Voltage-dependent anion-selective channels (VDAC), or mitochondrial porins,regulate the flow of metabolites across the mitochondrial outer membrane. They presumably span the membrane as β-barrels, but the residues forming the individual β-strands are unknown. This information is essential for understanding the structure and function of the protein. Using Neurospora VDAC as a template, published data were reassessed to delineate a unified model for porin structure Bay and Court 2002, which was subsequently refined in collaboration with Greg Runke Runke et al. 2006. The focus of this work was the development and analysis of systems for maintaining high levels of folded porin for the acquisition of high resolution data needed for model testing. The conformation of hexahistidinyl-tagged Neurospora porin in detergent was probed by fluorescence, near-UV circular dichroism and ultraviolet absorption spectroscopy. Derivatives of tryptophan and tyrosine were also examined by fluorescence spectroscopy and UV absorbance spectroscopy to model the interactions between the detergents and the amino acid side chains in the protein. Detergent-specific levels of β-strand and tyrosine exposure were observed. In all cases, the two tryptophan residues reside in weakly asymmetric, hydrophobic environments, suggesting transient tertiary interactions. Porin solubilized in these detergents forms functional channels in liposomes and membrane insertion is accompanied by increased levels of β-strand and loss of protease sensitivity. These data were used to develop mixed detergent folding systems. A mixture of SDS and dodecyl-β-D-maltopyranoside (DDM)supports a β-strand rich conformation at high protein concentrations. The tertiary contacts and protease resistance of the SDS/DDM solubilized porin are very similar to those of the protein following reconstitution into liposomes. Finally, the role of sterols in porin folding was examined, as the addition of sterols to detergent-solubilized VDAC is required for channel formation in artificial membranes. Sterols do not alter the secondary structure of VDAC, and subtle alterations to tertiary interactions were detected, suggesting that sterols do not promote an insertion-competent structure, but rather facilitate insertion into artificial bilayers. In summary, this analysis of the folded states of detergent-solubilized porin has revealed a system that maintains high concentrations of mitochondrial porin in a state that is very promising for structural studies. / February 2007

Fluorescence microscopy is a powerful analytical tool for visualizing biological processes at the subcellular level. In this regard, 1,3,5-triarylpyrazoline based fluorescent probes which act as "turn-on" probes, have been extensively researched. These probes achieve their fluorescence "turn-on" response by inhibition of fluorescence quenching by acceptor-excited photoinduced electron transfer upon binding of an analyte. It has been recently shown that some fluorescent probes used in biological research form colloids composed of nanoparticles, due to their hydrophobic character. This hydrophobic character can also lead to partitioning of the probe into cellular membranes. Colloid formation and membrane partitioning may affect the probes' photophysical properties such as absorption and emission wavelength and quantum yields. Recently, a series of 1,3,5-triarylpyrazolines synthesized in our group by M. T. Morgan, showed no formation of aggregates in aqueous buffer. Surprisingly, these probes increased their fluorescence intensity in the presence of liposomes. The photoinduced electron transfer process is greatly affected by the polarity of the medium in which the probe is used. In this study, the effect of membrane proximity on the photoinduced electron transfer process for pyrazoline based "turn-on" probes has been investigated. A series of water soluble 1,3,5-triarylpyrazolines have been synthesized in which a N,N-dialkylaniline moiety acts as an electron donor and a proton acceptor and an alkylated sulfonamide moiety acts as a molecular anchor for interaction with neutral and anionic liposomes.

Τα λιποσώματα αναπτύχθηκαν αρχικά από τον Alec Bangham το 1964. Έκτοτε μελετώνται τόσο ως φορείς βιοδραστικών ενώσεων όσο και ως μοντέλα βιολογικών μεμβρανών με σκοπό την αποσαφήνιση της δομής και των λειτουργιών τους. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι αποτελούνται από τα ίδια δομικά συστατικά με εκείνα των βιολογικών μεμβρανών και η ευελιξία της δομής τους προσφέρει τη δυνατότητα προσομοίωσης της δομής και σύστασης διαφορετικών βιολογικών μεμβρανών. Στις εφαρμογές του ψυχρού πλάσματος ατμοσφαιρικής πίεσης, cold atmospheric pressure plasma (CAPP), που μελετώνται τα τελευταία χρόνια συγκαταλέγονται και βιοιατρικές εφαρμογές. Συγκεκριμένα μελετάται η χρήση του ως μέσω απολύμανσης και αποστείρωσης, στην ανάπλαση δέρματος, ως αντικαρκινική θεραπεία κ.τ.λ. Εντούτοις ο ακριβής μηχανισμός της αλληλεπίδρασης του ψυχρού πλάσματος ατμοσφαιρικής πίεσης με κύτταρα και ιστούς δεν είναι ακόμα πλήρως κατανοητός. Παρότι οι μέχρι τώρα μελέτες για την αποσαφήνιση της αλληλεπίδρασης αυτής πραγματοποιούνται με την χρήση κυτταρικών καλλιεργειών, η χρήση λιποσωμάτων είναι μια πιθανή εναλλακτική. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι η χρήση λιποσωμικών διασπορών, ως μοντέλα κυττάρων, έχει αποδειχθεί μια πιο εύκολη, ταχύτερη και χαμηλότερου κόστους εναλλακτική των κυτταρικών καλλιεργειών για την αποσαφήνιση βιολογικών διεργασιών. Η παρούσα εργασία έχει ως σκοπό τη διερεύνηση της δυνατότητας χρήσης των λιποσωμάτων ως μοντέλα βιολογικών μεμβρανών για την μελέτη της αλληλεπίδρασης του CAPP με κύτταρα. Μελετήθηκε η αλληλεπίδραση λιποσωμάτων – CAPP και επιχειρήθηκε η παραμετροποίηση της αλληλεπίδρασης αυτής. Τα λιποσώματα, που εγκλωβίζουν υδατικό διάλυμα καλσεΐνης, παρασκευάσθηκαν με την τεχνική της ενυδάτωσης λεπτού υμενίου και έγινε χρήση υπερήχησης με σκοπό την μείωση του μεγέθους τους. Τα λιπίδια που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: φωσφατιδυλοχολίνη, φωσφατιδυλογλυκερόλη και χοληστερόλη. Υπέστησαν επεξεργασία τόσο με CAPP όσο και με αφόρτιστο φέρον αέριο. Ο χαρακτηρισμός των λιποσωμάτων έγινε μέσω μέτρησης των φυσικοχημικών τους χαρακτηριστικών. Ως μέτρο της αλληλεπίδρασης CAPP-λιποσωμάτων χρησιμοποιήθηκε η μεταβολή του εγκλωβισμού της καλσεΐνης. Επιπλέον πραγματοποιήθηκε μορφολογική ανάλυση των λιποσωμάτων, μέσω ηλεκτρονιακής μικροσκοπίας σάρωσης, πριν και μετά την επεξεργασία. Με σκοπό την παραμετροποίηση της αλληλεπίδρασης αυτής έγινε μελέτη της μεταβολής των φυσικοχημικών ιδιοτήτων των λιποσωμάτων ως συνάρτηση του χρονικού διαστήματος επεξεργασίας και του χρόνου επώασης (σε PBS στους 4C) μετά την επεξεργασία. Επιπλέον πραγματοποιήθηκαν πειράματα αλληλεπίδρασης του CAPP με κύτταρα B-16, καρκινικά κύτταρα μελανώματος ποντικού. Ως οι κυριότεροι παράγοντες της αλληλεπίδρασης CAPP – λιποσωμάτων διαφαίνονται η συγκέντρωση της λιποσωμικής διασποράς και ο χρόνος επεξεργασίας. Η μείωση του ποσοστού εγκλωβισμού της καλσεΐνης αυξάνεται ανάλογα με την αύξηση τόσο της συγκέντρωσης όσο και του χρόνου επεξεργασίας. Επιπλέον η λιπιδική σύσταση επηρεάζει το αποτέλεσμα της αλληλεπίδρασης. Η ύπαρξη αρνητικού επιφανειακού φορτίου επηρεάζει θετικά το αποτέλεσμα της αλληλεπίδρασης ενώ η ύπαρξη χοληστερόλης οδηγεί σε πιο ανθεκτικά λιποσώματα μόνο στη μέγιστη συγκέντρωση (50%). Μείωση του μεγέθους και του αριθμού των διπλοστιβάδων των λιποσωμάτων οδηγεί σε πιο ευαίσθητα κυστίδια. Διαφυγή της καλσεΐνης παρατηρήθηκε μέχρι και 96 ώρες μετά την επεξεργασία ενώ με το πέρας του χρόνου παρατηρήθηκε επιπλέον συσσωμάτωση των κυστιδίων, το οποίο επιβεβαιώνεται με μορφολογικές μελέτες, και μεταβολή τους επιφανειακού τους φορτίου. Η επίδραση του CAPP στα κύτταρα Β-16 επηρεάζεται τόσο από την αρχική πληρότητα (confluence) της καλλιέργειας όσο και από τις διαστάσεις των κελιών της χρησιμοποιούμενης πλάκας. Παρότι η ανωτέρω ανάλυση υποστηρίζει την αρχική υπόθεση, απαιτείται περαιτέρω διερεύνηση της αλληλεπίδρασης του CAPP με βιολογικά δείγματα. / Liposomes were originally developed by Alec Bangham in 1964. Since then, they have been studied as carriers of bioactive compounds and as biological membrane models in structural and functional studies. This is due to the fact that they are composed of the same building blocks as biological membranes and because their structural versatility offers the opportunity to create vesicles that resemble the structure and composition of different biological membranes. In recent years cold atmospheric pressure plasma, CAPP, has been studied for a variety of applications some of which are found in the biomedical milieu. More precisely these applications include: decontamination, sterilization, skin regeneration, tumor treatment, etc. Nevertheless the exact mechanism of the interaction between CAPP and cells/tissue is not yet completely understood. Although currently researchers use cell cultures to investigate this interaction, liposomes could be an alternative. The applicability of liposomal dispersions, as cell models, has proved to be an easier, faster and less expensive tool for the investigation of cell – cellular environment interactions. The purpose of this thesis was to investigate the possibility of using liposomes as cell membrane models to study the CAPP-cells interactions. The CAPP-liposomes interaction was studied and parameterization of this interaction was attempted. Calcein-encapsulating liposomes were prepared using the thin-film hydration technique and the sonication technique was used to decrease the size of the vesicles. The lipids used were: phosphatidylcholine, phosphatidylglycerol and cholesterol. The samples were treated both with CAPP and with the uncharged carrier-gas. Characterization of liposomes was made by measuring their physicochemical characteristics. The variation of the percent of calcein encapsulation was used to measure the effect of CAPP-liposomes interaction. Moreover morphological evaluation of the samples before and after treatment was realized thought scanning electron microscopy, SEM. The variation of liposomes’ physicochemical characteristics versus time, duration of treatment and incubation (in PBS at 4C), was realized in order to parameterize this interaction. The effect of CAPP on B-16 cells, mouse melanoma cancer cells, was also investigated. The major parameters of the CAPP-liposomes interaction were proved to be the concentration of the liposomal dispersion and the duration of treatment. The increase of both the lipid concentration and the duration of treatment lead to increase of the reduction of calcein’s encapsulation provoked by CAPP treatment. The composition of the liposomal membrane also affects the interaction’s result. Negative surface charge increases the impact of CAPP and the presence of cholesterol leads to more stable structures only when its concentration is maximum (50%). Reduction of the size and lamellarity of the vesicles leads to more fragile liposomes. Release of calcein was observed even 96 hours after treatment in combination with aggregation of the vesicles, which was also proved via morphological evaluation, and change of liposomes’ surface charge. The impact of CAPP treatment on B-16 cells seems to depend on the initial confluence of the culture as well as the dimensions of the plate’s wells. Although the aforementioned analysis supports the initial hypothesis, further investigation of the interaction between CAPP and biological samples is necessary.

Curcumin (CURC) was incorporated in liposomes as free drug or after formation of hydropropyl-β- or hydroxypropyl-γ-cyclodextrin (HPβCD or HPγCD) complexes prepared by co-precipitation and characterized by X-ray diffractometry. Liposomes encapsulating CURC as free drug or CD-complexes (hybrid formulations) were prepared by the dehydration–rehydration vesicle (DRV) method followed by extrusion, and characterized for size, zeta-potential and CURC loading. CURC stability (at 0.01 and 0.05 mg/mL) in 80% (v/v) fetal bovine serum (FBS) was evaluated at 37 oC. Results demonstrate that HPβCD stabilizes CURC more than HPCD, but liposome encapsulation provides substantially more protection, than CDs. CURC stabilization is similar, when encapsulated as free compound or CD-complex. However, the last method increases CURC loading by 23 times (depending on the lipid composition of liposomes and the CD used), resulting in higher solubility. The stability profile of CURC in serum depends on the composition of liposomes and CURC concentration, since at lower concentrations larger CURC fractions are protected due to protein binding. Compared to the corresponding CD complexes, hybrid formulations provide intermediate CURC solubility (comparable to HPβCD) but profoundly higher stabilization. After identifying that CURC formulations are active against B16 melanoma cells (in vitro), the optimal concentrations of CURC and doxorubicin (DOX) combinations (which provided highest anticancer activity [in vitro]) were identified. In a second step, combination hybrid-liposomal formulations of CURC and DOX were prepared, as a technique to deliver the specific combination of the two drugs to cancer cells following in vivo administration (since the two drugs have different pharmacokinetics and would not reach cancer cells at the same ratio if administered as free drugs). Additionally the effect of ceramide incorporation in the liposomal membrane on the anticancer activity of the later combination-formulations was investigated. The liposomal CURC-DOX combination formulations demonstrated significantly enhanced anticancer activity, compared to liposomes with DOX only. As confirmed by FACS analysis and uptake studies, this enhanced effect was due to increased uptake of DOX by the cells, in the presence of CURC (which was not seen when free compounds were used). Although a positive effect of ceramide addition in liposomal-DOX anticancer activity was demonstrated, in agreement with previous studies, ceramide addition did not result in further increase of the anticancer activity of the CURC-DOX combination formulations, when tested by MTT assay. However, mechanistic studies revealed that the CURC-DOX formulations resulted in higher percentage of early apoptotic cells, compared to the ceramide-DOX formulations which resulted mainly in late-apoptotic cells. When all CURC-DOX and Ceramide were combined in the same formulation, the percentages of early and late apoptotic cells were additive. / Η Κουρκουμίνη (CURC) ενσωματώθηκε σε λιποσώματα ως ελεύθερο μόριο ή ως σύμπλοκο εγκλεισμού με υδροξυπροπυλο-β-κυκλοδεξτρίνη ή υδροξυπροπυλο-γ-κυκλοδεξτρίνη (HPβCDorHPCD); Τα σύμπλοκα παρασκευάστηκαν με την τεχνική της συγκαταβύθισης και χαρακτηρίστηκαν με ακτίνες-Χ. Συμβατικά λιποσώματα (που ενσωματώνουν την CURC ωε ελεύθερο μόριο) και υβριδικά, που την εγκλωβίζουν ως σύμπλοκο-εγκλεισμού, παρασκευάστηκαν με την τεχνική DRV και εξώθηση διαμέσου μεμβρανών, και αφού χαρακτηρίστηκαν φυσικοχημικά (φόρτωση CURC, μέση διάμετρος, πολυδιασπορά και ζ-δυναμικό), μελετήθηκε η σταθερότητα της CURC (σε συγκέντρωση 0.01 and 0.05 mg/mL), όταν τα παρασκευάσματα επωάστηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα και ορρό (80% ο/ο FCS) στους 37 oC. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η HPβCD σταθεροποιεί την CURC περισσότερο από ότι η HPCD, αλλά η ενσωμάτωση σε λιποσώματα προσφέρει σημαντικά μεγαλύτερη σταθεροποίηση από ότι οι CDs (είτε όταν εγκλωβίζετε ως ελεύθερο μόριο ή ως CD-σύμπλοκο). Όμως η τελευταία μέθοδος πετυχαίνει αύξηση της φόρτωσης έως και κατά 23 φορές (ανάλογα με τη λιπιδική σύσταση και το σύμπλοκο που χρησιμοποιείται), με αποτέλεσμα να αυξάνει σημαντικά η διαλυτότητα της CURC. Η σταθερότητα της CURC παρουσία ορρού συνδέεται με την λιπιδική σύσταση των λιποσωμάτων και τη συγκέντρωση της CURC, αφού σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις μεγαλύτερο κλάσμα της CURCfractions προστατεύεται λόγο σύνδεσης στις πρωτεΐνες. Σε σύγκριση με τα σύμπλοκα εγκλεισμού, οι υβριδικές λιποσωμικές μορφές προσφέρουν ενδιάμεση διαλυτότητα στην CURC (συγκρίσιμη με αυτήν της HPβCD) αλλά σημαντικά αυξημένη σταθερότητα. Μετά την απόδειξη ότι οι μορφές της CURC είναι δραστικές κατά κυττάρων μελανώματος B16 (invitro), εντοπίστηκαν οι βέλτιστες συγκεντρώσεις συνδυασμών CURC και δοξορουβικίνης (DOX) που προσφέρουν βέλτιστη αντικαρκινική δράση [invitro]. Σε δεύτερο βήμα, παρασκευάστηκαν υβριδικές λιποσωμικές μορφές συνδυασμών CURC -DOX, ως τεχνική χορήγησης συνδυασμών που θα φθάσουν στα καρκινικά κύτταρα στις αρχικές συγκεντρώσεις (κάτι που δεν θα συμβεί εάν χορηγηθούν ως ξεχωριστά φάρμακα λόγο της διαφορετικής κινητικής τους). Επιπρόσθετα μελετήθηκε η επίδραση της ενσωμάτωσης ceramideς στην λιποσωμική μεμβράνη στην αντικαρκινική δράση των μορφών. Οι μορφές συνδυασμού CURC-DOX έδειξαν αυξημένη αντικαρκινική δράση σε σύγκριση με λιποσώματα που είχαν μόνο DOX (κάτι που δεν παρατηρήθηκε όταν χρησιμοποιήθηκαν ελεύθερα τα δύο μόρια). Όπως επιβεβαιώθηκε με FACSanalysis και με πειράματα κυτταρικής πρόσληψης, αυτή η αυξημένη δράση των μορφών συνδυασμού οφείλετε σε αύξηση της πρόσληψης DOX από τα κύτταρα, παρουσία CURC (πάλι δεν συνέβηκε όταν χρησιμοποιήθηκε ελεύθερη CURC). Εάν και παρατηρήθηκε αυξημένη δραστικότητα λιποσωμικής -DOX όταν τα λιποσώματα είχαν ceramides στη σύσταση τους, σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες, η προσθήκη, ceramideς δεν είχε θετικό αποτέλεσμα στη δραστικότητα των μορφών συνδυασμού CURC-DOX όταν μετρήθηκε με την τεχνική MTT. Εντούτοις, μηχανιστικές μελέτες έδειξαν ότι οι μορφές συνδυασμού CURC-DOX έδωσαν αυξημένο ποσοστό κυττάρων που είναι σε αρχικά στάδια απόπτωσης, σε σχέση με τα λιποσωματα DOX με ceramides που έδωσαν μεγαλύτερα ποσοστά κυττάρων σε τελικά στάδια απόπτωσης. Στις μορφές που συνδύαζαν τα πάντα, CURC-DOX και Ceramides τα ποσοστά κυττάρων σε πρώιμη και προχωρημένη απόπτωση ήταν αθροιστικά.

Μελέτες αλληλεπίδρασης μικρών μονοστοιβαδιακών αρσονολιποσωμάτων τα οποία αποτελούνται από μίγματα αρσονολιπιδίων και φωσφολιπιδίων, έδειξαν ότι αυτά είναι ιδιαίτερα τοξικά απέναντι σε καρκινικά κύτταρα. Έχει προταθεί ότι το γεγονός αυτό μπορεί να συνδέεται με την ιδιότητα των αρσονολιπιδίων As (V) να ανάγονται σε As(III) από μεμβρανικές ή κυτταροπλασματικές θειόλες. Το γεγονός ότι τα HL-60 κύτταρα τα οποία είναι πολύ ευαίσθητα στα αρσονολιποσώματα βρέθηκαν να περιέχουν υψηλά επίπεδα γλουταθειόνης, έρχεται σε πλήρη συμφωνία με τη θεωρία αυτή. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε in vitrο, η επίδραση μιας θειόλης, της γλουταθειόνης, η οποία αποτελεί την κύρια θειόλη των κυττάρων, στη σταθερότητα των αρσονολιποσωμάτων, με σκοπό να διαλευκανθεί η αλληλεπίδραση μεταξύ θειολών και αρσονολιποσωμάτων. Αν η γλουταθειόνη αλληλεπιδρά με το As (V) των αρσονολιπιδίων, τότε είναι πιθανόν να μεταβάλλεται η μεμβρανική τους σταθερότητα. Επιπλέον, η κυτταροτοξικότητα αυτών των αρσονολιποσωμάτων απέναντι σε σε μια καρκινική σειρά (PC3) μελετήθηκε με σκοπό να εξακριβωθεί εάν ένα in vitro τεστ με γλουταθειόνη μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την πρόβλεψη της τοξικότητας αρσονολιποσωμάτων απέναντι σε καρκινικά κύτταρα. Τα αποτελέσματα της μελέτης αυτής δείχνουν ότι η επίδραση της γλουταθειόνης στη σταθερότητα των αρσονολιποσωμάτων είναι μεγαλύτερη όταν το περιεχόμενο των λιποσωμάτων σε αρσονολιπίδιο αυξάνει, σαν συνέπεια αλληλεπίδρασης του αρσονολιπιδίου με τη γλουταθειόνη. Μάλιστα σε κάποιες περιπτώσεις που εξαρτώνται από τη σκληρότητα της λιπιδικής μεμβράνης, η αλληλεπίδραση αυτή οδηγεί σε αποσταθεροποίηση του αρσονολιποσώματος. Η αρνητική επίδραση της γλουταθειόνης στη σταθερότητα των λιποσωμάτων είναι μεγαλύτερη στα PC-αρσονολιποσώματα απ’ ότι στα DSPC. Πιθανόν η αυξημένη σταθερότητα των DSPC-αρσονολιποσωμάτων παρουσία γλουταθειόνης σε σχέση με τα PC να σχετίζεται με το γεγονός ότι τα πρώτα είναι πιο σταθερά ακόμα και στην περίπτωση που αυτά επωάζονται σε διάλυμα ορού. Για τα σταθεροποιημένα με PEG αρσονολιποσώματα η επίδραση της γλουταθειόνης στη σταθερότητα της μεμβράνης είναι πολύ μικρότερη σε σχέση με τα μη σταθεροποιημένα γεγονός που μπορεί να σχετίζεται είτε με την υψηλή σταθερότητα που έχουν εμφανίσει σε προηγούμενες μελέτες, είτε με την ιδιότητα της πολυαιθυλενογλυκόλης να περεμποδίζει στερεοχημικά την προσέγγιση και άρα την αλληλεπίδραση των αρσονολιποσωμάτων με τη γλουταθειόνη. Με σκοπό να εξακριβώσουμε αν τα PEG-αρσονολιποσώματα παρουσιάζουν κυταροτοξικότητα, μετρήσαμε τη % βιοσημότητα των καρκινικών κυττάρων ύστερα από επώαση αυτών παρουσία και απουσία (control) αρσονολιποσωμάτων. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα PC-αρσονολιποσώματα εμφανίζουν αυξημένη κυτταροτοξικότητα σε σχέση με τα DSPC, γεγονός που συμφωνεί απόλυτα με τη μειωμένη σταθερότητά τους παρουσία γλουταθειόνης. Παρόλαυτά τα PEG- αρσονολιποσώματα τα οποία είναι σταθερά παρουσία γλουταθειόνης, εμφανίζουν παρόμοια κυτταροτοξικότητα με τα μη σταθεροποιημένα PC-αρσονολιποσώματα. (Πειράματα που έγιναν με συμβατικά PEG-λιποσώματα δείχνουν ότι η παρουσία πολυαιθυλενογλυκόλης δεν προκαλεί κυτταροτοξικότητα). Συμπερασματικά τα αποτελέσματα αυτής της εργασίας δείχνουν ότι όντος πραγματοποιείται αλληλεπίδραση μεταξύ του As της πολικής κεφαλής του αρσονολιπιδίου και της θειολομάδας της γλουταθειόνης. Για τα μη σταθεροποιημένα αρσονολιποσώμτα τα αποτελέσματα από τη μελέτη της γλουταθειόνης συμφωνούν με την κυτταροτοξικότητα που εμφανίζουν στα PC3 κύτταρα, γεγονός που δεν ισχύει για τα σταθεροποιημένα. Αυτό μπορεί να οφείλετα σε διαφορετικό μηχανισμό υπεύθυνο για την κυταροτοηικότητα των PEG-αρσονολιποσωμάτων. / In cell culture studies, sonicated liposomes composed of phospholipid-arsonolipid mixtures (arsonoliposomes) demonstrate a specific toxicity against cancer cells. It has been previously proposed that this may be linked with the ability of arsonolipid As(V) to be reduced to As(III) by membrane-bound or cytoplasmic thiols. The fact that HL-60 cells which are very sensitive towards arsonoliposomes were found to have high basal glutathione concentrations, is in correlation with this theory. Here we studied in vitro, the effect of a thiol-containing compound, glutathione, on the integrity of arsonoliposomes, in order to gain some information about the interaction between thiols and arsonoliposomes. If GSH interacts with the As(V) of arsonoliposomes, this may alter their membrane stability. Furthermore, the cytotoxicity of these arsonoliposome types towards a cancer cell line (PC3) was measured in order to see if the results from the in vitro test with GSH can predict arsonoliposome toxicity towards cancer cells. The results of this study show that the effect of glutathione on arsonoliposome integrity is higher when their arsonolipid content increases, indicating that arsonolipid molecules interact with glutathione. In some cases, depending on the rigidity of their membranes, this interaction leads to a destabilization of arsonoliposomes. The destabilizing effect of GSH was higher for PC-based arsonoliposomes compared to DSPC-based ones. ). Perhaps the enhanced stability of the DSPC arsonoliposomes in presence of glutathione compared to the PC-based-ones is related with the fact that they are also significantly more stable during incubation in serum, as previously proven. For pegylated-arsonoliposomes membrane destabilization was minimal and this may be related to the high stability demonstrated previously for these specific arsonoliposomes, or, it may indicate that pegylation results in prevention (total or partial) of arsonolipid interaction with thiols (perhaps because of steric repulsion). In order to see if PEG-arsonoliposomes are cytotoxic towards cancer cells, we measured by MTT assay, the proliferation of PC3 cells after incubation in presence and absence (control) of different types and amounts of arsonoliposomes. Results show that DSPC-based arsonoliposomes are slightly, but significantly less cytotoxic compared to the equivalent PC-based ones, in agreement with the higher effect of GSH on PC-based arsonoliposomes. However although the pegylated arsonoliposomes studied were basically not affected by GSH, their PC3 cytotoxicity is equal with that measured for the PC-based arsonoliposomes, (PEG-related cytotoxicity was excluded by control experiments). To conclude the results of this study show that interaction between thiol groups and As-containing headgroups of arsonoliposomes take place. For the non-pegylated-arsonoliposomes the results of the GSH- study agree with the relative cytotoxicity of the corresponding arsonoliposomes towards PC3 cells. However, this is not the case for pegylated arsonoliposomes. Perhaps this implies that another mechanism is responsible for the pegylated liposome cytotoxicity.

The tumor microenvironment is a tangled web of multiple cell types, extracellular matrix components, and a multitude of cell signaling pathways frequently contribute to poor outcomes, which make cancer the second leading killer in the United States. A better understanding of how these constituents interact will inevitably facilitate development of novel cancer therapeutics and diagnostics. To advance scientific discovery towards this goal, innovative experimental techniques are required. In this dissertation, new research methods for probing cell communication at a single to multi cell level within 3D models of the tumor microenvironment are presented. Optical trapping, composite nanocapsules (i.e., gold-coated liposomes), and 3D cell culture models were the foundation for the development of these research tools. The first aim of this dissertation was to optimize our ability to optically manipulate gold-coated liposomes for the purpose of delivering molecular content to cells. The second aim was to apply optical manipulation of gold-coated liposomes to quantitatively deliver signaling molecules into a single cell to activate communication. The third aim was to develop a 3D model of the tumor microenvironment and demonstrate cell communication within this physiologically accurate architecture. The basis for this work was gold-coated liposomes' strong plasmon resonance with visible to near infrared (NIR) wavelengths of light, which enabled photo-thermal conversion and optical trapping. To identify preferred conditions for optical manipulation of gold-coated liposomes for delivering content into cells, gold-coated liposomes made with different dielectric properties were optically trapped under various laser modulation schemes and thoroughly characterized, enabled by high speed (kHz) imaging. Application of this technique was realized by precise delivery of molecular agents into a single cell (i.e., optical injection). As a demonstration of optical injection, the NIR trapping beam was utilized to propel gold-coated liposomes encapsulating inositol trisphosphate (IP3) into a single cell to initiate calcium (Ca²⁺) signaling. In another method for intracellular delivery, cells were preloaded with similar gold-coated liposomes, internalized by macropinocytosis, and then exposed to on-resonant laser light to trigger on-demand release of IP3 to activate Ca²⁺ signaling. Lastly, a 3D cell culture model of ovarian cancer microenvironment was developed as a platform for interrogating cell signaling. The in vitro model comprised human ovarian cancerous epithelial cells grown upon a collagen and human fibroblast stroma recapitulating architecture of human tissue. Gold-coated liposomes encapsulating signaling molecules, optical manipulation, and a 3D model of ovarian cancer, a trio of versatile experimental tools opens new opportunities for studying the tumor microenvironment.

No description available.

L’auto-assemblatge de molècules en nano- i micro-estructures és una àrea de gran interès, sent els lípids particularment atractius en la formació de diverses estructures incloent els liposomes. Hi ha un gran número de mètodes reportats en la literatura per a la preparació de liposomes, però els inconvenients que limiten l’ús generalitzat dels liposomes són; els passos de preparació que requereixen de molt de temps donant lloc a poblacions heterogènies de liposomes de mida incontrolable, l’ús de solvents orgànics i la necessitat de passos per a reduir la mida dels liposomes. Per tant; l’objectiu d’aquest doctorat és la optimització d’un mètode ultra-ràpid per a la preparació de liposomes en un sol pas i lliure de dissolvents orgànics. Anomenat “Curvature tuned preparation method” ha estat implementat en diverses formulacions lipídiques per a la formació de liposomes i d’altres superestructures de lípids. Aquestes estructures s’han emprat en diverses aplicacions, com ara en nanoreactors i plantilles per a la síntesis a mida de nanopartícules d’or, liposomes per encapsular enzims com a potenciadors de senyal en el desenvolupament de immunosensors i finalment, com a vehicles per l’alliberament controlat de fàrmacs. / The self-assembly of molecules into nano- or microstructures is an area of intense interest, with lipids being particularly attractive in the formation several structures including liposomes. There are numerous methods reported for the preparation of liposomes, however, time-consuming preparative steps resulting in heterogeneous liposome populations of incontrollable size, the use of organic solvents and the need of further size-reducing steps are the drawbacks limiting wide-spread use of liposomes. Therefore; the main concern of this PhD thesis is optimization of a one-step, organic solvent-free, ultra rapid method for the preparation of liposomes. So called “Curvature tuned preparation method” was later implemented in several lipid formulations which resulted in liposomes and other lipid superstructures. Those structures were further used in several applications, such as nanoreactors and templates for tailored synthesis of gold nanoparticles, enzyme encapsulating liposomes as signal enhancers in immunosensor development, and finally as carriers for controlled release of drugs

Melanoma is the most deadly form of skin cancers, with an incidence increasing more rapidly than any other malignant cancer in the past 40 years. Metastatic melanoma is resistant to conventional treatments, such as chemotherapy and radiation therapy. Our lab has previously demonstrated that Mcl-1 is a key contributor in protecting melanoma from therapy-induced cell death. RNAi therapeutics was employed as a novel way to silence the anti-apoptotic protein by using Mcl-1 mRNA sequence-specific siRNAs in vitro. In our hands, passive non-targeted delivery of RNAi therapy into melanoma tumours has been shown to be neither effective, nor selective in vitro and in vivo. Consequently, in this study, siRNA was linked to a delivery system which expressed a ligand specifically targeting melanoma cells. Previously shown, melanoma overexpresses the cell surface ganglioside GD3, thus it is my belief that the anti-GD3 R24 monoclonal antibody can function as a targeting molecule. The antibody was linked to coated cationic liposomes (CCLs) carrying siRNA molecules. Our first step was to confirm R24 ligation to CCLs. Untargeted CCLs showed insignificant values of antibody, whereas antibody-conjugated CCLs presented approximately 30 antibodies per liposome. I also confirmed that siRNA was internalized within CCLs using spectrometry, with an encapsulation efficiency of approximately 80%. Since liposomes need to be small to be effective in vitro and in vivo, CCLs were confirmed to be less than 100nm in diameter. In vitro studies using fluorescent microscopy demonstrated greater binding to melanoma cells with antibody-conjugated CCLs as compared to untargeted CCLs. In vivo experiments showed specific localization of targeted CCLs to induced subcutaneous mouse xenograft tumours. Western blotting demonstrated greater Mcl-1 knockdown using GD3-targeted CCLs. Taken together, these results suggest that anti-GD3 antibodies can serve as targeting molecules to deliver siRNA to melanoma cells and furthermore, GD3-targeted CCLs can promote siRNA-mediated gene silencing. / Thesis (Master, Pathology & Molecular Medicine) -- Queen's University, 2010-09-02 10:29:37.944

Hepatocyte-directed liposomal gene delivery systems have received much attention in view of the present lack of suitable treatment alternatives for several liver-associated disorders. While targeting of liposomes to the asialoglycoprotein receptor (ASGP-R), nearly-exclusive to hepatocytes, is a well-documented means of achieving cell-specificity, several intra- and extracellular barriers reduce the efficacy of liposomal gene transfer. These include the aggregation and opsonisation of lipoplexes by serum components; and endo/lysosomal degradation of internalised DNA. This study has attempted to address the individual concerns by modifying hepatotropic liposomes with a steric stabilising, polyethylene glycol (PEG) shroud, and an endosomal escape-inducing proton sponge moiety. Novel galactosylated (SH02) and imidazolylated (SH04) cholesterol derivatives were successfully synthesised with the aim of conferring the respective functions of ASGP-R-specificity and proton sponge capability upon cationic liposome formulations. The individual derivatives afforded stable, unilamellar vesicles (< 200 nm, Z-average diameter) when incorporated at 10 % on a molar basis with the cytofectin, 3β[N-(N',N'-dimethylaminopropane)-carbamoyl] cholesterol (Chol-T) and co-lipid, dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE). Modification of these formulations with 1,2-distearoyl-sn-glycero-phosphoethanolamine-N-[carboxy(polyethylene glycol)2000] (DSPEPEG₂₀₀₀), at 5 mol %, gave smaller vesicles (< 110 nm, Z-average diameter) and moderately reduced the instability associated with the combination of both SH02 and SH04 in a single formulation. Individual preparations formed electrostatic complexes with pCMV-luc plasmid DNA, as demonstrated by gel retardation assays and electron microscopy. Furthermore, the liposomes afforded some protection to the DNA cargo against serum nuclease attack during a 4 hour-long exposure to foetal calf serum at 37 °C. However, the DNA-binding and protecting capabilities of the liposomes were reduced upon addition of the PEG coating. Growth inhibition assays showed that lipoplexes derived from individual formulations were well tolerated by human hepatocyte-derived, HepG2, and embryonic kidney, HEK293, cell lines. Expression of the luciferase transgene mediated by non-pegylated formulations containing SH02 was significantly higher in hepatocytes than in the ASGP-R-negative, kidney cells. Furthermore, receptor-mediated internalisation of non-pegylated, galactosylated carriers by hepatocytes was demonstrated by the gross inhibition of transfection in the presence of excess asialofetuin, a natural ligand to the ASGP-R. Liposome acid titration profiles highlighted the endosomal pH-buffering capacity afforded by SH04. However, the imidazolylated lipid enhanced the transfection activity of the non-sterically stabilised Chol-T/DOPE system, but not that of its targeted counterpart, and only with respect to HEK293 cells. Finally, pegylation reduced the transfection capability of liposomes by at least three orders of magnitude in both cell lines. The results suggest that further optimisation of liposome composition is necessary in order to achieve a liposomal system that simultaneously embodies hepatocyte-targeting, proton sponge and long-circulating properties. / Thesis (M.Sc.)-University of KwaZulu-Natal, Westville, 2012.