (200 1lM). For t-DCTN were obtained the following IC50 values: 500 and 300 mM for protein content and MTT reduction, respectively. Other approached aspect was the relation to cellular redox state with a possible differentiation and cell death induction. For this purpose were determined: NBT reduction, DNA fragmentation, the loss of plasma membrane asymmetry and total GSH. t-DCTN presented low capacity of differentiation induction (20%). However, in the presence of protein phosphatase inhibitors this effect was not observed. Apoptosis was induced when the cells were treated with okadaic acid (34%) and plus t-DCTN this effect was increased (65,28%). According to the results obtained, we can suggest the importance of chemical modulation of protein phosphatases in several cellular processes, since cytotoxic effects presented by these compounds could be explained by redox state changing and/or direct effect (adducts formation) on these enzymes or other macromolecules / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Edineis de Brito Guirardello / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-03T22:53:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pontes_Leticia_M.pdf: 1365128 bytes, checksum: 2adc023b7a2f6d8cfa4eac2e3f48ff86 (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: A capacidade de direcionar atenção é essencial para o funcionamento efetivo da vida diária, pois permite a pessoa perceber, pensar com clareza e manter atividade intencionada, apesar de distrações no ambiente. Um indivíduo com uma doença crônica, que ameaça a vida como a leucemia e seu processo de tratamento, pode ter um aumento do uso da capacidade de direcionar atenção por períodos intensos e prolongados. Este estudo de abordagem qualitativa objetivou analisar demandas de atenção, nos domínios afetivo, de informação, físico-ambiental e comportamental em pacientes com diagnóstico de leucemia submetidos a Transplante de Medula Óssea em um Serviço especializado de um Hospital Universitário, localizado no sul do Brasil. Os dados foram coletados por meio de entrevista semi-estruturada, sendo orientadas por cinco questões. O material transcrito foi categorizado e submetido a uma análise de conteúdo temática, frequêncial e por relevância. Os resultados mostraram que esses pacientes vivenciam múltiplas demandas de atenção, que exigem dos mesmos o uso do esforço mental para lidar com as situações impostas pelo tratamento. As demandas relacionadas ao domínio afetivo foram expressas por distanciamento da família; a morte como uma possibilidade; incerteza do futuro; o sentimento de compaixão e a dor. As demandas de informação foram o excesso, a imprecisão e a omissão de informações e as demandas relacionadas ao ambiente físico foram o espaço restrito; o excesso de manuseio e a internação prolongada. No que se refere ao domínio comportamental as demandas foram expressas pelo afastamento do trabalho; adaptação a novas rotinas e ausência de atividade. Este estudo alerta sobre a importância do enfermeiro conhecer as demandas de atenção a que esses pacientes estão expostos, de modo a intervir na implementação de estratégias para reduzir ou minimizar essas demandas durante o processo de cuidar. A reavaliação das rotinas da unidade, do processo de comunicação entre os profissionais e os pacientes, e o respeito às suas singularidades, constitui em uma das estratégias para reduzir ou minimizar essas demandas / Abstract: The capacity to focus attention is essential to the effective handling of everyday life for it allows one to perceive, think clearly and to keep the intended activity in course despite environmental distractions. An individual who has a chronic life -threatening disease, such as leukemia and undergoes its treatment process, can have his/her capacity to focus attention highly increased for intense and long periods. This qualitative approach study has aimed at identifying the main attention demands in terms of: environment, information, affection and behavior in patients diagnosed for leukemia and subjected to Bone Marrow Transplants at a specialized center provided by a University Hospital in the South of Brazil. The data has been collected through a semi-structured interview guided by five questions. The tape scripted material was categorized and analyzed according to an analysis of topic content based on its frequency and relevance. The results showed that the patients experience multiple demands for attention and care, which compels them to use mental effort in dealing with situations imposed by the treatment process. Demands regarding the affective domain were expressed by distance from family members, the uncertainty in their future, the death as a possibility, pain and feeling of compassion. The informational domain were too much information due to strict routine protocol and the physical environmental demands were too much nursing handling, restriction space to move around and long stay in the hospital. The behavioral domain were expressed by incapacity to continuing their work activity and adaptation to new routine. The study suggests that learning about the attentional demands that they are exposed to should be a nurse concern. The reevaluation of some routine, the amount of information and the way it is given to them could be one strategy to reduce these demands / Mestrado / Mestre em Enfermagem

Orientador: Sara T. O. Saad / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-07-24T22:00:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Brandao_MarceloMendes_M.pdf: 4459742 bytes, checksum: 267017db4dd878d082fc176c9f549218 (MD5) Previous issue date: 1999 / Resumo: Oncogenes são genes que afetam o crescimento e desenvolvimento celular normal. A maioria dos oncogenes se constitui de formas modificadas de genes normais, denominados de protoncogenes. o protoncogene RAS, encontrado em diversos organismos, codifica uma proteína com atividade de ligação à Guanina trifosfato (GTP) normal, sem atividade de GTPase. O gene RAS mutante é encontrado em muitos seres humanos com cânceres do pulmão, cólon e pâncreas; o produto deste gene mutante é responsável pela divisão incontrolada de células cancerosas. O óxido nítrico é uma importante molécula sinalizadora sintetizada em diversos tecidos humanos, por proteínas codificadas em uma família de genes da NO sintase . A produção de NOS pode ser induzida por diversas substâncias tais como, endotoxinas, citocinas, lipopolissacarídeos bacterianos (LPS) e por 1a-interleucina. O NO ativa a p21ras em células T humanas, como pode ser observado pelo aumento da ligação GTP-p21ras.Recentemente, um grupo de pesquisadores identificou o sítio de interação entre NO e p21ras que é responsável pela iniciação da transmissão do sinal. O presente trabalho teve como objetivo analisar a interação do NO com a proteína p21RAS em células de linhagens leucêmicas mielóide (U937, HL60 e K562) e estudar a expressão do RAS e da iNOS em pacientes com Leucemia Mielóide Aguda.Linhagens leucêmicas foram incubadas com o lipopolissacarídeo (LPS) e interferon y (IFNy) indutores da NO sintase. A expressão da iNOS e do RAS foi analisada através de imunocitoquímica, western blotting e citometria de fluxo. Para se confirmar o aumento da atividade do RAS foi analisada a fosforilação das MAPK p42/44. A dosagem de NO dissolvido no meio foi feita utilizando-se o reagente de Griess. Analisando os resultados obtidos foi possível chegar às seguintes conclusões: 1. Células de leucemia mielóide aguda apresentam superexpressão de iNOS. 2. O aumento da expressão da iNOS, em pacientes com LMA, é independente da p21 RAS. 3. Em linhagens leucêmicas com mutação no N-RAS houve maior - expressão da iNOS em condições basais e redução do NO após estímulo com LPS. 4. As linhagens leucêmicas K562, U937 e HL60 apresentam uma iNOS insensível à estimulação por LPS e IFNy, nos tempos e concentrações apresentadas. 5. A linhagem K562 possui RAS susceptível a aumento da sua expressão por estímulos de LPS e LPS + IFNy nos tempos e concentrações apresentadas / Abstract: Oncogenes are genes which affect the normal cellular growth and development. Most oncogenes are derived from normal genes, called protoncogenes. The protoncogene RAS, found in various organisms, codify a guanine triphophate linkage protein, without GTPase activity. The RAS mutant is found in some cancers as lung, breast and colon cancer. Nitric Oxide is an important signaling molecule synthesized, in many different human tissues, by a family of three Nitric Oxide Synthases. The NOS can be induced by addition of Human recombinant Interferon (lFN y), endotoxins, cytocins and bacterial Lipopolissacharide (LPS). Nitric Oxide can activate the RAS in Human T cells, by increasing GTP-p21ras ratio. Recently,the interactionsite was found on CYS 118 on the p21 molecule. The aim of the present study was to analyze the interaction between p21 and nitric oxide in myeloid leukemia cell lines (K562, HL60, and U937 and the expression of RAS and iNOS in human acute myeloid leukemia (AML). The main conclusions reached by this study were that AML cells overexpress iNOS, and this is independent of p21ras.Cultured cells with NRAS mutation express higher iNOS amo~nts, and decrease the NO amount when stimulated with LPS plus IFN. At ali incubation times and ali LPS and IFN concentrations, iNOS was insensible in culture cells. The K562 RAS are 68 liable to increase it's expression by stimulation with LPS and LPS+IFNy treatment at ali times and concentrations shown / Mestrado / Farmacologia / Mestre em Ciências Médicas