<p>Manganese (Mn) is an essential element and, at high doses, a neurotoxin that many workers are exposed to daily. Increased Mn body burden due to occupational exposures leads to a parkinsonian disorder that features symptoms such as mood disturbances, cognition deficits, and motor dysfunction. To understand exposed workers’ risk, biomarkers of exposure have been developed using blood, hair, bone, and toenails. None of these biomarkers take into account how much Mn is in the brain and instead rely on the assumption that Mn uptake in these materials is proportional and related to the levels in the brain. One way to measure Mn in the brain is through neuroimaging modalities, such as magnetic resonance imaging and positron emission tomography, however there remains a need to establish reliable neuroimaging biomarkers for Mn exposure and its toxicological effects. This thesis addresses this need.</p><p>First, we hypothesized that changes in Mn exposure would be reflected by changes in the MRI relaxation rate R1 and thalamic γ-aminobutyric acid (GABA). As part of a prospective cohort study, 17 welders were recruited and imaged on two separate occasions approximately two years apart. MRI relaxometry was used to assess changes of Mn accumulation in the brain. Additionally, GABA was measured using magnetic resonance spectroscopy (MRS) in the thalamic and striatal regions of the brain. Air Mn exposure ([Mn]air) and cumulative exposure indexes of Mn (Mn-CEI) for the past three months (Mn-CEI3M), past year (Mn-CEI12M), and lifetime (Mn-CEILife) were calculated using personal air sampling and a comprehensive work history, while toenails were collected for analysis of internal Mn body burden. Finally, welders’ motor function was examined using the Unified Parkinson’s Disease Rating Scale (UPDRS). Mn-CEI12M decreased significantly between the first and second scan (Wilcoxon Signed Rank, p = 0.02). ΔMn-CEI3M were correlated with R1 in the substantia nigra (spearman partial correlation, ρ = 0.50, p = 0.036) and thalamic GABA (ρ = 0.66, p = 0.001), but only GABA significantly decreased linearly with Mn-CEI3M (quantile regression, β = 15.22, p = 0.02). Finally, Mn-CEILife influences the change in R1 in the substantia nigra with Δ[Mn]Air, where higher Mn-CEILife lessened the ΔR1 per Δ[Mn]Air (F-test, p = 0.005). While R1 and GABA changed with Mn exposure, UPDRS was unaffected.</p><p>Secondly, we hypothesized that occupational exposure to Mn would lead to disturbances in dopamine release (DA), as measured with PET. Excess exposure to manganese (Mn) can lead to symptoms similar to Parkinson’s disease (PD). While symptoms of PD are due to loss of nigrostriatal dopaminergic neurons, there is no DA neuron loss with Mn toxicity. To assess how DA release may be affected by Mn exposure, 6 subjects (3 welders, 3 controls) were scanned with positron emission tomography and [11C]raclopride (a DA D2/D3 receptor antagonist displaceable by endogenous DA) at baseline and during an amphetamine challenge. There were no apparent differences in amphetamine-induced striatal DA release between groups. However, UPDRS motor scores were positively linearly related to [11C]raclopride binding potential (BPND) in the putamen, whereas Mn-CEILife was negatively related to baseline pre-commissural caudate and ventral striatum BPND. The pilot results suggest that [11C]raclopride PET might delineate the cause of mood and motor dysfunction in subjects exposed to Mn.</p><p>Third, we hypothesized that advanced data analysis techniques, such as machine learning, would increase our power in finding differences between groups of welders and controls based on exposure and biological outcomes. This study used data from previous studies in occupationally exposed welders and controls. Whole brain relaxometry using MRI measuring the relaxation rate R1 was acquired in 52 welders and 37 controls. Because measures of R1 in selected regions of the brain have been previously found to be proportional to Mn, we hypothesized that an advanced model taking into account the whole brain might be more predictive for Mn exposure. Additionally, because R1 is proportional to Mn in the region, we used a biokinetic model to estimate the amount of excess Mn in the brain from occupational exposures. Support vector machines (SVM) with a linear kernel were trained using leave-one-out cross-validation. Results indicated that models had recall and accuracy better than chance targeting air Mn exposure, years welding, age, and thalamic GABA. In comparison to all models, R1 appears to reliably predict thalamic GABA across all thresholds, which was previously shown to change with increased Mn exposure. This suggests that while R1 may be proportional to Mn, some Mn may not be free to contribute to signal, and instead thalamic GABA might better reflect the overall amount of free Mn in the brain. </p><p>Collectively, this thesis is a successful step towards establishing neuroimaging biomarkers of effect from occupational Mn exposure. The MRI relaxation rate R1, with adequate modeling, could eventually be used to measure total Mn brain burden while thalamic GABA might represent a better metric for measuring the neurochemical effects from recent exposures. However, future research should incorporate more endpoints, such as motor tests, mood assessments, and behavior assessments. </p><div><br></div><p><br></p>

O impacto dos metais na fisiologia de peixes tem sido considerado preocupante, pois são contaminantes críticos nos ecossistemas aquáticos devido ao seu alto potencial de entrar no organismo, acumular-se e ser transferido na cadeia trófica e muitos estudos têm demonstrado os efeitos sobre várias funções em animais, quando expostos a estes metais. O rio Paraíba do Sul vem apresentando concentrações de alumínio (Al) e manganês (Mn) acima dos valores permitidos pela legislação Brasileira e, além disso, fatores abióticos tais como a acidez da água, podem contribuir para alteração do potencial de toxicidade, podendo acarretar em danos à biota aquática. As respostas desencadeadas pelos animais a estas mudanças ambientais podem levá-los a um estado de estresse, que é altamente energético devido à realocação de substratos inicialmente destinados às atividades de elevada demanda energética, como crescimento e reprodução, em direção às atividades que requerem intensificação para restaurar a homeostase. O presente estudo teve como objetivo avaliar os efeitos dos metais Al e Mn em pH ácido, isoladamente e em combinação, durante 96 horas (teste agudo) nas brânquias e nos substratos metabólicos de fêmeas vitelogênicas de Astyanax bimaculatus e, adicionalmente após um período de 96 horas em água limpa, verificar a habilidade dos animais em se recuperar na ausência destes metais. Os animais foram divididos em 5 grupos experimentais: CTR em pH neutro; pH ácido; Al; Mn; e Mn+Al. Os dados mostram que quando expostos a estes metais isoladamente, a atividade enzimática da bomba Na+/K+ ATPase e a quantidade de células de cloreto foram diminuídas, no entanto quando combinados, estes efeitos não foram observados. O Al isolado e em associação com o Mn promoveu peroxidação de fosfolipídios de membrana. Além disso nos animais expostos aos dois metais juntos, houve um aumento de ácidos graxos monoinsaturados (MUFA) e saturados (STA) acompanhado pela diminuição dos ácidos graxos polinsaturados (PUFA) o que pode ter evitado alterações na atividade de bomba e na quantidade de células de cloreto na combinação destes metais. Considerando-se os substratos metabólicos, a exposição ao Al diminuiu a concentração de proteínas nos ovários e no plasma, glicogênio muscular, além de alterar as porcentagens de MUFA e PUFA no fígado, e PUFA nos ovários. O Al também promoveu lipoperoxidação hepática, e no período de recuperação houve diminuição da concentração de lipídios em vários tecidos analisados. A exposição ao Mn promoveu diminuição das concentrações de proteínas totais em todos os tecidos analisados, seja no período de exposição agudo ou de recuperação, não havendo a recuperação deste substrato no fígado e nos ovários; o Mn promoveu lipoperoxidação nos fosfolipídios das membranas do fígado e, em associação com o Al, pareceu interferir na dinâmica dos PUFA das membranas dos ovários. Várias interações foram observadas entre o Al e Mn, demonstrando casos de antagonismo, potenciação e até mesmo de sinergismo entre estes metais, dependendo do parâmetro fisiológico analisado, evidenciando que a exposição de fêmeas vitelogênicas a estes metais pode ser prejudicial ao processo reprodutivo principalmente devido à ação observada, inclusive nos ovários / The impact of metals in fish physiology has been considered worrying due to their high potential of entering in the organism, to accumulate and be transferred through the food chain and many studies have shown the effects on several functions in animals, when exposed to these metals. The Paraíba do Sul river showed aluminum (Al) and manganese (Mn) concentrations above the values allowed by the Brazilian law and moreover abiotic factors, such as acidic water, can contribute to changing the toxicity potential and can result in damage to aquatic biota. The answers triggered by the animals to these environmental changes can lead to a stress state which has a high energetic cost due to the substrate reallocation, initially designated to activities with high energetic demand, as growth and reproduction, to activities that need to be intensified, to reestablish the homeostasis. The main goals of this study were to evaluate the effects of the metals Al and Mn in acidic pH, alone and in combination, during 96 hours (acute test) in the gills and in metabolic substrates in Astyanax bimaculatus vitelogenic females and, additionally, verify the ability of the animals to recover in the absence of the metals after the 96 hours in clear water. The animals were divided in 5 groups : CTR in neutral pH; acidic pH; Al; Mn; and Mn+Al. The results showed that when the animals were exposed to the isolate metals, there was a decrease in the Na+/K+ ATPase pump activity and in the amount of chloride cells, however when combined, these effects were not observed. Al, isolated or in association with Mn, promoted phospholipids peroxidation in gill membranes. Furthermore, in the animals exposed to both metals together, there were an increase in monounsaturated fatty acids (MUFA) and saturated fatty acids (STA) and decrease in polyunsaturated fatty acids (PUFA) which may have avoided alterations in pump activity and in the amount of chloride cells. In the metabolic substrates, Al exposition decreased plasma and ovaries protein concentration, muscle glycogen, and altered the percentage of MUFA and PUFA in the liver, and PUFA in the ovaries. Al also promoted liver lipoperoxidation, and in the recovery period lipid content decreased in most tissues analyzed. Mn exposition promoted a decrease in total protein content in all tissue analyzed, both in the acute and recovery periods, and there was no recovery of this substrate in liver and ovaries; Mn promoted lipoperoxidation in liver phospolipids and, in association with Al, interfered in the PUFA dynamic in ovaries membranes. Many interactions were observed between Al and Mn, evidencing antagonism, potentiation and also synergism, depending on the physiologic parameter analyzed, showing that the exposition of vitellogenic females to these metals can be harmful to reproductive process due to the observed actions, including in ovaries

Os solos brasileiros são predominantemente ácidos, ocorrência comum nas regiões tropicais. Esta condição, aliada a outros fatores abióticos e bióticos, pode resultar em toxicidade de manganês (Mn) às plantas, o que limita o seu desenvolvimento. A utilização de práticas agrícolas convencionais propicia o aumento da toxidez de Mn, à medida que reduz o teor de matéria orgânica. Para atenuar este problema, algumas práticas como a calagem e o melhoramento genético são amplamente utilizados. Entretanto, a utilização de alternativas de manejo da cultura através do uso da simbiose micorrízica, para induzir maior resistência das plantas a altos níveis de Mn, parece bastante promissora. Para investigar possíveis mecanismos de indução da resistência e interações de nutrientes no controle da toxicidade de Mn em soja, foram avaliados o crescimento, a absorção e a acumulação de Mn, Fe, P e Ca e a atividade de catalase, peroxidase, superóxido dismutase e oxidase de AIA, nas folhas e raízes das plantas micorrizadas e não micorrizadas, além do nível de colonização de raízes pelo fungo micorrízico arbuscular (FMA). A planta teste foi a soja (Glycine max L. Merr. CV. IAC 8-2). O experimento foi executado em casa de vegetação, em vasos preenchidos com 4 Kg de solo classificado como Neossolo Quartzarênico típico, previamente autoclavado para eliminar fungos micorrízicos arbusculares. O delineamento foi inteiramente casualizado, em esquema fatorial, 4x5: dois isolados de FMA, Glomus etunicatum e Glomus macrocarpum, cada qual com 30 mg kg -1 de P adicionado ao substrato e dois controles não inoculados, sendo um com 30 mg kg -1 e outro com 50 mg kg -1 de P, 5 níveis de Mn (0, 5, 10, 20, 40 mg kg -1 ). Foram realizadas duas épocas distintas de colheita, aos 45 e 90 dias. As atividades enzimáticas foram avaliadas pelo método PAGE não-denaturante através de análise visual. Os resultados demonstram que níveis de Mn entre 10 e 40 mg kg -1 no substrato podem induzir respostas de toxidez de Mn em plantas de soja, acompanhadas de redução de crescimento e alterações no padrão de absorção de vários nutrientes vegetais. O aumento da dose de P e a presença da micorriza são fatores de atenuação da toxidez de Mn em soja, visto que plantas micorrizadas contêm menor concentração de Mn em seus tecidos e, de uma maneira geral, menor atividade enzimática de peroxidase (PO) e oxidase do ácido-indolacético (AIA) do que as plantas controles. Aumentos no nível de Mn do substrato podem causar um aumento da atividade de PO e de oxidase de AIA nas plantas, sendo que as plantas mais estressadas quase sempre apresentam maior atividade dessas enzimas. Apesar da superóxido dismutase (SOD) ser também enzima antioxidativa, apresenta um padrão eletroforético diferenciado da PO, sendo que na raiz sua maior atividade está correlacionada com a presença do FMA. / Brazilian soils are predominantly acid, which is considered a common incident in tropical regions. Soil acidity in combination with biotic and non-biotic factors can result manganese toxicity in plants, limiting their development. The use of conventional agricultural practices promotes an increase in Mn toxicity, as it reduces the soil content of organic matter. This problem can be minimized by the use of some tilling practicies like liming and breeding, which are widely used. However, crop management alternatives through the use of mycorrhizae to induce greater Mn tolerance in plants under high levels of Mn seem to be promising. In this work, plant growth, the absorption, distibution of Mn, Fe, P, Ca and activity of catalase, peroxidase, superoxide dismutase and indolacetic acid oxidase were evaluated in leaves and roots of plants inoculated with mycorrhizal fungi and non-inoculated ones, to invetigate a possible resistance induction mechanism and nutrient interactions in control of toxic levels of Mn. A greenhouse experiment was conducted with soybean plant (Glycine max L. Merr. CV. IAC 8-2) in a completely randomized factorial design 4x5: inoculation of two different arbuscular mycorrhizal fungi (AMF): Glomus etunicatum and Glomus macrocarpum, which received 30 mg kg -1 of P, and two non-inoculated controls, one that received 30 mg kg -1 and the other with 50 mg kg -1 of P; 5 levels of Mn (0, 5, 10, 20, 40 mg kg -1 ). There were two harvest periods, 45 and 90 days. The enzymatic activities were evaluated in non-denaturing polyacrilamyde gel eletrophoresis (PAGE). Manganese levels between 10 and 40 mg kg -1 in the substrate can induce Mn toxicity in soybean plants, that results in a growth reduction and in alterations in the nuttrient absorption alterations of the plants. The increase of P and the presence of mycorrhizae result in the alleviation of Mn toxicity in soybean plants. Micorrhizal plants present lower Mn concentration and generally less enzymatic activity of indolacetic acid oxidase and peroxidase than control plants. Although both, peroxidase and superoxide dismutase are antioxidant enzymes, they present differentiated electrophoretic standards. Most of the time peroxidase and indolacetic acid oxidase activities increase due to increasing Mn levels. Superoxide dismutase activity, however, is higher in the shoots of micorrhizal plants when compared to control plants.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Na drenagem ácida de mina a contaminação pelo manganês é notável e se caracteriza como um dos principais problemas ambientais vivenciados pela indústria mineradora. Este elemento tem sido frequentemente encontrado em concentrações muito acima do limite permitido para o lançamento que, de acordo Resolução CONAMA No. 430, é de 1,0 mg/L. Neste contexto, a precipitação oxidativa com KMnO4, quando empregada para recuperação e remoção do manganês, se destaca como um processo promissor. Neste trabalho, a primeira etapa constou de um planejamento estatístico onde foi possível a avaliação da influência de parâmetros de processo e a modelagem empírica da precipitação oxidativa do Mn II em amostras preparadas em laboratório. Foram avaliados quatro parâmetros: a dose de KMnO4, o pH, o tempo de reação e a concentração da solução de KMnO4. Apenas a dose de KMnO4, o pH e a interação entre estes dois fatores apresentaram influência significativa sobre o processo de precipitação oxidativa do manganês. Na etapa de otimização, a análise do aspecto das superfícies de resposta, descritas por modelos matemáticos empíricos, permitiu avaliar as combinações entre o pH e a dose de KMnO4 que contribuem para uma maior eficiência do processo. Os melhores resultados foram obtidos para doses de KMnO4 de 1,63 mg KMnO4/mg Mn II em pH 3,0 e 1,54 mg KMnO4/mg Mn II em pH 5,0. As remoções de manganês observadas nestas condições foram 99,84% e 99,90% respectivamente, para uma concentração inicial de 100 mg/L. Posteriormente, o estudo cinético do processo utilizando soluções de Mn II preparadas em laboratório, mostrou que a precipitação do manganês com KMnO4 apresenta a vantagem de ser rápida. A concentração de Mn II decresceu exponencialmente atingindo limites inferiores a 1,0 mg/L em menos de 10 minutos de reação. A cinética da reação foi favorecida com a elevação do pH. Os precipitados formados apresentaram baixa cristalinidade com pequenas diferenças morfológicas em função do pH do meio, sendo a fase mineralógica encontrada a birnessita (MnO2), de acordo com espectroscopia RAMAN. Estas observações experimentais estão de acordo com os resultados da modelagem realizada com o programa PHREEQC, na qual a presença do óxido de manganês MnO2 foi confirmada nas fases birnessita, pirolusita e nsutita. Na etapa final, amostras de drenagem ácida oriundas de uma antiga mina de urânio desativada foram caracterizadas quimicamente e submetidas ao tratamento com KMnO4 em escala laboratorial. A caracterização das amostras mostrou que os parâmetros que estão fora da especificação segundo a legislação são o manganês, o fluoreto e também o pH. Além disso, as concentrações de cálcio, alumínio e sulfato são relativamente elevadas. O ensaios de precipitação oxidativa foram conduzidos em valores de pH 3,0, 5,0 e 7,0. Em pH 7,0 o processo mostrou-se mais eficiente, não apenas em relação a remoção de Mn II, que alcançou níveis de aproximadamente 99 %, mas também em termos da velocidade de reação, sendo o equilíbrio atingido em 10 min de reação. Verificou-se uma remoção mais significativa dos outros componentes como ferro, alumínio e urânio na etapa de ajuste do pH para 7,0 com NaOH. Os precipitados formados na etapa de oxidação não apresentaram cristalinidade, contudo foram identificadas as fases birnessita (MnO2), hausmanita (Mn3O4) e manganita (MnOOH), de acordo com espectroscopia RAMAN. Além do manganês, foram detectados nos precipitados: alumínio, cálcio, zinco, urânio, terras raras, oxigênio e flúor. A simulação com o PHREEQC permitiu a identificação das fases termodinamicamente possíveis em cada etapa do processo. Na etapa de ajuste de pH foram formadas, principalmente, fases contendo ferro, urânio, alumínio e o manganês. A etapa de adição do agente oxidante foi caracterizada por remoções de manganês nas fases birnessita (MnO2), bixbyita (Mn2O3), hausmanita (Mn3O4), manganita (MnOOH), nsutita (MnO2), pirolusita (MnO2) e cálcio na forma de fluorita (CaF2) / The manganese contamination present in acid mine drainage is outstanding as one of the main environmental issues experienced by the mining sector. This element has been frequently found in concentrations much higher than the allowed limit for discharge which is 1.0 mg/L according to Brazilian legislation, CONAMA No. 430. In this context, the oxidative precipitation by KMnO4, when employed to recover and remove manganese is a promising process. In this work, throughout a statistical design it was possible to assess the influence of process parameters as well as the empirical modeling of oxidative precipitation of Mn II in laboratory prepared samples. The experiments consisted of evaluating four parameters: the KMnO4 dose, pH, reaction time and concentration of KMnO4 solution. Only the dose of KMnO4, the pH and the interaction between these two factors have shown significant influence. In the optimization stage, by observing the aspect of the response surfaces, described by empirical mathematical models, it was possible to find out the combinations between pH and KMnO4 dose that could increase the process efficiency. The best results were obtained throughout trials conduct at pH 3.0 with KMnO4 ratio of 1.63 mg KMnO4/mg Mn II and at pH 5.0 with ratio of 1.54 mg KMnO4/mg Mn II. The manganese removals under these conditions were 99.84% and 99.90%, respectively. Subsequently, the kinetics study was carried out by using solutions of Mn II prepared in the laboratory. The results have shown that the precipitation of manganese by KMnO4 has the advantage of being fast. The concentration of Mn II decreases exponentially reaching the lower limit of 1.0 mg/L around 10 minutes of reaction. Additionally, the kinetics of the reaction is favored with increasing pH. The produced precipitates have low crystallinity and show slight morphologic differences according to the pH assessed. The main mineral phase identified by RAMAN spectroscopy was birnessite (MnO2). These experimental observations match with the modeling results performed withPHREEQC, in which the presence of manganese oxide MnO2 was identified as birnessite, pyrolusite and nsutita. In the final step, samples of acid mine drainage originated from one former and inactive uranium mine were chemically characterized and underwent with KMnO4 in bench scale. The samples characterization showed that manganese, fluoride and the pH are beyond limits set by legislation. Furthermore, the calcium, aluminum and sulphate are present in relatively high concentrations. The oxidative precipitation trials were carried out at pH 3.0, 5.0 and 7.0. At pH 7.0 the process was more efficient for the removal of Mn II, which accomplished levels of approximately 99%, and also in terms of reaction rate, the equilibrium was achieved within 10 min of reaction. Under the same condition i.e., at pH 7.0, there was an increase in the removal of other components such as iron, aluminum and uranium. The precipitates formed were not crystalline; nevertheless it was possible to identified the phases birnessite (MnO2), and possibly hausmanita (Mn3O4) and manganite (MnOOH) by RAMAN spectroscopy. Besides manganese, the species aluminum, calcium, zinc, uranium, rare earths, oxygen and fluorine were also detected in the precipitated. The simulation with PHREEQC enabled the identification of thermodynamically possible phases at each stage of the process. In the step of pH adjustment, essentially, phases containing iron, uranium, manganese and aluminum are formed. The adding of KMnO4 is characterized by manganese and calcium removal as birnessite (MnO2), bixbyite (Mn2O3), hausmaninte (Mn3O4), manganite (MnOOH), nsutite (MnO2), pyrolusite (MnO2) and fluorite (CaF2).

A influência do butirato de sódio (NaBu), do cloreto de manganês (MnCl2), combinados ou isolados, e da cicloheximida (CHX) na síntese de tireotrofina humana recombinante (r-hTSH) derivada de células CHO foi investigada pela primeira vez. Com exceção da CHX, que gerou uma redução de 1,5 vezes na produtividade volumétrica, todos os reagentes geraram um aumento (1,4 vezes para o MnCl2 e 3 vezes para o NaBu e NaBu+MnCl2) na produtividade volumétrica. Também foi observada uma diminuição no número de células viáveis com a utilização de todos os reagentes. A adição destes reagentes ao meio de cultura de células CHO produtoras de hTSH gerou também alterações na glicosilação do r-hTSH. As alterações geradas pela presença de CHX foram todas negativas, resultando em uma diminuição de 5,5% no conteúdo de ácido siálico, 10% na ocupação dos sítios de glicosilação, além de uma diminuição no conteúdo de todos os monossacarídeos neutros. Os demais reagentes, por outro lado, resultaram em alterações positivas. A presença de NaBu no meio de cultura acarretou um aumento de 12% no conteúdo de ácido siálico e de 3% na ocupação dos sítios de glicosilação. Com relação às estruturas de carboidratos presentes no hTSH, foi observado um aumento de 14% nas estruturas bi-antenárias, aumento no conteúdo de manose e fucose e uma diminuição no conteúdo de galactose e N-acetilglucosamina. A presença de MnCl2 no meio de cultura resultou em um aumento de 1,7% no conteúdo de ácido siálico e de 1,3% na ocupação dos sítios de glicosilação. Houve ainda um aumento no conteúdo de manose e N-acetilglucosamina e uma diminuição no conteúdo de fucose e galactose. Um aumento de 7% na freqüência de estruturas bi-antenárias foi também observado quando MnCl2 foi utilizado. O uso simultâneo de NaBu e MnCl2 proporcionou um aumento de 14% no conteúdo de ácido siálico e de 3% na ocupação dos sítios de glicosilação, bem como um aumento no conteúdo de todos os monossacarídeos neutros. Não houve, entretanto, alterações na freqüência das estruturas de carboidratos. Apesar de todas as alterações causadas pelos diferentes reagentes, não foram observadas diferenças na atividade biológica ou no comportamento farmacocinético das diferentes preparações de hTSH estudadas. Este estudo é extremamente relevante, tanto do ponto de vista do desenvolvimento de novos biofármacos, quanto do ponto de vista do controle de qualidade das glicoproteínas hormonais já utilizadas na clínica médica. / The influence of sodium butyrate (NaBu), manganese chloride (MnCl2), combined or isolated, and cycloheximide (CHX) on the synthesis of human thyrotropin CHO-derived (r-hTSH) was investigated for the first time. Exception made for CHX, which caused 1.5-fold reduction on volumetric productivity, all other reagents caused an increase in the volumetric productivity of 1.4-fold with MnCl2 and 3-fold with NaBu and NaBu+MnCl2. The number of viable cells decreased in presence of all these reagents. They also caused alterations in the glycosylation of r-hTSH. When CHX was utilized, a decrease in the content of sialic acid (5.5%), in the site occupancy (10%) and in the content of neutral monosaccharides was observed. In contrast, the addition of NaBu to culture medium caused an increase of about 12% in the sialic acid content and of 3% in the site occupancy. Concerning to carbohydrate structures, an increase of 14% of bi-antennary structures was achieved. In addition, an increased content of mannose and fucose and a decrease in the content of galactose and N-acetyl glucosamine was also observed. When MnCl2 was utilized, an increase of 1.7% in the sialic acid content and of 1.3% in site occupancy occurred. An increased content of mannose and N-acetyl glucosamine was also observed, while the content of fucose and galactose decreased. Concerning to carbohydrate structures, an increase of 7% on bi-antennary structures was achieved. When NaBu and MnCl2 were utilized simultaneously, we observed an increase of about 14% in the sialic acid content, of 3% in the site occupancy, as well as an increase in the content of all neutral monosaccharides. The frequency of carbohydrates structures, however, was not altered. Despite all the changes caused by these different reagents, in vivo biological activity and pharmacokinetic behavior were found not significant different in all the hTSH preparations studied in the present work.

Introdução - A metabolômica permite determinar padrões de variação dos metabólitos entre indivíduos doentes e não doentes, com ou sem ingestão de um determinado alimento ou dieta. Compreender a relação entre metabólitos e doenças metabólicas pode ajudar a combater obesidade e doenças crônicas. Objetivo - Investigar a associação entre o perfil metabolômico de aminoácidos, a ingestão dietética e o estado nutricional em adultos participantes do Inquérito de Saúde no município de São Paulo, Brasil. Métodos - Foram avaliados dados de 168 indivíduos. A análise metabolômica para identificação de 21 aminoácidos foi realizada nas amostras de plasma, utilizando kit AbsoluteIDQTMp180 da Biocrates Life Science AG (Innsbruck, Austria). O consumo alimentar foi estimado por meio da aplicação do questionário de frequência alimentar. Os grupos de aminoácidos e de alimentos foram submetidos à análise fatorial por componente principal. A variável Metabolicamente Saudável foi construída considerando-se as Diretrizes da Sociedade Brasileira de Cardiologia para o diagnóstico e tratamento da síndrome metabólica. A regressão linear múltipla foi aplicada para avaliar as associações, tendo como variáveis de ajustes: etnia, idade, renda familiar, sexo, dieta, atividade física. A comparação entre grupos foi feita por MANOVA e a confirmação da diferença significativa pelo teste de Bonferroni. Resultados - A porcentagem de indivíduos com obesidade foi de 24%, sendo que a média de IMC correspondeu a 26 kg/m2. A população estudada apresentou média de idade de 50 anos, sendo a maioria de etnia branca (56%) e do sexo masculino (52%), com pouca adesão à atividade física (21%). Os parâmetros bioquímicos estavam, em média, abaixo das concentrações estabelecidas como normais, exceto a insulina, cuja média foi de 20,8 ?UI/mL. Todavia, ao estratificar pelo estado nutricional e metabolicamente saudável, os parâmetros bioquímicos se mostraram diferentes, tais como a glicemia, triglicerídeos e colesterol total. A ingestão dietética foi igual entre os grupos estudados. O perfil de aminoácido revelou potencial de diferenciar os estados nutricional e metabólico, destacando os aminoácidos de cadeia ramificada (Leu, Ile, Val). Foram identificados dois padrões de aminoácidos relacionados a beta oxidação e aos aminoácidos glicogênicos. O primeiro teve relação positiva para os indivíduos com obesidade e metabolicamente não saudável. O segundo, apresentou relação inversa para ambos os estados. O consumo de manganês pela população foi de 2,5 mg/dia, sendo infusão de mate a principal fonte (28mg Mn/porção). Os indivíduos obesos ingeriram menor quantidade de manganês, que apresentou relação inversa ao estado nutricional e ao padrão de aminoácidos relacionado ao metabolismo não saudável. Identificaram-se três padrões alimentares: perfil saudável, tradicional e moderno. A associação com o estado nutricional e metabolicamente saudável foi positiva para o padrão saudável. Conclusão - Os aminoácidos de cadeia ramificada se revelaram biomarcadores para identificar o estado nutricional e metabólico de indivíduos adultos. Os indivíduos que tiveram baixo consumo de manganês apresentaram maior adesão ao perfil metabolômico de aminoácidos relacionados com beta oxidação. / Introduction - The metabolomics allows to determine patterns of variation of the metabolites between people with or without illness, considering or not the food consumption. Understanding the relationship between metabolites and metabolic disorders, it is possible to deal with obesity and chronic diseases. Objective - To investigate the association between the metabolic profile of amino acids and dietary intake and nutritional status in adults from the household survey conducted in the city of São Paulo, Brazil. Method - The 21 amino acids were identified by metabolomic analysis, using Absolute IDQTMp 180 kit from Biocrates Life Science AG (Innsbruck, Austria). Food intake was estimated using the food frequency questionnaire. The amino acid and food groups were submitted to factorial analysis by main component. The Metabolically Healthy variable was constructed considering the Guidelines of the Brazilian Society of Cardiology for the diagnosis and treatment of the metabolic syndrome. Multiple linear regression was applied to evaluate the associations, adjusted by the variables: ethnicity, age, family income, sex, diet, physical activity. The comparison between groups was made by MANOVA, and the confirmation of the significant difference, by the Bonferroni test. Results - The percentage of people with obesity was 24%, although the mean BMI corresponded to 26 kg/m2. The population studied presented a mean age of 50 years, most of them white (56%) and male (52%), with little adherence to physical activity (21%). The biochemical parameters were, on average, below the established normal concentrations, except for insulin (20,8 ?UI/mL). However, when stratified by nutritional status and metabolically healthy, the biochemical parameters were statistically different. The dietary intake was the same among the groups studied. The amino acid profile revealed potential to differentiate the nutritional and metabolic states, highlighting the branched chain amino acids. Two amino acid patterns related to beta-oxidation and glycogenic amino acids had been identified. The former had a positive relationship for obese and metabolically unhealthy people. The second presented an inverse relation for both states. The manganese consumption by the population was 2.5 mg / day, and the mate infusion was the main source (28mg Mn/serving). Obese subjects consumed less manganese, which had an inverse relationship to nutritional status and to the amino acid pattern related to unhealthy metabolism. Three dietary patterns were identified: healthy, traditional and modern profiles. The association with nutritional and metabolically healthy status was positive for the healthy pattern. Conclusion - The branched-chain amino acids had been revealed to be biomarkers to identify the nutritional and metabolic status of adult individuals. The individuals that had low manganese consumption showed greater adhesion to the metabolic profile of amino acids related to beta-oxidation, and could be used as biomarker for the ingestion of this micronutrient.

O gênero Aspergillus tem se destacado na produção de enzimas de aplicação industrial, destacando-se dentre estas, as amilases, capazes de hidrolisar as ligações -glicosídicas do amido. As amilases são usadas nos processos industriais para a produção de etanol, glicose e xarope de frutose, além da indústria têxtil, de papéis e detergentes. Neste contexto, este trabalho visou a prospecção de fungos filamentosos para a produção de amilase e a padronização das condições de cultura do Aspergillus japonicus. A otimização das condições de reação da amilase produzida pelo fungo, a purificação, caracterização e teste de diferentes concentrações de íons na atividade enzima pura, a determinação do conteúdo de carboidratos, das constantes cinéticas e análise dos aminoácidos que compõem a glucoamilase purificada e a aplicação da amilase bruta produzida pelo fungo A. japonicus no processo de branqueamento do papel reciclado. Os resultados do screening de fungos filamentosos bons produtores de enzimas amilolíticas evidenciaram dois fungos com alta produção de amilase, os quais foram identificados como Aspergillus parasiticus e Aspergillus japonicus. Os estudos prosseguiram com o A. japonicus como fungo selecionado. Este fungo mostrou melhor produção enzimática no meio de cultura KHANNA e máxima produção amilolítica após 4 dias de crescimento em condições estáticas obtendo uma atividade de 44.65 (± 0.49) U/mL. O pH ideal do meio de cultivo foi de 5,5 e a temperatura ótima de 25°C. As melhores fontes de carbono para a produção enzimática foram o amido de batata e a maltose, respectivamente, e o melhor resíduo de alimento foi a casca e bagaço de laranja. Após a caracterização das condições de cultivo do fungo, vieram as caracterizações dos parâmetros físico-químicos da amilase. A temperatura e pH ótimo de ensaio enzimático foram padronizados sendo, respectivamente, 50C e 5,5. A amilase manteve a sua atividade em torno de 90% de 30º a 50ºC após uma hora de incubação, aproximadamente 95% de sua atividade nos pH de 4,0 a 6,0 e 50% nos pH de 6,5 à 9,0 após uma hora de incubação. Os produtos da hidrólise da amilase mostraram a formação apenas de glicose, na cromatografia de placa delgada de silica, podendo-se supor que esta enzima trata-se de uma glucoamilase, o que foi comprovado por experimentos subsequentes. A enzima bruta foi submetida a eluição em DEAE-cellulose e uma glucoamilase com massa molecular de 72 kDa foi purificada conforme determinado por SDS-PAGE. A temperatura ótima desta glucoamilase purificada foi de 65°C e o pH foi de 5.0. A enzima também demonstrou alta estabilidade a diferentes temperaturas e pH, assim como, uma grande quantidade de produtos gerados quando usada a amilopectina como substrato de reação. A glucoamilase mostrou uma alta ativação na presença de 10 mM de MnCl2, KCl, Pb(C2H3O2)2.3H2O, and 2-mercaptoetanol e um valor de Km de 0,59 mg/mL, Vmáx de 308,01 U/mg e Kcat de 369,58 (s-1). A quantidade de carboidratos que compõem a estrutura da enzima bruta e purificada foram quantificados sendo de 15% e 5,5%, respectivamente. A enzima pura teve seus aminoácidos identificados por análise comparativa com outros gêneros e espécies de fungos produtores de glucoamilase, a enzima também apresentou identidade com o domínio de ligação ao amido existente no fungo Neosartorya fischeri NRRL 181. Quando a glucoamilase bruta foi aplicada no processo de biobranqueamento do papel reciclado impresso por tinta ao jato, a enzima apresentou uma média de 23,34% de aumento da alvura relativa quando comparada ao controle, já na polpa de papel de revista a enzima levou a uma média de 23,89% de aumento na alvura relativa. Os resultados apresentados abrem a possibilidade da utilização destas enzimas no biobranqueamento de polpa de celulose, para a produção e reciclagem de papel pelas indústrias. / The genus Aspergillus has been highlighted in the production of enzymes for industrial application, standing out among these, amylases, capable of hydrolyzing the ?-glycosidic linkages of starch. Amylases are used in industrial processes for the production of ethanol, glucose and fructose syrup, in addition to textiles, detergents and paper. In this context, this work aimed the prospecting of filamentous fungi to produce amylase and the standardization of Aspergillus japonicus culture conditions. The optimization of reaction conditions for amylase produced by the fungus, purification, characterization and testing different concentrations of ions in pure enzyme activity, determining the carbohydrate content, the kinetic constants, analysis of the amino acids that comprise the purified glucoamylase and the application of crude amylase in the bleaching process of the recycled paper. The results of the screening of filamentous fungi that produced good levels of amylolytic enzymes showed two fungi with high production of amylase, which were identified as Aspergillus parasiticus and Aspergillus japonicus. The studies continued with A. japonicus as selected fungus. This strain showed the best enzyme production in the culture medium Khanna and maximum amilolytic production after 4 days of growth under static conditions obtaining an activity of 44.65 (± 0:49) U/ml. The optimum pH of the medium was 5.5 and the optimum temperature of 25°C. The best carbon sources for the enzyme production were potato starch and maltose, respectively, and the best food residue was orange peel and bagasse. After the characterization of fungal culture conditions, came the characterization of physical and chemical parameters of amylase. The temperature and optimum pH of enzyme assay were standardized being, respectively, 5.5 and 50°C. Amylase retained its activity around 90% at 30 to 50°C after one hour of incubation, approximately 95% of its activity in the pH range of 4.0 to 6.0 and 50% in pH range of 6.5 to 9.0 after an hour of incubation. Amylase hydrolysis products showed only the formation of glucose, in thin layer chromatography on silica, and it can be assumed that it is a glucoamylase, which was confirmed by subsequent experiments. The crude enzyme was subjected to elution through DEAE-cellulose and a glucoamylase showing a molecular weight of 72 kDa as determined by SDS-PAGE was purified. The optimum temperature of this purified glucoamylase was 65°C and the pH was 5.0. The enzyme also showed high stability at different temperatures and pH, as well as a large amount of products generated when used as a reaction substrate the amylopectin. Glucoamylase showed a high activation in the presence of 10 mM de MnCl2, KCl, Pb(C2H3O2)2.3H2O, and 2-mercaptoethanol and a Km value of 0.59 mg/mL, Vmax of 308.01 U/mg and Kcat of 369.58 (s-1). The amount of carbohydrates that compose the structure of crude and purified enzyme were measured at 15% and 5.5%, respectively. The pure enzyme had its amino acids identified by comparison with other genera and species of fungi producers of glucoamylase, the enzyme also showed identity with the existing starch binding domain in Neosartorya fischeri NRRL 181 fungus. When the crude glucoamylase was applied in biobleaching process of the recycled paper printed by the ink jet, the enzyme showed an average of 23.34% increase in relative brightness as compared to control, in the journal paper pulp has led to the enzyme an average of 23.89% increase in the relative brightness. The results presented here open the possibility of using these enzymes in pulp biobleaching pulp for the production and recycling of paper by industry.

Metais como o alumínio (Al) e o manganês (Mn) são encontrados na natureza como também em efluentes industriais, e podem ser tóxicos para a biota aquática, apresentando efeitos de desregulação endócrina, por exemplo, para os peixes, podendo afetar o desempenho reprodutivo de uma espécie. Rios e tributários do Estado de São Paulo, mesmo em áreas teoricamente conservadas, têm demonstrado um aumento no aporte destes metais, em concentrações superiores ao permitido pela legislação, e a consequência disso para os peixes é pouco conhecida. Neste estudo foram delineados ensaios de toxicidade para exposição aquática aguda (96 horas) ao Al e ao Mn, de forma isolada e sincrônica, em fêmeas vitelogênicas do teleósteo Astyanax bimaculatus. Este período de exposição foi seguido de um período em água limpa (96 horas) para avaliar a possibilidade de recuperação dos efeitos tóxicos promovidos por estes metais, avaliando-se os seguintes parâmetros: a fecundidade relativa (FR), potencial de bioconcentração destes metais, concentração plasmática de Estradiol (E2), 17&alpha; hidroxiprogesterona (17&alpha;- OHP), Cortisol (CT), Triiodotironina (T3), Tiroxina (T4) e a expressão do mRNA do &beta;FSH e &beta;LH. Foram estabelecidos cinco grupos experimentais: Controle em pH neutro, pH ácido, Al, Mn e exposição Sincrônica ao Al e ao Mn. Os resultados demonstraram que o pH ácido e o Al reduziram a FR sem efeito de recuperação. O Al se bioconcentrou principalmente nas brânquias, fígado e encéfalo, enquanto que o Mn se bioconcentrou principalmente nas brânquias, mas em menor intensidade que o Al. Quando expostos sincronicamente, o Mn potencializou os efeitos de bioconcentração do Al, causando a redução na concentração plasmática de E2 e 17&alpha;-OHP, para este progestágeno apenas na exposição ao Mn, tanto isolada quanto em exposição sincrônica. Contudo não foi observada recuperação na concentração de E2. Ambos os metais, em exposição isolada, causaram redução na concentração plasmática de CT, todavia nenhuma alteração foi registrada na exposição sincrônica. Da mesma forma, ambos os metais causaram redução na concentração plasmática de T4, inclusive a exposição sincrônica, enquanto que o T3 se alterou diferentemente em cada grupo de exposição metálica. Possivelmente os efeitos sobre os hormônios tireoidianos tenham refletido uma resposta de modulação endócrina, enquanto que sobre os esteroides foram efeitos de desregulação endócrina, em uma via anti-esteroidogênica. Nenhum efeito foi observado na expressão gênica do mRNA &beta;LH e não foi possível obter resultado sobre o &beta;FSH, embora os primers tenham sido desenhados especialmente para A. bimaculatus e tenham funcionado corretamente na elaboração da curva padrão para o qRT - PCR. Os resultados encontrados em fêmeas vitelogênicas de A. bimaculatus podem ser relacionados ao tipo de exposição e a interação / Metals such as Aluminum (Al) and Manganese (Mn) are found in nature as well as in industrial effluents, and can be toxic to aquatic biota, with endocrine disrupting effects, e.g. for fish, which can affect the reproductive performance of a species. Rivers and tributaries of São Paulo State, even in theoretically preserved areas, have shown an increase in the supply of these metals in concentrations greater than allowed by law, and the consequence for the fish is poorly understood. In this study, toxicity tests were designed for acute aquatic exposure (96 hours) to Al and Mn, in isolated and synchronous forms, in vitellogenic females of Astyanax bimaculatus, a teleost fish species. This exposure period was followed by a period in clean water (96 hours) to assess the possibility of recovery of toxic effects promoted by these metals, evaluating the following parameters: relative fecundity (FR), bioconcentration potential of these metals, plasma concentration of Estradiol (E2), 17&alpha; hydroxyprogesterone (17&alpha; -OHP), Cortisol (CT), triiodothyronine (T3), thyroxine (T4) and mRNA gene expression of &beta;FSH and &beta;LH. Five experimental groups were established: Control at neutral pH, acidic pH, Al, Mn and synchronic exposure to Al and Mn. The results showed that acidic pH and Al reduced FR with no recovery effect. Al was mainly bioconcentrate in gills, liver and brain, whereas Mn was mainly bioconcentrate in gills, but with less intensity than Al. When exposed synchronously, Mn potentiated the effects of Al bioconcentration, causing a reduction in the plasma levels of E2 and 17&alpha;-OHP, for this progestogen only to Mn exposure, both, in isolated and synchronous exposure. But recovery was not observed in E2 levels. Both metals, in isolated exposure caused a reduction in plasma CT, but no change was recorded in synchronous exposure. Likewise, both metals induced reduction in plasma T4 levels, including synchronous exposure, whereas T3 levels were differently altered in each metal exposure group. Possibly the effects on thyroid hormones have reflected a response to endocrine modulation, whereas steroids showed endocrine disrupting effects in na antiesteroidogenic way. No effects were observed in mRNA &beta;LH gene expression and it was not possible to achieve &beta;FSH results, although the primers were designed especially for A. bimaculatus and have worked properly in the preparation of the standard curve for qRT - PCR. The results found in vitellogenic A. bimaculatus females may be related to the type of exposure and interaction, which were variable between Al and Mn ions.

"Magnetic resonance imaging (MRI) has increasingly become the preferred imaging modality in modern day research to study disease. MRI presents an imaging technique that is practically non-invasive and without any ionizing radiation. This dissertation presents the use of contrast agents in MRI studies to differentiate compartments, to study dose dependence of relaxation times, and to characterize tumors using signal amplifying enzymes in the brain. Differentiating compartments in the brain can be useful in diffusion studies to detect stroke at an early stage. Diffusion-weighted NMR techniques have established that the apparent diffusion coefficient (ADC) of cerebral tissue water decreases during ischemia. However, it is unclear whether the ADC change occurs due to changes in the intracellular (IC) space, extracellular (EC) space, or both. To better understand the mechanism of water ADC changes in response to ischemic injury, making IC and EC compartment specific measurements of water diffusion is essential. The first study was done where manganese (Mn2+) was used as an IC contrast agent. Mn2+ uptake by cells causes shortening of the T1 relaxation time of IC water. The relative difference in T1 relaxation times between the IC and EC compartments can be used to discriminate between the MR signals arising from water in the respective compartments. Mn2+ is also widely used in manganese-enhanced MRI (MEMRI) studies to visualize functional neural tracts and anatomy in the brain in vivo. In animal studies, the goal is to use a dose of Mn2+ that will maximize the contrast while minimizing its toxic effects. The goal of dose study was to investigate the MRI dose response of Mn2+ in rat brain following SC administration of Mn2+. The dose dependence and temporal dynamics of Mn2+ after SC injection can prove useful for longitudinal in vivo studies that require brain enhancement to persist for a long period of time to visualize neuroarchitecture like in neurodegenerative disease studies. Contrast agents, in addition to their use in compartmental differentiation and dose studies, can be used for imaging tumors. The last study in this dissertation focuses on imaging EGF receptors in brain tumors. We tested a novel pretargeting imaging approach that includes the administration of humanized monoclonal antibody (anti-EGFR mAb, EMD72000) linked to enzymes with complementing activities that use a low-molecular weight paramagnetic molecule (diTyr-GdDTPA) as a reducing substrate administered following the mAb conjugates. We analyzed the differential MR tumor signal decay in vivo using orthotopic models of human glioma. The patterns of MR signal change following substrate administration revealed differences in elimination patterns that allowed distinguishing between non-specific and specific modes of MR signal decay. "

Metallic interconnects in intermediate temperature solid oxide fuel cells (IT-SOFC) stacks form Cr2O3 scales on their surface. Such oxide scales can be further oxidized to Cr6+ containing gaseous species that migrate and deposit at the cathode triple phase boundaries, causing significant degradation in the performance of the SOFCs. This phenomenon is termed as ‘Cr-poisoning’. A solution to this problem is the application of coatings on the interconnects that act as a diffusion barrier to Cr migration. Two different Cu/Mn spinel compositions, Cu1.3Mn1.7O4 and CuMn1.8O4, were studied as coating materials. Dense coatings were deposited on both flat plates and meshes by electrophoretic deposition (EPD) followed by subsequent thermo-mechanical or thermal densification steps. At room temperature, Cu1.3Mn1.7O4 coatings were found to have a mixture of CuO and spinel phases, while CuMn1.8O4 coatings were found to have a mixture of Mn3O4 and spinel phases. However, CuMn1.8O4 is a pure spinel phase between 750 °C and 850 °C. After densification processing and high temperature oxidation, a Cr2O3 layer was formed at the coating/alloy interface, which partially reacted with the spinel coatings to form a dense cubic spinel layer of the general composition (Cu,Mn,Cr)3-xO4. In addition, Cr-rich precipitates, formed in the dense layer close to coating/alloy interface. It is believed that these are Cr2O3 precipitates, formed when the solubility of Cr in the spinel phase is reached. Solubility experiments using powders showed that 1 mole of CuMn1.8O4 can effectively getter 1.83 moles of Cr2O3 at 800°C. Electrical conductivity of (Cu,Mn,Cr)3-xO4 was found to be at least two orders of magnitude higher than that of Cr2O3. The coatings acted as an effective Cr getter whose lifetime depends on the oxidation temperature, coating thickness, and the overall porosity in the coating. In-cell electrochemical testing showed that the CuMn1.8O4 coatings on Crofer 22 APU meshes performed significantly better than commercial Cu/Mn spinel coatings. The CuMn1.8O4 coatings gettered Cr effectively for 12 days at 800 ºC, leading to no performance loss of the cell due to Cr-poisoning. Significantly longer lifetime can be achieved at 750 ºC or lower, which is the target operational temperature regime of IT-SOFCs.