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Der systemische Lupus erythematodes (SLE) ist eine chronische Autoimmunerkrankung aus dem rheumatischen Formenkreis, deren Begleitsymptome ein potentielles Risiko für reduzierte körperliche Aktivität (KA) darstellen. Allerdings existieren gegenwärtig nur wenige Daten über die Prävalenz der alltäglichen KA bei SLE, Faktoren, die KA verringern, und die gegenseitige Beeinflussung von Krankheitssymptomen und KA. Außerdem wurde eine Assoziation zwischen KA und einem niedrigeren Inflammationsniveau in der SLE-Population geprüft. Insgesamt wurden Daten von 99 Patienten erfasst. Krankheitsaktivität, krankheitsbedingten Organschäden, Medikamentenanamnese und Labordaten wurden anhand der Patientenakte erhoben. Schmerzsymptome, Lebensqualität, Fatigue und psychologisches Allgemeinbefinden wurden durch standardisierten Fragebogen erfasst. Die KA wurde in Hinsicht auf berichtete alltägliche Betätigung (IPAQ-Fragebogen) sowie objektive körperliche Leistung (2- und 6-Minuten-Gehtest) gemessen. Aus 73 Serumproben wurde der Interleukinstatus bestimmt. Bei einem relativ hohen subjektiven Niveau der KA konnte eine relativ niedrige objektive körperliche Leistung beobachtet werden. Ein niedrigeres subjektives Niveau der KA war mit neuropsychiatrischer Beteiligung sowie psychologischen Auffälligkeiten, Fatigue und reduzierter Lebensqualität assoziiert. Pulmonale Beteiligung, Diabetes mellitus und ein höherer Body-Mass-Index standen in Zusammenhang mit einer schlechteren Gehleistung. Als weiteres Ergebnis stellte sich eine Assoziation zwischen einem größeren Unterschreiten von normativen Referenzwerten in dem 2- und 6-Minuten Gehtest und höherer IL-6 Konzentration ein. Gleichzeitig war ein höherer IL-6 Spiegel mit größerem Bauchumfang und Adipositas assoziiert.:Inhaltsverzeichnis 1 Abbildungsverzeichnis 3 Tabellenverzeichnis 4 Abkürzungsverzeichnis 7 Bibliographische Beschreibung 9 1. Einführung 11 1.1 Systemischer Lupus erythematodes 11 1.1.1 Definition der Erkrankung 11 1.1.2 Epidemiologie 11 1.1.3 Ätiologie und Pathogenese 12 1.1.4 Klinisches Bild und Diagnostik 15 1.1.5 Therapie des SLE 22 1.2 Körperliche Aktivität 23 1.2.1 Gesundheitliche Vorteile von körperlicher Aktivität für die Allgemeinbevölkerung 23 1.2.2 Körperliche Aktivität bei rheumatischen Erkrankungen und SLE 26 1.3 Messung der körperlichen Aktivität 28 1.3.1 Subjektive Erfassung der alltäglichen körperlichen Aktivität 28 1.3.2 Objektive Messung der körperlichen Leistung 29 1.4 Zielsetzung und Fragestellung 30 2. Methoden 32 2.1 Patienten 32 2.2 Fragebogensammlung und standardisierte Scores 33 2.3 Messung der körperlichen Leistung 41 2.3.1 Ausschlusskriterien für den Zwei- und Sechs-Minuten-Gehtest 41 2.3.2 Durchführung des Zwei- und Sechs-Minuten-Gehtestes 42 2.4 Bestimmung der IL-6 Plasmakonzentration 44 2.4.1 Blutentnahmen 44 2.4.2 Labormessung 44 2.5 Statistische Auswertung 45 3 Ergebnisse 46 3.1 Klinische Charakterisierung der Patienten 46 3.2 Subjektiv erfasste körperliche Aktivität 55 3.2.1 Subjektive Bewertung der Hürden für körperliche Aktivität 56 3.2.2 Klinische Parameter und subjektiv erfasste, alltägliche körperliche Aktivität 59 3.3 Ergebnisse der Messung körperlicher Leistung 69 3.3.1 Ergebnisse des Zwei-Minuten-Gehtests 69 3.3.1.2 Einfluss allgemeiner Faktoren auf den Zwei-Minuten-Gehtest 70 3.3.1.3 Vergleich mit Referenzgrößen für gesunde Erwachsene 71 3.3.1.4 Leistungsschwache versus leistungsstärkere Patienten 72 3.3.2 Ergebnisse des Sechs-Minuten-Gehtests 79 3.3.2.1 Einfluss der allgemeinen Faktoren auf den Sechs-Minuten-Gehtest 81 3.3.2.2 Vergleich mit Referenzgrößen für gesunde Erwachsene 81 3.3.2.4 Leistungsschwache versus leistungsstärkere Patienten 83 3.4 Vergleich der Methoden für die Erfassung der körperlichen Aktivität 90 3.4.1 Vergleich der selbstberichteten körperlichen Aktivität: IPAQ- vs. GPAQ-Fragebogen 90 3.4.2 Vergleich der Messergebnisse körperlicher Leistung: Zwei-Minuten- vs. Sechs-Minuten-Gehtest 93 3.4.3 Messung der körperlichen Aktivität: Fragebogen für alltägliche Aktivität vs. körperlichen Leistung 97 3.5 Risikofaktoren für reduzierte körperliche Aktivität 99 3.5.1 Risikofaktoren für eine niedrige subjektiv erfasste alltägliche körperliche Aktivität 99 3.5.2 Risikofaktoren für eine verminderte körperliche Leistung 104 3.6 Inflammationsparameter im Zusammenhang mit den in der aktuellen Arbeit erfassten Faktoren 106 3.6.1 Zusammenhänge zwischen IL-6 und klinischen Variablen 109 3.6.2 Risikofaktoren für einen erhöhten IL-6-Serumspiegel 114 4. Diskussion 117 4.1 Klinische Charakterisierung der Patienten 117 4.2 Subjektiv erfasste alltägliche körperliche Aktivität 118 4.3 Ergebnisse der Messung der körperlichen Leistung 120 4.4 Vergleich der Methoden für die Erfassung der körperlichen Aktivität 123 4.5 Risikofaktoren für eine niedrige körperliche Aktivität 126 4.6 Inflammationsparameter im Zusammenhang mit in dieser Arbeit erfassten Faktoren 128 5. Zusammenfassung der Arbeit 131 Literaturverzeichnis 135 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 145 Danksagung 146 Lebenslauf 147

Der systemische Lupus erythematodes (SLE) ist der Prototyp einer systemischen Autoimmunkrankheit, bei dem neben leichteren Verläufen mit spontan remittierendem Hautausschlag und Gelenkschmerzen häufig eine Nierenbeteiligung in Form der Glomerulonephritis vorkommt. Eine weitere Autoimmunerkrankung ist das Sjögren-Syndrom, bei der exokrine Drüsen befallen werden und v. a. zu anhaltender Mund- und Augen-trockenheit führen. Beide Erkrankungen gehören zu den Kollagenosen (Bindegewebs-erkrankung), bei denen organunspezifische Autoantikörper gegen Zellkernmaterial (anti-nukleäre Antikörper) zur Diagnosefindung beitragen. Eines der Antigene nennt sich La/SS-B (Sjögren-Syndrom-B), es wird bei 70 % der Sjögren-Syndrom- und 25 % der SLE-Patienten registriert. Im Rahmen von Zelluntergang wie bei Infektionen oder UV-Licht-Exposition, wenn La/SS-B extrazellulär für das Immunsystem zugänglich wird, kommt es zu Krankheitsschüben von SLE. La/SS-B ist bei fast allen Eukaryonten ein essentielles Kernprotein, das Nukleinsäuren, v. a. RNA, und in gewissem Grad auch DNA binden kann. Beim Menschen hat es eine wichtige Funktion in der Bindung von RNA-Polymerase III-Transkripten. Das Protein besteht funktionell aus einem N- und einem C-Terminus. Der N-Terminus beinhaltet das La-Motiv und das RRM1 (RNA recognition motif 1, RNA-Erkennungmotiv). Es kann davon ausgegangen werden, dass im Rahmen der Erkrankungen in einer oder mehrerer Phasen dendritische Zellen des Immunsystems mit dem Protein in Kontakt treten, da diese zentralen Zellen des Immunsystems für die Bildung von Antikörpern essenziell sind. 6 sulfo LacNAc+ dendritische Zellen (slanDC) sind die proinflammatorische Hauptpopulation myeloider dendritischer Zellen (mDC) und produzieren bei Stimulation große Mengen Tumornekrosefaktor α (TNF α). Sie besitzen wie alle mDCs keinen TLR9 (toll-like receptor, Toll-ähnlicher Rezeptor), der durch CpG-reiche, bakterielle DNA aktiviert würde, dafür aber solche TLRs, die zu einer Aktivierung der slanDCs u. a. durch bakterielle RNA oder Lipopolysaccharide (LPS) führen. Eine entscheidende Frage ist, warum es zur Bildung von Autoantikörpern gegen das Kern- und RNA-Bindeprotein La kommt und ob La-Autoantikörper eine Begleiterscheinung sind oder ob es tatsächlich immunstimulierende Formen von La gibt. Da La ein Nukleinsäure-bindendes Protein ist, ist eine Assoziation mit bakteriellen Nukleinsäuren nach prokaryontischer Herstellung wie in dieser Arbeit wahrscheinlich. Da der N-Terminus des La-Proteins die RNA-Bindedomäne enthält, wurde dieser näher untersucht. Die Stimulierbarkeit von DCs durch La ist noch unzureichend erforscht. In dieser Arbeit wurde repräsentativ die Stimulierbarkeit von slanDCs durch La/SS-B nach Aufreinigung durch zwei variierende Verfahren untersucht. Zu prüfen war, ob und in welchem Umfang die gebundenen Nukleinsäuren Einfluss auf die Aktivierungsfähigkeit haben. La-Protein wurde prokaryontisch rekombinant in E. coli-Bakterien hergestellt und mit Nickel-Affinitätschromatographie aufgereinigt. Durch Einbau eines Stopcodons konnte zusätzlich der N-terminale Teil von La (LaN) separat hergestellt werden. Bei einer erneuten Aufreinigung wurde das Aufreinigungsverfahren um einen DNase-/RNase-Verdau erweitert. Um gebundene Nukleinsäuren nachzuweisen und zu messen wurden UV-Spektren der aufgereinigten Proteine bei 220–300 nm angefertigt. Zudem erfolgten Fluoreszenzfärbungen mit RiboGreen®, welches auf Nukleinsäuren reagiert. Für verschiedene Referenzversuche und Vergleiche wurden E. coli- und eukaryontische RNA mit TriPure Isolation Reagent und Chloroform isoliert. Die slanDCs wurden über magnetischer Zellseparierung aus PBMCs isoliert, die zuvor aus buffy coats mittels Ficoll-Dichtezentrifugation gewonnen wurden. Sie wurden bei Raumtemperatur 24 Stunden kultiviert, die Probenzugabe erfolgte 4 Stunden nach Kulturbeginn. Im Überstand wurde die TNF α-Konzentration mittels ELISA bestimmt. Nach erfolgter Aufreinigung bestätigten Westernblots die Identität der Proteine La und LaN. Die UV-Spektren ergaben Protein-Nukleinsäure-Mischspektren, der Nukleasen-verdau verringerte jedoch den gebundenen Nukleinsäure-Anteil. RiboGreen®-Probefärbungen verschiedener Nukleinsäuren sowie Verdauungsversuche mit Nuklease zeigten eine Inhomogenität der Fluoreszenzintensitäten abhängig von der Art und Länge der Nukleinsäure. Dadurch war eine korrekte Quantifizierung des La-gebundenen bakteriellen Nukleinsäure-Gemischs nicht möglich. Trotzdem konnte beim getrennten Verdau mit DNase und RNase die Nukleinsäure an La-Protein als größtenteils RNA, an LaN als fast ausschließlich RNA identifiziert werden. In den slanDC-Aktivierungsversuchen erwiesen sich sowohl 5 pmol La-Volllänge als auch 5 pmol von dessen seperatem N-Terminus als potente Stimulatoren. Die Nuklease-verdauten Varianten von La und LaN waren signifikant weniger immunstimulierend. Selbst 50 pmol Nuklease-behandeltes La führten zu weniger TNF α-Produktion als 5 pmol unbehandeltes La. In einem Kontrollversuch war aufgereinigter E. coli-RNA ebenfalls stimulierend, eukaryontische RNA hingegen nicht. CpG-DNA führte ebenfalls zu keiner Aktivierung von slanDCs. Reassoziationsversuche von Nuklease-behandeltem N-terminalen La-Protein mit eukaryontischer RNA konnten keine immunstimulierende Wirkung hervorrufen. Es kann aus den Versuchen mit slanDCs geschlossen werden, dass an La gebundene bakterielle Nukleinsäuren für die Aktivierung der Immunzellen hauptverantwortlich waren. Mit großer Wahrscheinlichkeit beruht die Aktivierung auf RNA. Einerseits wurde v. a. RNA in den Proteinaufreinigungen nachgewiesen, andererseits tragen mDCs keinen TLR9 zur DNA-Erkennung. Diese Arbeit wirft die Frage auf, ob dem Protein La/SS B eine Funktion als Alarmin innewohnt, ähnlich dem Protein LL 37, das selbst das Immunsystem nicht stimuliert, aber körpereigene DNA komplexieren und dadurch in eine autostimulierende Form verwandeln kann. Möglicherweise wird durch Zellschaden freigewordenes La durch gleichzeitig vorhandene körperfremde Nukleinsäuren in Immunzellen geschleust, um auf diesem Weg die Immuntoleranz zu durchbrechen. Nachdem in dieser Arbeit offenbar die Nukleinsäuren für die Aktivierung von slanDCs verantwortlich waren, könnte in weiterführenden Versuchen an isolierten T Helferzellen oder an murinen T-Zellen in vivo untersucht werden, ob sie durch Stimulation mit La-aktivierten DCs tatsächlich auf La-Protein geprimt (priming, Prägung) werden. Zudem wird die Vermutung aufgeworfen, ob extrazelluläres La während einer bakteriellen Infektion deren Nukleinsäuren stabilisiert und vor Nukleasen schützt. Dadurch vermehrt auftretende extrazelluläre bakterielle Nukleinsäure könnte einen SLE-Schub auslösen, was für SLE charakteristisch wäre.:Inhaltsverzeichnis 3 Abbildungsverzeichnis 6 Tabellenverzeichnis 8 Abkürzungsverzeichnis 9 1. Einleitung 13 1.1 Das menschliche Immunsystem 13 1.1.1 Die zentrale Rolle dendritischer Zellen bei der Einleitung der Immunantwort 14 1.1.2 Die besondere Rolle dendritischer Zellen bei der spezifischen Immunantwort 15 1.1.3 SlanDCs, eine neue Gruppe dendritischer Zellen 17 1.1.4 Überempfindlichkeitsreaktionen des Immunsystems 18 1.2 Systemischer Lupus Erythematodes (SLE) 18 1.2.1 Allgemeines und Epidemiologie 18 1.2.2 Aspekte zur Pathogenese 20 1.3 Das Autoantigen La/SS B 23 1.4 Die Rolle von Nukleinsäuren bei autoimmunen Prozessen 26 1.5 Zielstellung 28 2. Materialien 30 2.1 Chemikalien und Reagenzien 30 2.2 Puffer und Lösungen 31 2.3 Medien 33 2.4 Bakterienstamm 33 2.5 Zelllinien 34 2.6 DNAs und RNAs 34 2.7 Enzyme 34 2.8 Antikörper 35 2.9 Molekulargewichtsmarker 35 2.10 Kitsystem 36 2.11 Verbrauchsmaterialien 36 2.12 Geräte und Software 36 3. Methoden 39 3.1 Molekularbiologische Methoden 39 3.1.1 Arbeiten mit Bakterien 39 3.1.1.1 Kultivierung von Bakterien für die prokaryotische Proteinproduktion 39 3.1.1.2 Bestimmung der OD600 40 3.1.2 Herstellung von RNA-Totalextrakten 40 3.1.2.1 RNA aus E. coli 40 3.1.2.2 RNA aus eukaryontischen Zellen 41 3.1.3 Photometrische Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren 41 3.1.4 Bestimmung des Nukleinsäure-Gehalts mit RiboGreen® RNA Quantification Kit 41 3.2 Zellbiologische Methoden 43 3.2.1 Kultivierung von Raji- und U937-Zellen 43 3.2.2 Isolierung von peripheren mononukleären Zellen (PBMCs) aus buffy coats 43 3.2.3 Bestimmung der Zellzahl 44 3.2.4 Isolierung von slanDCs aus PBMCs 44 3.2.5 Durchflusszytometrie 44 3.2.5.1 Messung der Reinheit der slanDCs 45 3.2.5.2 Untersuchung von Oberflächenmarkern auf slanDCs 46 3.3 Proteinbiochemische Methoden 46 3.3.1 Aufreinigung der prokaryontisch produzierten Proteine 46 3.3.2 Dialyse 48 3.3.3 Photometrische Konzentrationsbestimmung von Proteinen 48 3.3.4 Spektralanalyse von Protein-Lösungen und von DNA 48 3.3.5 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese 48 3.3.6 Coomassiefärbung von SDS-Gelen 50 3.3.7 Konzentrationsbestimmung mit Proteinstandard im SDS-Gel 50 3.3.8 Western Blotting und Immundetektion 50 3.3.9 Aktivierungsversuche von slanDCs durch Zugabe von La 51 3.3.10 Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) 51 4. Ergebnisse 53 4.1 Herstellung des Proteins La und dessen N-terminaler Domäne 53 4.2 Charakterisierung der Proteine und Quantifizierung des Nukleinsäure-Gehalts 56 4.2.1 Westernblots und Färbung mit verschiedenen Antikörpern 56 4.2.2 Quantifizierung des Nukleinsäure-Gehalts in La und LaN mittels UV-Spektrum 57 4.2.3 Quantifizierung und Differenzierung der an La gebundenen Nukleinsäuren mit RiboGreen® 63 4.3 Aktivierungsversuche mit slanDCs, der Hauptpopulation von mDCs 67 4.3.1 La und slanDCs 68 4.3.2 Immunstimulierende Kapazität von bakteriell exprimiertem La nach RNase- und DNase-Behandlung 72 4.3.3 Das Teilprotein LaN (N-terminale Domäne von La) 76 4.3.4 Die Reaktion von slanDCs auf eukaryontische und prokaryontische RNA sowie CpG-DNA 79 5. Diskussion 83 5.1 Erläuterungen zur Herstellung der Proteine La und dessen N-terminaler Domäne 83 5.2 Ist an bakteriell gewonnenem La-Protein Nukleinsäure gebunden? 84 5.3 SlanDCs werden durch La-Protein aktiviert, wenn bakterielle Nukleinsäure gebunden ist 87 6. Zusammenfassung 91 Summary 94 Literaturverzeichnis 97 Danksagung 107 Anlagen 109 / Systemic lupus erythematosus (SLE) is the prototype of a systemic autoimmune disease. Apart from a spontaneously remitting rash and joint pain a glomerulonephritis often damages the kidney. Sjögren’s syndrome is another autoimmune disease. It affects the exocrine glands whose destruction leads to persistent mouth and eye dryness. Both diseases belong to the group of collagenoses (connective tissue diseases) where organ non specific autoantibodies against nuclear material (antinuclear antibodies) are used for diagnosis. One antigen called La/SS-B (Sjögren’s Syndrome-B) has been detected in seventy percent of the patients with Sjögren’s syndrome and in twenty-five percent of the patients with SLE. On cell death, for example due to infections or exposure of UV light, La/SS-B is exposed to the extracellular space becoming available to the immune system and leads to an exacerbation of SLE. La/SS-B is an essential nuclear protein in almost all eukaryotes. It binds nucleic acids, particularly RNA, but also DNA to a lesser extent. A major function in humans is the binding of RNA polymerase III transcripts. The protein can be divided into an amino- and a carboxyl-terminus, each serving a different function. The amino-terminus contains the La motif and the RRM1 (RNA recognition motif 1). In one or more phases during the disease La/SS-B will interact with dendritic cells (DC). These central cells of the immune systems are essential for the generation of an antibody response. 6 sulfo LacNAc+ dendrite cells (slanDC) are the major population of myeloid dendritic cells (mDC) and have a high proinflammatory potential. In case of stimulation they produce large amounts of tumor necrosis factor α (TNF α). Like all mDCs they have no TLR9 (toll-like receptor), which could activate the slanDCs via bacterial DNA, but they have TLRs that activate these cells by bacterial RNA and lipopolysaccharide (LPS). A crucial question is why autoantibodies against the nuclear RNA binding protein La are generated. These autoantibodies could be the consequence of an epiphenomenon or of active immunostimulation. Because La is a nucleic acid binding protein, an association with bacterial nucleic acids after purification from transformed prokaryotes seemed possible. The amino-terminus was analyzed closer since in contains the RNA binding domain. The stimulation of DCs is still insufficiently researched. In this dissertation the stimulation of slanDCs by La/SS-B after purification, using two different methods, was studied. The goal was to clarify whether the bound nucleic acids have an effect on the activation ability of La/SS-B. La protein was produced recombinantly in E. coli bacteria and purified with nickel affinity chromatography. It was possible to create and purify the separate amino-terminus of La (LaN) by insertion of a stop codon in the transformed prokaryotic DNA. In a second purification of La and LaN the procedure was supplemented by a treatment with DNase and RNase. An UV spectral analysis at 220–300 nm was performed to verify and measure bound nucleic acid of the purified proteins. Furthermore RiboGreen®, which reacts to nucleic acids, was used for fluorescence staining. E. coli and eukaryotic RNA were isolated with TriPure Isolation Reagent and Chloroform for several experiments and comparisons. The slanDCs were isolated by magnetic cell isolation from PBMCs which were obtained from buffy coats by Ficoll density centrifugation. The DCs were cultivated for 24 hours at room temperature and the samples were added 4 hours into the process. In the supernatant the TNF α concentration was measured by ELISA. After protein purification, western blots were used to verify the identity of La and LaN. The UV spectral analysis showed mixed spectra of proteins and nucleic acids, however the treatment with nucleases reduced the amount of nucleic acids bound to the proteins. RiboGreen® fluorescence staining of various nucleic acids and digestion experiments with nucleases reveal an inhomogeneous fluorescence depending on the type and length of the nucleic acid. This made it impossible to quantify the correct amount of the La-bound bacterial nucleic acid mixture. With the use of a separate treatment with either DNase or RNase the biggest part of the nucleic acid bound to La could be identified as RNA. For LaN this was almost exclusively RNA. 5 pmol La as well as its amino-terminus LaN proved to be potent stimulators in the activation experiment of slanDCs. The nuclease-treated protein variants of La and LaN were significantly less immunostimulatory. Even 50 pmol nuclease-treated La led to less TNF α production than 5 pmol untreated La. E. coli RNA was equally stimulatory to slanDCs in the control experiment. The same did not hold true for eukaryotic RNA. CpG DNA also did not lead to an activation of slanDCs well. The attempt to reassociate nuclease-treated LaN with eukaryotic RNA did not induce a conversion of LaN in an immunestimulatory activator for slanDCs. It was shown that La-bound bacterial nucleic acids are mainly responsible for the activation of slanDCs. The activation seems to be triggered by the RNA. On one hand RNA was found to be large part of the purified proteins, on the other hand mDCs do not have a TLR9 for the recognition of DNA. This dissertation raises the question whether La/SS B has a role as an alarmin similar to the small protein LL 37, that could not stimulate the immune system itself, but complex the body’s own DNA and convert it to an autostimulatory form. Extracellular La from cell death might be taken up by DCs which are stimulated by foreign nuclein acids at the same time, leading to an immune response against La, too. Due to the observation that nucleic acids were responsible for the activation of slanDCs, further experiments with isolated T helper cells or murine T cells in vivo should be performed. These experiments should address questions whether La specific T cells, which are subsequently responsible for the activation of B cells, are primed. The results of this dissertation led to the assumption that extracellular La could potentially stabilize and protect bacterial nucleic acids during infections from nucleases. This increase of extracellular bacterial nucleic acids could trigger an exacerbation of SLE, which is typically observed in SLE.:Inhaltsverzeichnis 3 Abbildungsverzeichnis 6 Tabellenverzeichnis 8 Abkürzungsverzeichnis 9 1. Einleitung 13 1.1 Das menschliche Immunsystem 13 1.1.1 Die zentrale Rolle dendritischer Zellen bei der Einleitung der Immunantwort 14 1.1.2 Die besondere Rolle dendritischer Zellen bei der spezifischen Immunantwort 15 1.1.3 SlanDCs, eine neue Gruppe dendritischer Zellen 17 1.1.4 Überempfindlichkeitsreaktionen des Immunsystems 18 1.2 Systemischer Lupus Erythematodes (SLE) 18 1.2.1 Allgemeines und Epidemiologie 18 1.2.2 Aspekte zur Pathogenese 20 1.3 Das Autoantigen La/SS B 23 1.4 Die Rolle von Nukleinsäuren bei autoimmunen Prozessen 26 1.5 Zielstellung 28 2. Materialien 30 2.1 Chemikalien und Reagenzien 30 2.2 Puffer und Lösungen 31 2.3 Medien 33 2.4 Bakterienstamm 33 2.5 Zelllinien 34 2.6 DNAs und RNAs 34 2.7 Enzyme 34 2.8 Antikörper 35 2.9 Molekulargewichtsmarker 35 2.10 Kitsystem 36 2.11 Verbrauchsmaterialien 36 2.12 Geräte und Software 36 3. Methoden 39 3.1 Molekularbiologische Methoden 39 3.1.1 Arbeiten mit Bakterien 39 3.1.1.1 Kultivierung von Bakterien für die prokaryotische Proteinproduktion 39 3.1.1.2 Bestimmung der OD600 40 3.1.2 Herstellung von RNA-Totalextrakten 40 3.1.2.1 RNA aus E. coli 40 3.1.2.2 RNA aus eukaryontischen Zellen 41 3.1.3 Photometrische Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren 41 3.1.4 Bestimmung des Nukleinsäure-Gehalts mit RiboGreen® RNA Quantification Kit 41 3.2 Zellbiologische Methoden 43 3.2.1 Kultivierung von Raji- und U937-Zellen 43 3.2.2 Isolierung von peripheren mononukleären Zellen (PBMCs) aus buffy coats 43 3.2.3 Bestimmung der Zellzahl 44 3.2.4 Isolierung von slanDCs aus PBMCs 44 3.2.5 Durchflusszytometrie 44 3.2.5.1 Messung der Reinheit der slanDCs 45 3.2.5.2 Untersuchung von Oberflächenmarkern auf slanDCs 46 3.3 Proteinbiochemische Methoden 46 3.3.1 Aufreinigung der prokaryontisch produzierten Proteine 46 3.3.2 Dialyse 48 3.3.3 Photometrische Konzentrationsbestimmung von Proteinen 48 3.3.4 Spektralanalyse von Protein-Lösungen und von DNA 48 3.3.5 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese 48 3.3.6 Coomassiefärbung von SDS-Gelen 50 3.3.7 Konzentrationsbestimmung mit Proteinstandard im SDS-Gel 50 3.3.8 Western Blotting und Immundetektion 50 3.3.9 Aktivierungsversuche von slanDCs durch Zugabe von La 51 3.3.10 Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) 51 4. Ergebnisse 53 4.1 Herstellung des Proteins La und dessen N-terminaler Domäne 53 4.2 Charakterisierung der Proteine und Quantifizierung des Nukleinsäure-Gehalts 56 4.2.1 Westernblots und Färbung mit verschiedenen Antikörpern 56 4.2.2 Quantifizierung des Nukleinsäure-Gehalts in La und LaN mittels UV-Spektrum 57 4.2.3 Quantifizierung und Differenzierung der an La gebundenen Nukleinsäuren mit RiboGreen® 63 4.3 Aktivierungsversuche mit slanDCs, der Hauptpopulation von mDCs 67 4.3.1 La und slanDCs 68 4.3.2 Immunstimulierende Kapazität von bakteriell exprimiertem La nach RNase- und DNase-Behandlung 72 4.3.3 Das Teilprotein LaN (N-terminale Domäne von La) 76 4.3.4 Die Reaktion von slanDCs auf eukaryontische und prokaryontische RNA sowie CpG-DNA 79 5. Diskussion 83 5.1 Erläuterungen zur Herstellung der Proteine La und dessen N-terminaler Domäne 83 5.2 Ist an bakteriell gewonnenem La-Protein Nukleinsäure gebunden? 84 5.3 SlanDCs werden durch La-Protein aktiviert, wenn bakterielle Nukleinsäure gebunden ist 87 6. Zusammenfassung 91 Summary 94 Literaturverzeichnis 97 Danksagung 107 Anlagen 109

ÿþD / ÿþS

While clearly different in their aims and means, classification and diagnosis both try to accurately label the disease patients are suffering from. For systemic lupus erythematosus (SLE), this is complicated by the multi-organ nature of the disease and by our incomplete understanding of its pathophysiology. Hallmarks of SLE are the presence of antinuclear antibodies (ANA), and multiple immune-mediated organ symptoms that are largely independent. In an attempt to overcome limitations of the current sets of SLE classification criteria, a new fourphase approach is being developed, which is jointly supported by the European League Against Rheumatism (EULAR) and the American College of Rheumatology (ACR). This review attempts to delineate the performance of the current sets of criteria, the reasons for the decision for classification, and not diagnostic, criteria, and to provide a background of the current approach taken.

Objective: The European League Against Rheumatism and the American College of Rheumatology jointly embarked on a new classification criteria for systemic lupus erythematosus (SLE) project. Its first phase involved generation of a broad set of items potentially useful for classification of SLE. This study was undertaken to add the patient perspective to an expert Delphi approach and an early patient cohort study. Methods: A national cross-sectional study was conducted. A self-report questionnaire was published in the ‘‘Schmetterling’’ (Butterfly), the quarterly journal of the German SLE patient association. Individuals with SLE were asked to anonymously complete the questionnaire, which asked for demographic details, organ manifestations, autoantibodies and symptoms. Results: A total of 339 completed questionnaires out of 2498 were returned, a response rate of 13.6%; 83.2% reported they were ANA positive and 81.7% reported joint, 66.1% skin and 33.0% renal involvement. For the time before and in the first year after their SLE diagnosis, the majority reported fatigue (89.4%), joint pain (86.7%), photosensitivity (79.4%) and myalgia (76.1%). Of interest, more than half of the patients reported fever as an early symptom (53.7%). Conclusion: For a Caucasian European SLE patient population, the overall characteristics suggest meaningful representation. While many symptoms were reported as expected, the high percentage of patients reporting fever and the significant number of patients with unexpected gastrointestinal complaints are of particular interest. These data add to the information on early SLE symptoms informing the development process of new SLE classification criteria.

Diese Arbeit untersucht die Wirksamkeit des monoklonalen Antikörpers Belimumab bei Patient*innen mit systemischem Lupus erythematodes in einer monozentrischen Routinekohorte. Besonderes Augenmerk lag auf der Betrachtung des Ansprechens einzelner Organmanifestationen. Es sollten Subgruppen mit hoher oder niedriger Wahrscheinlichkeit für ein Ansprechen identifiziert werden. Es erfolgte eine retrospektive Auswertung von regelmäßig und standardisiert erhobenen Patient*innendaten. Betrachtet wurden dokumentierte Symptome, Laborparameter und daraus abgeleitete klinische Scores. Betrachtet wurden 4 Zeitpunkte in den ersten 12 Monaten der Therapie und ein weiterer Last visit-Zeitpunkt zur Evaluation des Langzeiterfolges. Bei Patient*innen, deren Therapie vorzeitig beendet wurde, wurden die Werte der letzten Beobachtung unter Therapie übernommen. Es erfolgte eine Auswertung in Untergruppen, abhängig vom Nachweis von Organmanifestationen zu Therapiebeginn. Untersucht wurde ein aussagekräftiges Studienkollektiv mit eher niedriger Krankheitsaktivität. Die Therapie mit Belimumab am UKD wurde für die meisten Patient*innen als erfolgreich bewertet; von 27 Therapien wurden 21 (78 %) von den behandelnden Ärzt*innen als erfolgreich eingeschätzt, was auf eine gute Wirksamkeit in der Population hinweist. Die Zahl symptomfreier Personen stieg innerhalb von 12 Monaten von 1 auf 7 und im weiteren Therapieverlauf auf 10. Es zeigten sich signifikante Änderungen von klinischen Scores und Komplementproteinen; so fiel der mediane SLEDAI von 6 auf 4 Punkte und das mediane C4 stieg von 0,09 g/l innerhalb von 12 Monaten auf normwertige 0,10 g/l sowie im weiteren Verlauf auf 0,16 g/l. Die mittlere Prednisolondosierung wurde innerhalb von 12 Monaten von 5,8 mg/d auf 5,0 mg/d und langfristig auf 3,3 mg/d gesenkt. Belimumab zeigte sich bei 6 von 6 Patient*innen mit Exanthem und 4 von 6 Patient*innen mit Arthritis mit fast vollständigem Symptomrückgang sehr gut wirksam. Von 10 Patient*innen mit einem initialem Prednisolonbedarf von ≥ 7,5mg/d konnten 6 ihre Prednisolondosis um mindestens 25 % senken. Das Symptom Fatigue wurde bei 6 von 18 Patient*innen nach 12 Monaten nicht mehr dokumentiert. Von 11 Patient*innen mit Raynaud-Symptomatik wurde ebendiese nach 12 Monaten nur noch von 7 dokumentiert. Es zeigten sich keine Hinweise auf eine Wirksamkeit auf Leuko- oder Thrombopenie. In weiteren Studien könnte die Wirksamkeit von Belimumab bei Patient*innen mit Lupusnephritis, Raynaud-Symptomatik, Fatigue, hämatologischer Beteiligung und niedriger Krankheitsaktivität weiter untersucht werden.:INHALTSVERZEICHNIS III ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS VIII 1 EINLEITUNG 10 1.1 Systemischer Lupus erythematodes (SLE) 10 1.1.1 Geschichte 10 1.1.2 Epidemiologie 11 1.1.3 Ätiologie und Pathogenese 11 1.1.4 Symptome 12 1.1.4.1 Konstitutionell 14 1.1.4.2 Hämatologisch 14 1.1.4.3 Neuropsychiatrisch 14 1.1.4.4 Mukokutan 14 1.1.4.5 Serositis 15 1.1.4.6 Muskuloskelettal 15 1.1.4.7 Renal 15 1.1.4.8 weitere Symptome 15 1.1.5 Diagnostik 16 1.1.5.1 Anamnese 16 1.1.5.2 Klinische Untersuchung 16 1.1.5.3 Labordiagnostik 16 1.1.6 Aktivitätsmessung 17 1.1.7 Letalität 17 1.1.8 Sozioökonomische Belastung und QOL-Einschränkung 18 1.1.9 Klassifikationskriterien 19 1.1.10 Aktivitätsscores 20 1.1.11 Therapie 20 1.1.11.1 Basismaßnahmen 21 1.1.11.2 Glukokortikoide 21 1.1.11.3 DMARDs (disease-modifying anti-rheumatic drugs) 21 1.1.11.4 Cyclophosphamid 22 1.2 Belimumab 23 1.2.1 Wirkmechanismus 23 1.2.2 Zulassungsstudien 23 1.2.2.1 Studienpopulation 24 1.2.2.2 nachgewiesene Effekte 24 Unerwünschte Arzneimittelwirkungen (UAW) in den Zulassungsstudien 25 1.2.2.3 Zulassung 26 1.2.3 Belimumab in der klinischen Anwendung 26 2 FRAGESTELLUNG 27 3 MATERIAL UND METHODEN 28 3.1 Studienkollektiv 28 3.2 Ethik 28 3.3 Erhobene Daten 28 3.3.1 Charakterisierung des Studienkollektivs 29 3.3.2 Datumsangaben 29 3.3.3 Zeitpunkte 29 3.3.4 Zeitpunktabhängige Parameter 30 3.3.5 Erhobene, nicht aussagekräftige Daten 32 3.3.6 Organmanifestationen 32 3.4 Quellen 33 3.4.1 Patient*innenakte 34 3.4.2 Ärztliche Verlaufsdokumentation 34 3.4.3 Medikamente 35 3.4.4 SLE-Bogen 35 3.4.5 Laborwerte 36 3.4.6 Berechnung von klinischen Scores 37 3.4.7 Therapieerfolg 37 3.4.8 Dokumentationsungenauigkeiten 37 3.5 Statistische Verfahren 38 3.5.1 Normalverteilung 38 3.5.2 Signifikanztests 39 4 ERGEBNISSE 41 4.1 Studienkollektiv 41 4.1.1 Allgemeine Zusammensetzung 41 4.1.2 Erfüllung der EULAR/ACR2019-Kriterien 43 4.1.3 Antikörperstatus 44 4.1.4 Charakterisierung der einzelnen Patient*innen 45 4.2 Zeitpunktübergreifende Ergebnisse 49 4.2.1 Auswertungszeitraum 49 4.2.2 Therapiedauer 50 4.2.3 Zeitpunkte und beendete Therapien 50 4.2.4 Therapieerfolg 51 4.2.5 Krankheitsschübe und Prednisolonstoßtherapien 52 4.2.6 weitere Medikamente 53 4.2.7 Unerwünschte Arzneimittelwirkungen 53 4.3 Zeitpunktabhängige Ergebnisse 55 4.3.1 Datumsdifferenzen 55 4.3.2 Prednisolonbasistherapie 56 4.3.3 Symptome 56 4.3.4 Paraklinik 58 4.3.5 Scores 58 4.3.6 Angaben auf der visuellen Analogskala 59 4.4 Auswertung nach Patient*innengruppen 61 4.4.1 Indikationsrelevante Organbeteiligungen 61 4.4.2 Patient*innen mit Arthritis 62 4.4.3 Patient*innen mit Fatigue 64 4.4.4 Patient*innen mit Exanthem 67 4.4.5 Patient*innen mit Raynaud-Symptomatik 68 4.4.6 Patient*innen mit hämatologischer Beteiligung 70 4.4.7 Patient*innen mit hohem Prednisolonbedarf 74 4.4.8 Patient*innen mit aktiver Lupusnephritis 76 5 DISKUSSION 78 5.1 Stärken und Schwächen der Studie 78 5.1.1 Anzahl der Patient*innen 78 5.1.2 Definition des Therapieerfolgs 78 5.1.3 Schubförmiger Verlauf der Erkrankung 79 5.1.4 Systematischer Fehler der Scores 79 5.1.5 Fortführung der letzten Beobachtung bei Patient*innen mit beendeter Therapie 80 5.1.6 Last visit-Zeitpunkt 80 5.1.7 Auswertung nach Patient*innengruppen 80 5.2 Studienkollektiv 82 5.2.1 Allgemeine Zusammensetzung 82 5.2.2 Erfüllung der EULAR/ACR2019-Kriterien 84 5.2.3 Antikörperstatus 86 5.3 Zeitpunktübergreifende Ergebnisse 87 5.3.1 Therapieerfolg 87 5.3.2 Krankheitsschübe und Prednisolonstoßtherapien 87 5.3.3 weitere Medikamente 87 5.3.4 Unerwünschte Arzneimittelwirkungen 87 5.4 Zeitpunktabhängige Ergebnisse 89 5.4.1 Datumsdifferenzen 89 5.4.2 Prednisolonbasistherapie 89 5.4.3 Symptome 89 5.4.4 Paraklinik 89 5.4.5 Scores 90 5.4.6 Angaben auf der visuellen Analogskala 91 5.5 Auswertung nach Patient*innengruppen 92 5.5.1 Indikationsrelevante Organbeteiligungen 92 5.5.2 Patient*innen mit Arthritis 93 5.5.3 Patient*innen mit Fatigue 93 5.5.4 Patient*innen mit Exanthem 93 5.5.5 Patient*innen mit Raynaud-Symptomatik 94 5.5.6 Patient*innen mit hämatologischer Beteiligung 94 5.5.7 Patient*innen mit hohem Prednisolonbedarf 94 5.5.8 Patient*innen mit aktiver Lupusnephritis 95 5.6 Relevanteste Ergebnisse 96 5.7 Ausblick 97 6 ZUSAMMENFASSUNG 98 7 SUMMARY 99 LITERATURVERZEICHNIS 106 ANHANG 123 DANKSAGUNG 124 ANLAGE 1: ERKLÄRUNG ZUR ERÖFFNUNG DES PROMOTIONSVERFAHRENS 125 ANLAGE 2: ERKLÄRUNG ZUR EINHALTUNG AKTUELLER GESETZLICHER VORGABEN 126

Fojtikova 2011 INTRODUCTION: Several factors like genetic susceptibility is required for systemic rheumatic diseases development. Immunomodulatory PRL effect supports autoimmunity. AIMS: 1. To detect the immunogenetic background (alleles HLA class I, II and microsatellite polymorphism of the transmembrane part exon 5 of MIC-A gene) of SLE and PsA. 2. To detect PRL serum and synovial fluid with regard to clinical and laboratory RA activity. 3. To find the role of the functional polymorphism -1149G/T SNP PRL of extrapituitary promoter of PRL gene in SLE, RA, PsA, SSc and inflammatory myopathies development. METHODS: Genetic analyses of pateints with SLE (n=156), RA (n=173), PsA (n=100), SSc (n=75), PM (n=47) a DM (n=68) and 123 healthy individuals: PCR-SSP (HLA clase I and II), PCR-fragment analysis (MIC-A) a PCR-RFLP (-1149 G/T SNP PRL). In 29 RA a 26 OA PRL serum and synovial fluid concentrations were detected using immunoradiometric assay. RESULTS: 1. The allele HLA-DRB1*03 (pc=0.008; OR 2.5) and haplotype HLA-DRB1*03-DQB1*0201 (pc <0.001; OR 4.54) were determined as risk immunogenetic markers for SLE in Czech population. In SLE versus controls allele MIC-A5.1 was increased (pc =0.005; OR 1.88). MIC-A5.1 together with HLA-DRB1*03 increases the risk for SLE development, pc <0.000001; OR 9.71....

Fojtikova 2011 INTRODUCTION: Several factors like genetic susceptibility is required for systemic rheumatic diseases development. Immunomodulatory PRL effect supports autoimmunity. AIMS: 1. To detect the immunogenetic background (alleles HLA class I, II and microsatellite polymorphism of the transmembrane part exon 5 of MIC-A gene) of SLE and PsA. 2. To detect PRL serum and synovial fluid with regard to clinical and laboratory RA activity. 3. To find the role of the functional polymorphism -1149G/T SNP PRL of extrapituitary promoter of PRL gene in SLE, RA, PsA, SSc and inflammatory myopathies development. METHODS: Genetic analyses of pateints with SLE (n=156), RA (n=173), PsA (n=100), SSc (n=75), PM (n=47) a DM (n=68) and 123 healthy individuals: PCR-SSP (HLA clase I and II), PCR-fragment analysis (MIC-A) a PCR-RFLP (-1149 G/T SNP PRL). In 29 RA a 26 OA PRL serum and synovial fluid concentrations were detected using immunoradiometric assay. RESULTS: 1. The allele HLA-DRB1*03 (pc=0.008; OR 2.5) and haplotype HLA-DRB1*03-DQB1*0201 (pc <0.001; OR 4.54) were determined as risk immunogenetic markers for SLE in Czech population. In SLE versus controls allele MIC-A5.1 was increased (pc =0.005; OR 1.88). MIC-A5.1 together with HLA-DRB1*03 increases the risk for SLE development, pc <0.000001; OR 9.71....