La composition en acides gras du tissu adipeux mammaire est reconnue comme marqueur qualitatif de la consommation lipidique antérieure mais aussi de la part nutritionnelle du risque / pronostic du cancer du sein. Ceci ouvre la perspective d’individualiser dans la population générale, un groupe de personnes à risque, susceptibles de bénéficier d’une intervention nutritionnelle ciblée. L’approche du dépistage d’une population à risque par l’utilisation de la composition du tissu adipeux comme biomarqueur se heurte i) à l’aspect invasif que représente le prélèvement d’un fragment de tissu adipeux mammaire, et ii) à la lourdeur contraignante du conditionnement et de l’analyse systématique des acides gras du tissu adipeux. Les méthodes analytiques actuellement disponibles sont incompatibles avec la perspective d’un dépistage de masse. Cependant, les descriptions récentes de l’utilisation de la spectroscopie par résonance magnétique (SRM) pour décrire la composition lipidique des triglycérides du tissu adipeux permettent d’envisager de l’utiliser dans cet objectif. Ce travail de thèse présente: 1) l’évaluation de la SRM pour caractériser la composition en acides gras du tissu adipeux chez l’animal (le rat) suite à une intervention nutritionnelle, 2) l’évaluation du profil lipidique du tissu adipeux par SRM chez la femme sur une plateforme clinique 3T, 3) l’étude des liens entre la composition en acides gras du tissu adipeux et la présentation du cancer du sein, et 4) la comparaison des données de la SRM in vitro (11.7T) et in vivo (3T) du tissu adipeux chez des patientes prises en charge pour un cancer du sein avec les données de la chromatographie gazeuse. / Fatty acid composition of the white adipose tissue remains the most reliable qualitative biomarker of previous dietary intake of fatty acids and may provide information on the nutritional part of the risk or evolution of breast cancer. This opens the prospect of individualization of women at high nutritional risk of breast cancer that may benefit from a targeted nutritional intervention but 1) the need for biopsy and 2) subsequent time-consuming biochemical analyses hamper any application of this approach. Proton magnetic resonance spectroscopy (1H-MRS) of adipose tissue lipids represents an appealing, non-invasive approach, which could circumvent these limitations. This manuscript reports: 1) an assessment of feasibility of (1H-MRS) to evaluate the consequences of a nutritional intervention in a rat mammary tumor model on the adipose tissue fatty acid composition, 2) an assessment of the feasibility of in vivo measurement of the fatty acid composition of breast adipose tissue by (1H-MRS) on a clinical platform, 3) an assessment of the relation of specific patterns of composition of adipose tissue fatty acids with the presentation of breast cancer, and 4) a comparison with gas chromatography of (1H-MRS) data acquired on breast adipose tissue in vitro (11.7T) and in vivo (3T) on patients managed for breast cancer.

Les copolymères à blocs amphiphiles peuvent s’auto-assembler sous forme de vésicules,appelées polymersomes. Ces vésicules ont été développées et étudiées depuis de nombreusesannées notamment pour l’encapsulation et la délivrance contrôlée de médicaments. Depuisquelques temps, elles connaissent des applications dans le domaine du biomimétisme cellulaire.Plus robustes que leurs analogues lipidiques (liposomes), les avantages à utiliser lespolymersomes comme mimes synthétiques de cellules biologiques ne sont plus à démontrer.Ainsi, des structures compartimentées à base de polymères ont été développés comme mimesstructurels de cellules. Ces systèmes ont été utilisés comme bioréacteurs, avec la réalisation deréactions chimiques ou enzymatiques en cascade en milieu confiné. Toutefois, l’un desobstacles qu’il reste à franchir est de trouver des moyens simples et efficaces pour déclencherla réaction au sein de ces systèmes. C’est dans ce contexte que s’inscrivent les travaux de cettethèse. Une membrane synthétique asymétrique à base de lipide et polymère a été développée etla méthode d’émulsion-centrifugation a été utilisée pour produire des systèmes compartimentésbiomimétiques. De plus, deux approches différentes ont été suivies pour provoquer la libérationcontrôlée d’espèces encapsulées, l’une utilisant la température et l’autre la lumière. Enfin, desétudes de co-encapsulation de cellules synthétiques (polymersomes) et biologiques au sein demilieux 3D ont été réalisées dans le but d’évaluer leur compatibilité et la possibilité de les cocultiver. / Amphiphilic block copolymers can self-assemble into vesicles, also called polymersomes.These vesicles have been developed and studied for many years especially in the field of drugloading and controlled release. More recently, their use as cell mimics have attracted a lot ofattention, mainly because polymersomes exhibit many advantages in contrast to their lipidicanalogues (liposomes). In such, compartmentalized polymer systems have especially beendeveloped as structural mimics of cells. These systems have found applications as bioreactorsthat can confine cascade chemical or enzymatic reactions. However, a major goal that stillremains to achieve is to find ways to trigger the beginning of these chemical reactions insidethe compartmentalized structures. The work carried out during this PhD thesis was actually totackle this challenge. A synthetic asymmetric lipid – polymer membrane, that mimics themembrane of biological cells was developed and the emulsion-centrifugation protocol wasfollowed to prepare biomimetic compartmentalized structures. In addition, two different waysto control the independent release of multiple species from individual compartments weredeveloped, based on temperature or light activation. Lastly, co-encapsulation of synthetic cells(polymersomes) and biological cells were performed in 3D media with the aim to study theircompatibility for co-culture experiments.

Depuis plusieurs années, la recherche dans le domaine des bioénergies s'oriente de plus en plus vers l'utilisation des microorganismes (bactéries, levures, moisissures et microalgues) pour la production de biocarburants. Face au contexte actuel de développement durable, l'utilisation des microorganismes oléagineux photoautotrophes (cyanobactéries et microalgues) semble potentiellement plus intéressante d'un point de vue économique (énergie solaire) et environnemental (assimilation de CO2) malgré des productions plus faibles que celles des microorganismes oléagineux hétérotrophes (levures et moisissures). L'objectif général de ces travaux de thèse a donc été d'étudier l'accumulation de lipides neutres et d'hydrocarbures chez Botryococcus braunii race A (chlorophycée unicellulaire d'eau douce), sélectionnée pour son potentiel de production après une étude bibliographique et d'évaluer les mécanismes naturels d'exsudation de ces métabolites. Afin de fiabiliser la quantification et l'identification des composés lipidiques produits par la microalgue, des méthodes d'analyse qualitative et quantitative par HPLC ont été mises au point. Les résultats analytiques ont permis de montrer que les méthodes d'extraction et quantification décrites dans la littérature conduisaient à surévaluer la teneur en hydrocarbures synthétisés par la souche B. braunii Utex 572. Les études menées lors de ce travail de thèse ont également permis de déterminer l'impact des principaux facteurs abiotiques (milieu de culture, pH, CO2, intensité lumineuse, salinité) sur la production de biomasse, lipides neutres et hydrocarbures par B. braunii et d'en définir les conditions optimales. L'étude de la flore bactérienne naturellement présente dans les cultures de B. braunii en conditions non axéniques et de sa dynamique a montré que celle-ci n'avait pas ou peu d'impact sur la production de biomasse et de lipides neutres chez B. braunii dans les conditions de l'étude. L'application d'un stress oxydatif à une culture de B. braunii en phase stationnaire n'a pas engendré le phénomène de « milking » recherché mais a eu un impact positif sur l'accumulation de lipides intracellulaires et sur la synthèse de triglycérides. / Biofuels produced from vegetable oils or microbial cultures, are an alternative to fossil fuels that can reduce the human impact on the environment. For several years, research in the field of bioenergy is moving increasingly toward the use of microorganisms (bacteria, yeasts, fungi and microalgae) for the production of biofuels. In the current context of sustainable development, the use of photoautotrophic oleaginous microorganisms (cyanobacteria and microalgae) seems potentially more interesting economically (solar energy) and environmentally (CO2 assimilation) despite lower production rates than those of heterotrophic oleaginous microorganisms (yeasts and moulds). The overall objective of this thesis has been to study the accumulation of neutral lipids and hydrocarbons in the A-race Botryococcus braunii (unicellular green alga of freshwater), selected on its potential production after literature review, and to evaluate the mechanisms of natural exudation of these metabolites. To reliable quantification and identification of lipid compounds produced by microalgae, methods of qualitative and quantitative analysis by HPLC were developed. The analytical results have shown that the extraction and quantification methods described in the literature led to overestimate the amount of hydrocarbons synthesized by the strain B. braunii Utex 572. The studies in this thesis have also identified the impact of key abiotic factors (culture medium pH, CO2, light intensity, salinity) on biomass production, neutral lipids and hydrocarbons by B. braunii and to define the optimal conditions of production. The study of the bacterial flora naturally present in cultures of B. braunii under non axenic conditions and its dynamics showed that it had little or no impact on the production of biomass and neutral lipids in B. braunii in the conditions of the study. The application of oxidative stress to a culture of B. braunii at the stationary phase did not cause the sought phenomenon of "milking" but had a positive impact on the accumulation of intracellular lipid and triglyceride synthesis.

Au cours de ces dernières années, des études ont montré l’existence d’une compartimentation latéraledes composants de la membrane plasmique végétale, de manière analogue à ce qui avait été montréchez les animaux et les levures. L’objectif de cette thèse était d’apporter de nouveaux éléments decaractérisation de cette compartimentation (propriétés physiques de domaines particuliers, mécanismesde mise en place de ces domaines, de contrôle de leur taille, etc…) et d’étudier son rôle dans laphysiologie de la cellule végétale.Le développement d’une méthodologie de microscopie confocale spectrale couplée à l’utilisationd’une sonde environnementale a permis d’apporter la première description à l'échellesubmicrométrique de l’organisation du plasmalemme en territoires aux propriétés physiquesdifférentiées. Ces domaines coexistent au sein de la membrane plasmique de cellules en suspension,comme à celle de membranes artificielles composées de lipides modèles ou de lipides de membranescellulaires, de vésicules géantes constituées de membrane plasmique purifiée, ou de protoplastes.Cependant, les différences de l’organisation latérale observées chez ces différentes membranes ontpermis de montrer l’importance des phytostérols qui seraient, par le biais d'interactions spécifiquesavec d’autres lipides végétaux tels que les GIPCs, des composés essentiels pour la formation locale dedomaines lipidiques ordonnés. La grande diversité des lipides végétaux organiserait ainsi lacompartimentation de la membrane plasmique permettant la ségrégation dynamique des composantsmembranaires. Si les stérols augmentent de manière importante le degré de compaction de la bicouche,les protéines le diminuent. Le cytosquelette et la paroi ne semblent, quant à eux, modifier ni laprésence, ni l’organisation des domaines ordonnés de la membrane plasmique. Nous avons égalementmontré que l’organisation de ces domaines évolue transitoirement lors des étapes précoces de lacascade de signalisation induite par des réactions de défense. De fait, nous avons identifié desmodifications des propriétés physiques globales et de l’organisation fine de la membrane provoquéespar différents éliciteurs de réactions de défense, dont la cryptogéine, une protéine sécrétée parl’oomycète Phytophthora cryptogea. Nous avons montré que ces modifications sont un élémentgénérique de la signalisation de défense, sous la dépendance de phénomènes de phosphorylation, leburst oxydatif étant également une étape clé de l’augmentation du degré d’ordre observé dans lesphases précoces de cette signalisation. La cryptogéine, qui présente une aptitude singulière pour piégerles stérols, a également montré une capacité spécifique à augmenter la fluidité membranaire, ceparamètre pouvant contrôler l’intensité de la cascade de signalisation, mesurée par la production deformes actives d’oxygène.Ces résultats ouvrent de nouvelles perspectives dans la compréhension des interactions cellule-élicitineet apportent un nouvel éclairage sur le rôle des lipides végétaux dans l’organisation latérale de lamembrane plasmique végétale et positionne la dynamique membranaire comme un élément designalisation de défense des plantes. / Recent studies have shown the existence of lateral sub-compartmentalization of plant plasmamembrane similar to that of animal cells and yeasts. The aim of this thesis was to provide newelements to characterize this compartmentalization (physical properties of specific domains,mechanisms of their formation, determination of their size, etc...) and to study its role in thephysiology of plant cells.The development spectral confocal microscopy coupled with the use of an environment-sensitiveprobe enabled to obtain the first description at the submicron scale of plasma membrane organizationinto domains exhibiting various physical properties. These domains coexist at the plasma membranesurface of tobacco suspension cells as well as the membrane of vesicles composed of models lipids orcell plasma membrane lipids, purified plasma membrane vesicles, and protoplasts. However,differences in the lateral organization observed in these membranes have shown the importance ofphytosterols which are, through specific interactions with neighboring plant lipids such as GIPCs,essential for local formation of ordered domains. The huge diversity of plant lipids drives thecompartmentalization of the plasma membrane allowing the dynamic segregation of membranecomponents. Sterols greatly increase membrane order, whereas proteins tends to decrease it.Cytoskeleton and cell wall do alter neither presence nor organization of ordered domains of the plasmamembrane. We have also shown that the organization of these domains is transiently modified duringthe early stages of defense signaling cascade. In fact, we have identified changes in overall physicalproperties and fine lateral organization of the membrane caused by various elicitors of defensereactions, including cryptogein, a protein secreted by the oomycete Phytophthora cryptogea. We haveshown that these changes are a generic element of defense signaling cascade and depend onphosphorylation processes; oxidative burst being also a major actor of the control of the increase ofmembrane order observed during the very early stages of the signalling process. Cryptogein, whichexhibits the particular ability to trap sterols, also showed a specific capacity to increase membranefluidity and amplify the intensity of the signalling cascade, as measured by the production of reactiveoxygen species.These results open new perspectives in the understanding of cell-elicitin interactions and provide anew view on the central role of sterol composition in the lateral organization of plant plasmamembrane. They also identify membrane dynamics as a new player in the signalling cascade occurringduring plant defense.

Le purinorécepteur P2X7 joue un rôle majeur dans les phénomènes de dégénérescences (Alzheimer, DMLA) et mort cellulaires. Récemment des études ont montré que l’activation basale de ce récepteur est indispensable dans le processus de cicatrisation et de prolifération cellulaire. Nous avons essayé de mieux comprendre le paradoxe de cette activation du récepteur P2X7 qui oriente vers la prolifération et même les métastases tumorales, mais aussi vers les mécanismes de dégénérescence cellulaire. L'influence du microenvironnement (Lipides, matrice extracellulaire, oxygène) apparait essentielle pour comprendre ces différents effets. Notre premier objectif a été d’étudier l’impact de la modulation du microenvironnement du récepteur P2X7 par des composants de la matrice extracellulaire. Ainsi, sur un modèle de cicatrisation cutanée, nous avons mis en évidence l’impact de la taille des fragments du hyaluronate de sodium (composant prédominant dans la matrice extracellulaire). Nos résultats ont montré que l’activation du récepteur P2X7 dépend du poids moléculaire du hyaluronate de sodium. Notre deuxième objectif a été de moduler le microenvironnement lipidique du récepteur P2X7. Nous avons sélectionné une huile riche en acides gras insaturés et avons ainsi étudié son effet sur l’activation du récepteur P2X7. Sur nos modèles de cicatrisation, nous avons mis en évidence qu’une modulation du microenvironnement lipidique du récepteur P2X7 influence son activation. D’autre part la modulation du microenvironnement lipidique sur des cellules tumorale de mélanome active les voies de dégénérescence ouvrant la perspective de nouvelles stratégies thérapeutiques. / The purinoceptor P2X7 plays a role in cytotoxic degenerative processus (Alzheimer, AMD) and cell death. Recent studies have shown that basal activation of this receptor is essential in the healing process and cell proliferation. We tried to understand the paradox that activation of P2X7 receptor that directs to the same proliferation and tumor metastasis, but also to the mechanisms of cell degeneration. The influence of the microenvironment (lipids, extracellular matrix, oxygen) appears essential to understand these effects. Our first objective was to study the impact of the modulation of P2X7 receptor microenvironment by extracellular matrix components. On cell monolayer model of wound healing we have highlighted the impact hyaluronan molecular weight (predominant component in the extracellular matrix). Our results showed that activation of P2X7 receptor is dependent on hyaluronan molecular weight. Our second objective was to modulate lipid microenvironment P2X7 receptor. We selected an oil rich in unsaturated fatty acids and thus have studied its effect on the activation of P2X7 receptor. In our models of healing and melanoma cell, we have demonstrated that modulation of lipid microenvironment affects P2X7 activation.

La cuticule est une couche hydrophobe déposée à la surface des organes aériens des plantes terrestres. Elle joue de nombreux rôles allant de la résistance face à divers stress biotiques et abiotiques à son implication dans divers processus de développement. Bien que la compréhension de la biosynthèse des composés cuticulaires a considérablement augmenté ces dernières années, les mécanismes de transport de ces lipides cuticulaires à travers la paroi et d'assemblage au sein de la cuticule, sont encore peu caractérisés. Les nsLTPs (non-specific Lipid Transfer Protein), sont codées par une famille multigénique impliquée dans de nombreuses fonctions biologiques. Parmi les rôles proposés pour les nsLTPs, il est supposé depuis longtemps qu'elles pourraient transporter les précurseurs cuticulaires à travers la paroi et ainsi contribuer à la formation de la cuticule. Dans ce travail de thèse, nous nous sommes servis du modèle des hypocotyles étiolés d'A. thaliana afin de caractériser le fonction biologique d'AtLTP2. En effet, AtLTP2 est une protéine de transfert de lipides présente de façon abondante et est la seule représentante des nsLTPs dans le protéome pariétal des hypocotyles étiolés. Nous avons tout d'abord confirmé que l'expression d'AtLTP2 est forte dans les très jeunes stades de développement de la plantule étiolée et est restreinte aux cellules de l'épiderme des organes aériens, sur lesquelles se dépose la cuticule. Conformément aux résultats de protéomique obtenus au préalable, AtLTP2 fusionnée à un marqueur fluorescent est localisée au niveau de la paroi mais également et de façon surprenante au niveau des plastes. Cette remarquable double localisation d'une nsLTP dans la paroi et dans les plastes n'a à ce jour, jamais été décrite. De plus, le mode de transport d'AtLTP2 vers les plastes est particulièrement original puisque la protéine emprunte d'abord la voie de sécrétion avant d'être finalement adressée aux plastes. En analysant l'adressage de différentes versions d'AtLTP2 tronquée, nous avons pu montrer que c'est certainement sa conformation tertiaire qui est cruciale pour sa localisation plastidiale. Par des approches de génétique inverse, nous avons pu montrer que les mutants atltp2 présentaient une augmentation importante de la perméabilité de sa cuticule fortement corrélée à une ultrastructure de l'interface cuticule-paroi très perturbée alors qu'aucun changement dans la composition biochimique de la cuticule n'a été détecté. Ces résultats nous ont permis de proposer un nouveau rôle structural pour AtLTP2, elle interviendrait pour maintenir l'adhésion des deux couches que sont la cuticule hydrophobe et la paroi hydrophile. Ainsi, en maintenant l'intégrité de l'interface entre la cuticule et la paroi, AtLTP2 participerait au maintien de la fonction de barrière cuticulaire limitant les pertes d'eau. De façon intéressante, la double localisation d'AtLTP2 dans la paroi et les plastes nous laisse supposer que d'autres fonctions pourraient être assignées à AtLTP2. L'identification des mécanismes moléculaires mis en jeu dans le maintien de l'homéostasie cuticule-paroi et dans la double localisation d'AtLTP2 constituera un challenge pour de futures recherches visant à toujours mieux identifier les acteurs de la formation de cette barrière protectrice, la cuticule. / The cuticle is a hydrophobic layer that covers the surface of the aerial organs of land plants. The cuticle plays numerous roles in plants from resistance against biotic and abiotic stresses to several developmental processes. Although the understanding of the biosynthesis of cuticle has considerably increased last years, the mechanisms underlying the transport of cuticular lipids through the cell wall and their assembly within the cuticle have been poorly characterized. nsLTPs (non-specific Lipid Transfer Proteins) are encoded by a multigenic family in A. thaliana and are involved in several biological processes. Among the different roles proposed for nsLTPs, it has long been suggested that they could transport cuticular precursor across the cell wall and then could contribute to the cuticle formation, despite the absence of formal evidence for individual members. Here we took advantage of the A. thaliana etiolated hypocotyls model to characterize the biological function of AtLTP2. Indeed, AtLTP2 was found to be abundant and the unique nsLTP member in the cell wall proteome of etiolated hypocotyls. We have first confirmed the high level of AtLTP2 expression during the young developmental stages of etiolated seedlings that was restricted to the epidermal cells of aerial organs, that are covered by the cuticle. In agreement with the cell wall localization determined by previous proteomic studies, we localized AtLTP2 fused to a fluorescent marker to the cell wall, but also and surprisingly to the plastids. This remarkable dual localization in the cell wall and plastids was never described before for a nsLTP. Furthermore, the mechanism of AtLTP2 transport to the plastids was particularly original because AtLTP2 can first undergo import into the ER/ secretory pathway and then sorting to the cell wall and the plastids. By studying the sub-cellular localization of truncated version of AtLTP2, we have shown that its tertiary conformation was crucial for the plastidial localization. By using reverse genetic approaches, we have shown that atltp2 mutants displayed a high increase in cuticle permeability strongly correlated with a deep modification of the ultra-structure at the cuticle-cell wall interface, while no changes in biochemical composition of the cuticle were detected. These results prompt us to suggest a novel structural role for AtLTP2. AtLTP2 could be involved in maintaining the accurate sealing between the hydrophobic cuticle and the hydrophilic underlying cell wall. Then, by preserving the integrity of the cuticle-cell wall interface, AtLTP2 could act on the barrier function of the cuticle limiting water loss. Interestingly, the dual localization to the cell wall and plastids suggested that other functions could be assigned to AtLTP2. The elucidation of the molecular mechanisms by which AtLTP2 establish cell wall-cuticle homeostasis and the exact function of the dual targeting will be challenging tasks in the future to better identify the main actors of the formation of the cuticle.

Les cellules eucaryotes possèdent un territoire membranaire dit « électrostatique » qui est définit par la présence de phospholipides négativement chargés sur la face cytosolique des membranes. Cette propriété permet le recrutement de protéine cytosolique contenant des motifs/domaines positivement chargés au niveau des membranes via des interactions électrostatiques. Nous nous sommes demandés si le territoire électrostatique est présent chez les cellules végétales et quel est son organisation ? Quels sont le(s) lipide(s) anionique(s) impliqués dans son maintien ? Et quel est son (ces) rôle(s) dans la signalisation et le développement des plantes ? Premièrement, nous avons mis en avant que la membrane plasmique est le compartiment intracellulaire le plus électronégativement chargé (Simon, Platre et al., 2016 Nature Plants). Ce champ électrostatique est gouverné par trois lipides anioniques différents, l’acide phosphatidique, la phosphatidylserine et le phosphatidylinositol-4-phosphate. Nous avons montré que cette propriété unique de la membrane plasmique permet de réguler des voies de signalisation hormonale, tel que celle de l’auxine et des brassinostéroïdes. Notamment, la phosphatidylserine régule la dynamique spatiotemporelle des petites GTPases de la famille Rho. En réponse à l’auxine, ce lipide permet de regrouper les protéines Rho dans des domaines membranaires. La formation de ces domaines est requise pour l’activité de ces protéines permettant de contrôler l’endocytose, la dynamique du cytosquelette mais également régule la morphogenèse cellulaire ainsi que la réponse gravitropique de la racine. / The « electrostatic territory» is part of the eukaryotic membrane organization and is defined by the enrichment of negatively charged phospholipids at the membrane cytosolic face. This feature is involved in the membrane recruitment of cytosolic proteins, which contain positively charged motifs and/or domains. In this work, we used Arabidopsis thaliana as a model and explored the existence of an electrostatic territory in plant cells. We found that the plasma membrane is the most anionic intracellular membrane (Simon, Platre et al., 2016 Nature Plants). This electrostatic field is maintained by lipid cooperation between, phosphatidic acid, phosphatidylserine and phosphatidylinositol-4-phosphate. The cell surface unique feature is involved in the regulation of hormonal signalling such as auxin and brassinosteroids pathways. We found that phosphatidylserine tunes the spatiotemporal dynamics of small GTPases from the Rho family. During auxin response, PS is required to cluster Rho into specialized membrane domains. We show that nanocluster formation is required for Rho-mediated auxin signaling including the regulation of endocytosis, cytoskeleton organization, morphogenesis and the root gravitropic response.

Le but de ce travail de doctorat est de contribuer à l'optimisation de l'accumulation de lipides par les levures oléagineuses, et plus particulièrement par la levure Yarrowia lipolytica à partir du glucose, avec une stratégie d’optimisation dynamique à partir d’une commande basée sur un modèle. L’étude bibliographique permet de faire le bilan des connaissances antérieures pour identifier les différentes méthodologies existantes pour l’optimisation des procédés en structurant trois parties principales: la modélisation, la commande, et le suivi des procédés. Dans ce contexte, cinq modèles ont été proposés pour décrire l'accumulation de lipides. Le premier est un modèle non structuré basé sur des cinétiques de Monod et d’inhibition. Le deuxième s’appuie sur le modèle de Droop (quota) précédemment utilisé pour décrire l’accumulation de lipides dans les microalgues. Les trois derniers sont des modèles métaboliques dynamiques qui combinent les cinétiques avec un réseau métabolique réduit, obtenu à partir des modes élémentaires. Les cinq modèles ont été calibrés et validés en utilisant plusieurs jeux des données expérimentales. Néanmoins, un des avantages des modèles métaboliques dynamiques présentés est la possibilité de décrire les basculements métaboliques. Deux stratégies de commande multi-objective visant à maximiser la productivité des lipides et la fraction en teneur lipidique ont été proposées. Dans la première, les deux objectifs ont été pondérés par le calcul statique des fronts de Pareto, et intégrés à la stratégie de commande avec un modèle dynamique métabolique. La deuxième stratégie est basée sur des fonctions linéaires par morceaux en intégrant le modèle quota. Les simulations de la commande montrent la possibilité d’atteindre des teneurs en lipides entre 0,21 – 0,26 gLIP.gX-1 et productivités entre 0,78 – 1,02 g.(L-h)-1 en diminuant le temps de la culture à 20 h. Des capteurs logiciels ont été proposés afin de pallier le manque de capteurs en ligne en corrélant des mesures en ligne (i.e. pO2 et la base ajoutée pour le pH) par des algorithmes de types machines à vecteurs supports. La validation expérimentale des stratégies de commande est la principale perspective de ce travail. / This PhD thesis aims at optimizing lipid accumulation by oleaginous yeast, and most particularly by the yeast Yarrowia lipolytica from glucose. This optimization is addressed from a mathemantical point of view based on automatic control laws, where model-based control strategies are proposed. The bibliographic review compiles and evaluates previous works to identify the different existing methodologies to attain the optimization, which is divided in three main axes: modeling, control strategies, and monitoring. In this context, five different models are proposed to describe lipid accumulation. The first model is based on Monod and inhibition kinetics (unstructured), and the second on the Droop quota model (quota) previously used for microalgae. The last three are dynamic metabolic models that combine kinetics with metabolic models based on the stoichiometry of metabolism. These three models used a reduced metabolic network decomposed into elementary flux modes. The five models were successfully calibrated and validated with different experimental data. Nonetheless, the dynamic metabolic models presented highlighting features such as the description of metabolic shifts. Two approaches of multi-objective control strategies aiming at maximizing lipid productivity and lipid content fraction were proposed. In the first, the two objectives were weighted by static calculation of Pareto fronts, and integrated to the control strategy by dynamic optimization algorithms with a dynamic metabolic model. The second strategy used a constant weighed objective function solved by piecewise linear functions by integrating the quota model. The simulation results of the optimization attained lipid contents between 0.21 – 0.26 gLIP.gX-1 and productivities between 0.78 – 1.02 g.(L-h)-1 shortening the culture time to 20 h. Soft-sensors were developed by correlating on-line measurements (i.e. pO2 and the added base for pH) through support vector machines in order to overcome the lack of measurements. The perspective is to experimentally validate the control strategies.

Les transporteurs à ATP binding cassette (ABC) peuvent transporter une grande variété de substrats utilisant l'ATP-Mg2+ comme source d'énergie. Ces transporteurs sont présents dans toutes les formes de vie et sont impliqués dans la résistance aux médicaments, comprenant les anticancéreux et les antibiotiques. Mes travaux de thèse se concentrent sur le transporteur BmrA (130 kDa) de Bacillus subtilis utilisé en tant que système modèle et homologue de la P-glycoprotéine humaine impliquée dans la multirésistance aux anticancéreux. Dans ces travaux nous montrons que la reconstitution de cette protéine dans les lipides de Bacillus subtilis répond aux deux exigences centrales pour RMN: haut rapport signal sur bruit et la stabilité de l'échantillon sur une période de plusieurs années. Les spectres obtenus indiquent une protéine bien repliée et une préparation très homogène, comme en témoignent les lignes de résonance étroites et la dispersion du signal typique de la distribution de structure secondaire attendue de la protéine membranaire. Nous avons adapté la méthode GRecon utilisée dans les études de microscopie électronique pour la reconstitution des protéines membranaires pour la RMN à l'état solide. Nous avons suivi en détail la reconstitution du transporteur ABC BmrA par dialyse comme référence, et établi des conditions optimales de reconstitution en utilisant un gradient combiné de saccharose / cyclodextrine / lipide caractérisant GRecon. Les spectres RMN de l‘échantillon reconstitué par GRecon sont très similaire à ceux obtenus précédemment sur des échantillons reconstitués par dialyse. La préparation d'échantillons par GRecon présente un gain de temps de près d'un ordre de grandeur. Afin d'étudier les états ouvert vers l'intérieur (inward-facing IF) et ouvert vers l'extérieur (outward-facing OF) du transporteur, nous avons développé un protocole reproductible et quantitatif induisant l'état OF. Nous avons enregistré des spectres bidimensionnels RMN à l'état solide avec différents temps de mélange (20 et 200 ms) afin de suivre les changements des déplacements chimiques et d'identifier les résidus par des corrélations séquentielles. L'apparition très apparente de nouveaux signaux concomitants à la grande amplitude des perturbations de déplacement chimique (CSP) met en évidence l'importante flexibilité et les changements conformationnels de la protéine en présence d'ATP: Mg2+. Afin d'identifier les résidus apparaissant dans les spectres, nous avons utilisé le remplacement paramagnétique du co-facteur Mg2+ par du Mn2+. Cette méthode a révélé que les acides aminés apparaissant dans les spectres sont situés à proximité du site de liaison de l'ATP. En outre, les mesures EPR ont confirmé l'état fermé de la protéine en identifiant la distance correspondant à 1,8 nm entre deux atomes de Mn2+. Nous avons étudié les différences conformationnelles entre l'état IF et OF de BmrA. L'observation de nombreux CSP, ainsi que l'apparition de nouveaux signaux sont observés pour un mutant ne pouvant pas hydrolyser l'ATP, indiquant que l'hydrolyse n'est pas nécessaire pour la transition IF à OF dans BmrA. Nous avons également analysé le mécanisme lié au motif X-loop décrit comme étant impliqué dans la communication entre deux domaines de la protéine. Nous avons observé pour une protéine mutante dans laquelle le transport est aboli mais qui reste ATPase active, une transition incomplète puisque seul un sous-ensemble de CSPs est observé, ainsi qu'un manque de rigidification. Ces mesures suggèrent que la flexibilité semble être le point central dans la transmission des changements conformationnels nécessaires de la partie motrice à la partie d'exportation de molécules. Ces observations montrent que ce système serait semblable à un moteur tournant à plein régime qui ne serait pas connecté de manière rigide à un arbre de transmission le reliant au système de transport / ATP binding cassette (ABC) transporters can translocate a variety of molecules by coupling drug/lipid efflux with an ATP-Mg2+ fuelled engine. They are found in all forms of life and they are involved in a number of drug resistances including anti-cancer drugs and antibiotics. My studies focus on the drug exporter BmrA (130 kDa) from Bacillus subtilis as a model system and homologue of the human P-glycoprotein that is involved in multidrug resistance in cancer. We show that the reconstitution of this protein in lipids from Bacillus subtilis at a lipid-protein ratio of 0.5 m/m allows an optimal protein insertion into lipid bilayer as well as it complies with the two central NMR requirements: high signal-to-noise in the spectra and sample stability over a time period of years. The obtained spectra point to a well-folded protein and a highly homogenous preparation, as witnessed by the narrow resonance lines and the signal dispersion typical of the expected secondary structure distribution of the membrane protein. In the same time, we adapted the GRecon method used in electron microscopy studies for membrane protein reconstitution to the needs of solid-state NMR sample preparation. We followed in detail the reconstitution of the ABC transporter BmrA by dialysis as a reference, and established optimal reconstitution conditions using the combined sucrose/cyclodextrin/lipid gradient characterizing GRecon. NMR spectra recorded on a sample produced by GRecon showed a highly similar fingerprint as those recorded previously on samples reconstituted by dialysis. GRecon sample preparation presents a gain in time of nearly an order of magnitude for reconstitution. In order to study the inward-facing (IF) and the outward-facing (OF) state of the transporter, we developed a reproducible and quantitative protocol of ATP:Mg2+:VO43- addition inducing the OF state. We used selectively labelled samples obtained by the addition of natural abundance residues in the bacterial medium in order to reduce the number of signals in the spectra of this large protein. We recorded solid-state NMR two-dimensional spectra with different mixing times (20 and 200 ms) in order to follow chemical shift changes and identify residues by sequential correlations. The very noticeable apparition of new signals concomitant with the large amplitude of chemical shift perturbations (CSPs) highlight the important flexibility and conformational changes of the protein in presence of ATP:Mg2+:VO43- substrate. In order to identify the residues appearing in the spectra, we use paramagnetic replacement by Mn2+ of the Mg2+ acting as a co-factor in the active site. The paramagnetic relaxation enhancements caused the Mn2+ revealed that the amino acids appearing in the spectra are located in proximity to the ATP binding pocket. Besides, EPR measurements confirmed the closed state of the protein by identifying the corresponding 1.8 nm distances between two Mn2+. We investigate on the conformational differences identified between the IF and OF state in the ABC transporter BmrA reconstituted in its natural lipids. The observation of numerous CSPs, as well as the apparition new signals are observed for a hydrolysis-incompetent mutant on addition of ATP, indicating that hydrolysis is not required for the IF to OF transition in BmrA. We also analyze the mechanistic of the X-loop motif described to be involved in the communication between two domains of the protein. We observe for a mutant protein in which transport is abolished, but which remains ATPase active, an incomplete transition since only a subset of CSPs is observed, as well as lack of rigidification. This suggests that the change in dynamics might be central for transmitting the relevant conformational changes to the part of the protein driving transport, concomitant of an engine which is turning an input shaft, but which fails to connect in a rigid manner, trough adequate gears, with the output shaft driving the pump

In the past fifteen years, ubiquitin has emerged as a central regulator of membrane protein trafficking. In this context, covalent attachment of this small protein to lysine residues of cargo proteins, a reversible modification termed ubiquitylation, provides a signal for their targeting to the vacuolar/lysosomal lumen where they are degraded, both in yeast and higher eukaryotes. Ubiquitylation is also used as a means of controlling the function of specific proteins in several trafficking machineries. The role of lipids - and in particular of membrane domains named lipid rafts - in controlling the intracellular trafficking of membrane proteins has also been the subject of intense investigation in recent years.<p>One of the membrane proteins of the yeast Saccharomyces cerevisiae whose intracellular trafficking has been extensively studied is the general amino acid permease Gap1. Yet some aspects of the function of ubiquitin in the nitrogen-dependent control of this protein remain controversial. Moreover, the potential role of lipid rafts in regulating the functional properties and traffic of the Gap1 permease had not been investigated before this thesis work. <p>The first part of our work readdresses the role of Gap1 ubiquitylation, and more precisely of the modification of the permease with polyubiquitin chains linked through the lysine 63 of ubiquitin, in controlling the fate of this protein in the secretory pathway. Our observations indicate that nitrogen-induced ubiquitylation of newly synthesised Gap1 occurs in the trans-Golgi complex. However, contrary to the generally accepted view, this modification is not necessary for the permease to exit this compartment en route to the endosome but only for its subsequent targeting to the vacuolar lumen via the multivesicular body (MVB) pathway. Our results also provide evidence that K63-linked polyubiquitylation is important mostly at the late endosomal level, for proper sorting of Gap1 into the MVB pathway, whether the permease comes from the cell surface by endocytosis or directly from the secretory pathway. <p>In the second part of this work, we present a set of data providing novel insights into the controversial question of the exact nature of lipid rafts in yeast. We first showed that the Gap1 permease is associated with detergent-resistant membranes (DRMs) - the proposed biochemical equivalent of lipid rafts - when it is located at the cell surface. Our data further suggest that this may be true for most if not all yeast plasma membrane proteins. Moreover, we found that Gap1 production must be coupled to de novo synthesis of sphingolipids (SLs), major constituents of rafts, in order for the newly synthesised permease to be correctly folded, active, associated with DRMs, and stable at the cell surface. We propose a model where Gap1 would associate with newly synthesised SLs during its biogenesis and/or secretion, this association shaping the permease into its native conformation and ensuring its incorporation and stabilisation in specific lipid domains at the plasma membrane. Failure of Gap1 to acquire this lipidic microenvironment in turns leads to its ubiquitin-dependent degradation by a quality-control mechanism. This model might be valid for many other plasma membrane proteins and might account for their lateral distribution between distinct membrane domains. <p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished