Au sein des synapses comme dans les régions extra synaptiques, la diffusion latérale joue un rôle critique dans la densité membranaire des récepteurs. En face des zones actives, l’accumulation de récepteurs détermine en particulier l’efficacité de la transmission synaptique. Il est important de comprendre les paramètres cellulaires qui jouent sur l’accès au compartiment synaptique, qu’ils soient d’origine moléculaires ou morphologiques. Dans les synapses excitatrices, la tige de l’épine dendritique se comporte comme une barrière à la diffusion. Cette barrière pourrait être fonction de la longueur et du diamètre de la tige (paramètre géométrique), ou résider dans la présence d’éléments spécifiques constituant des obstacles à la diffusion. Une sous-population d’épines contient dans sa tige une forme spécialisée de réticulum endoplasmique, appelé appareil épineux et constituée d’un empilement des accules de réticulum. Une protéine liant l’actine, nommée synaptopodine, est associée de façon étroite à l’appareil épineux et participe aux mécanismes de plasticité synaptique. La question centrale de ce travail de thèse était de définir si la présence de synaptopodine influait sur les caractéristiques de la diffusion dans la tige de l’épine, et d’identifier les mécanismes sous-jacents. Afin d’étudier la diffusion membranaire, j’ai utilisé trois protéines recombinantes différentes: une protéine associée au feuillet extérieur de la membrane plasmique (GFP-GPI), une protéine avec un domaine transmembranaire et une courte séquence intracellulaire (TMD-pHluorin), et la sous-unitéGluR5 du récepteur métabotropique (mGluR5) contenant 7 domaines transmembranaires et une séquence intracellulaire volumineuse. Les trois constructions portent une étiquette (GFP ou pHluorin) du côté extracellulaire. Les propriétés diffusives de ces molécules ont été mesurées par un suivi de particules uniques, à base de quantum dots. Ces expériences ont révélé que la diffusion des protéines membranaires est fonction du diamètre de la structure cylindrique considérée, et par conséquent moins rapide dans la tige de l’épine que dans le tronc du dendrite. Mais les propritétés diffusives dépendent aussi de la taille et delà complexité des molécules membranaires considérées. En effet, la diffusion de molécules comportant des domaines transmembranaires est particulièrement faible dans les tiges contenant de la synaptopodine. Cet aspect a été approfondi par l’utilisation de traitements pharmacologiques, qui ont permis de modifier la structure interne de la tige dendritique. Les variations des tailles des domainesoccupés par l’actine-F, et par lesaggrégats de synaptopodine, ont été observées à l’échelle nanoscopique en utilisant l’imagerie PALM/STORM. En conditions contrôle, la synaptopodine occupe la partie centrale de la tige. La dépolymérisation indirecte de l’actine-F par le 4-Aminopyridineentraîne une diminution des zones occupées par ces deux composants, corrélée à une augmentation de la vitesse de diffusion de mGluR5. En revanche, la dépolymérisation par la latrunculin-A (effet direct sur l’actine) induit une augmentation de la taille des clusters de synaptopodine et donc de la surface occupée par ceux-ci dans la tige. Les mesures de la diffusion de la sous-unité mGluR5 réalisées dans ces conditions montrent une accélération de la vitesse de diffusion, indiquant que la mobilité de mGluR5 n’est pas régulée par une interaction directe avec la synaptopodine. En conclusion, je propose un rôle de stabilisation mutuel pourl’actine-F et la synaptopodinedans la tige des épines dendritiques de neurones d’hippocampe en culture. Les épines contenant de la synaptopodine dans leur tige auraient une organisation unique du cytosquelette qui agirait comme une barrière additionnelle pour la diffusion de récepteurs aux neurotransmetteurs. / Lateral diffusion in and outside synapses plays a key role in the accumulation of receptors at synapses, which critically determines the efficacy of synaptic neurotransmission. Therefore, to better understand the trapping of neurotransmitter receptors in synapses, it is important to investigate the mechanisms that may affect receptors diffusion and their capacity to reach synapses. The neck of dendritic spine imposes a diffusional barrier that is considered to depend on the length and diameter of the spine neck. The origin of this barrier could be purely geometrical or could be induced by the presence of specific barriers/obstacles for diffusion. A subpopulation of spines contains a specialized form of endoplasmic reticulum in the spine neck called spine apparatus. The actin-binding protein synaptopodin (SP) is tightly associated with the spine apparatus and participates in synaptic plasticity mechanisms. The central question of my research was to assess whether the presence of the SP affects the diffusion of receptors in the spine neck and to characterize the underlying molecular mechanisms. To study membrane diffusion, I have developed three different probes: a construct associated with the outer leaflet of the plasma membrane (GFP-GPI), a construct with one transmembrane domain and a short intracellular sequence (TMD-pHluorin), and a recombinant metabotropic mGluR5 receptor construct containing an extracellular domain tagged with pHluorin, seven transmembrane domains, as well as a large intracellular region. The diffusion properties of these molecules were measured by single particle tracking using quantum dots. My experiments revealed that the diffusion of membrane proteins was slower in the spine neck than in the dendrite as a result of the different diameter of the two compartments. Furthermore, the diffusion properties depended on the molecular size and complexity of the membrane proteins. Interestingly, the diffusion of membrane proteins with transmembrane domains was particular slow in spine necks containing SP. This could be the result of direct molecular interactions between the membrane proteins and SP or due to spatial constraints that are related to the structural organization of spine necks expressing SP. To address these questions further I used pharmacological treatments to change the internal organization of the spine neck, and measured their effect on the diffusion properties of mGluR5. The distribution of SP and F-actin in the spine neck was determined on the nanoscopic scale using PALM/STORM imaging. This showed that under control condition SP occupies only the central region of the spine neck. Activity-dependent depolymerization of F-actin by 4-Aminopyridine led to a simultaneous decrease of the amount of F-actin and SP and enhanced the diffusion of mGluR5 in all analyzed neck regions. Disruption of F-actin by latrunculin A induced the re-distribution of SP and the formation of larger SP clusters, occupying an increased region within the spine neck. The recruitment of SP was accompanied by an acceleration of mGluR5 diffusion in SP-positive spines, demonstrating that the mobility of mGluR5 is not controlled by direct interactions with SP. Instead, the diffusion of mGluR5 is dependent on the organization of the spine cytoskeleton. In conclusion, I propose that SP and the polymerization of actin filaments have a reciprocal effect on the stability of each other in the spine neck of cultured hippocampal neurons. Spine necks bearing SP have a unique F-actin cytoskeletal organization that acts as an additional diffusion barrier for neurotransmitter receptors such as mGluR5.

Les antipsychotiques sont utilisés en clinique depuis plus de 50 ans pour pallier aux symptômes de la schizophrénie. Malgré une recherche intensive, les mécanismes cellulaires et moléculaires responsables de l’effet clinique de cette médication demeurent encore nébuleux. Ces drogues sont reconnues comme des antagonistes des récepteurs D2 de la dopamine et peuvent moduler la transcription génique dans le striatum. Au cours des recherches qui ont mené à l'écriture de cette thèse, nous avons exploré l’expression de Nur77, un facteur de transcription de la famille des récepteurs nucléaires, afin de caractériser le rôle de la dopamine, la sérotonine, l’adénosine et le glutamate dans la régulation génique contrôlée par les antagonistes D2. En premier lieu, nous avons examiné l’impact de la co-administration d’agents sérotonergiques et adrénergiques sur l’expression de l’ARNm de Nur77 induite par l’halopéridol, un antipsychotique de première génération. Nous avons observé que le 8-OH-DPAT et le MDL11939 préviennent partiellement l’induction de Nur77 dans le striatum. Au contraire, l’idazoxan potentialise l’effet de l’halopéridol sur l’expression de Nur77 alors que le prazosin reste sans effet. Ces résultats démontrent que l’expression striatale de Nur77 induite par l’halopéridol peut être modulée à la baisse avec un agoniste 5-HT1A ou un antagoniste 5-HT2A. Par la suite, nous avons évalué dans divers paradigmes expérimentaux l’effet de l’éticlopride, un antagoniste spécifique D2, afin d’explorer davantage le mécanisme de l’effet transcriptionnel des antagonistes D2. Étonnamment, la suppression de l’isoforme D2L chez la souris D2L KO ne réduit pas la réponse de l’éticlopride dans le striatum. Par contre, une lésion corticale avec l’acide iboténique bloque l’effet de l’éticlopride sur la transcription de Nur77, suggérant un rôle du glutamate. La combinaison d’un antagoniste des récepteurs métabotropes du glutamate de types 5 (mGluR5) et d’un antagoniste des récepteurs de l’adénosine A2A abolit complètement l’augmentation de la transcription de Nur77 induit par l’éticlopride dans le striatum. La modulation directe de l’expression striatale de Nur77 par les récepteurs mGluR5 et A2A a été confirmée dans un modèle de cultures organotypiques de tranches cérébrales. Ces résultats démontrent clairement que la modulation de l’expression génique dans le striatum, à la suite d’un traitement avec un antagoniste D2 pourrait être indépendante d’une interaction directe avec les récepteurs D2 post-synaptiques, et reposerait plutôt sur son interaction avec les récepteurs D2 hétérosynaptiques des afférences corticostriées et l’activation subséquente des récepteurs post-synaptiques du glutamate et de l’adénosine. En résumé, nos résultats suggèrent que l’interaction des antipsychotiques atypiques avec les récepteurs 5-HT2A et 5-HT1A pourrait expliquer la différence dans le patron d’expression génique induit par ces drogues en comparaison avec les antipsychotiques typiques. De plus, nos résultats révèlent un nouveau mécanisme d’action des antagonistes D2 et supportent un rôle primordial du glutamate et de l’adénosine dans les effets des antipsychotiques de première génération. / Antipsychotic drugs have been used to alleviate schizophrenia symptoms for more than 50 years. Despite extensive research, little is known about the molecular and cellular mechanism responsible for their clinical outcome. These drugs are usually recognized as dopamine D2 antagonists and are known to modulate gene expression in the striatum. In the present thesis, we used the expression of Nur77, a transcription factor of the orphan nuclear receptor family, to explore the role of dopamine, serotonin, glutamate and adenosine receptors in the effect of a dopamine D2 antagonist in the striatum. First, we examined the abilities of serotoninergic and adrenergic receptor drugs to modify the pattern of Nur77 mRNA expression induced by haloperidol, a first generation antipsychotic drug. We observed that 8-OH-DPAT and MDL11939 partially prevent haloperidol-induced Nur77 upregulation. On the contrary, idazoxan consistently potentiated haloperidol-induced Nur77 mRNA levels in the striatum whereas prazosin remained without effect. Taken together, these results show the ability of a 5-HT1A agonist or a 5-HT2A antagonist to reduce haloperidol-induced Nur77 striatal expression. Subsequently, we evaluated in different experimental designs the effect of eticlopride, a specific D2 antagonist, to provide additional information on the mechanism by which D2 antagonist controls transcriptional activity in the striatum. Surprisingly, deletion of the D2L receptor isoform did not reduce eticlopride-induced upregulation of Nur77 mRNA levels in the striatum. However, cortical lesions with ibotenic acid strongly reduced eticlopride-induced upregulation of Nur77 mRNA, suggesting a role for glutamate neurotransmission. A combination of a metabotropic glutamate type 5 (mGluR5) antagonist with an antagonist of its synergistic partner adenosine A2A receptor abolished eticlopride-induced upregulation of Nur77 mRNA levels in the striatum. Direct modulation of striatal Nur77 expression by glutamate and adenosine receptors was confirmed using corticostriatal organotypic cultures. Taken together, these results indicate that modulation of gene expression in the striatum, following a D2 antagonist, might not involve a direct interaction of the drug at postsynaptic D2 receptors, but rather relies on its interaction with corticostriatal presynaptic D2 receptors and subsequent activation of postsynaptic glutamate and adenosine receptors in the striatum. In summary, our results suggest that interaction of atypical antipsychotic drugs with 5-HT2A and 5-HT1A receptors participate in the differential pattern of gene expression induced by these drugs when compared with typical antipsychotic drugs. Moreover, our results uncover a new mechanism of action of D2 antagonists and support a prominent role of glutamate and adenosine in the effect of classic antipsychotic drugs.

Les antipsychotiques sont utilisés en clinique depuis plus de 50 ans pour pallier aux symptômes de la schizophrénie. Malgré une recherche intensive, les mécanismes cellulaires et moléculaires responsables de l’effet clinique de cette médication demeurent encore nébuleux. Ces drogues sont reconnues comme des antagonistes des récepteurs D2 de la dopamine et peuvent moduler la transcription génique dans le striatum. Au cours des recherches qui ont mené à l'écriture de cette thèse, nous avons exploré l’expression de Nur77, un facteur de transcription de la famille des récepteurs nucléaires, afin de caractériser le rôle de la dopamine, la sérotonine, l’adénosine et le glutamate dans la régulation génique contrôlée par les antagonistes D2. En premier lieu, nous avons examiné l’impact de la co-administration d’agents sérotonergiques et adrénergiques sur l’expression de l’ARNm de Nur77 induite par l’halopéridol, un antipsychotique de première génération. Nous avons observé que le 8-OH-DPAT et le MDL11939 préviennent partiellement l’induction de Nur77 dans le striatum. Au contraire, l’idazoxan potentialise l’effet de l’halopéridol sur l’expression de Nur77 alors que le prazosin reste sans effet. Ces résultats démontrent que l’expression striatale de Nur77 induite par l’halopéridol peut être modulée à la baisse avec un agoniste 5-HT1A ou un antagoniste 5-HT2A. Par la suite, nous avons évalué dans divers paradigmes expérimentaux l’effet de l’éticlopride, un antagoniste spécifique D2, afin d’explorer davantage le mécanisme de l’effet transcriptionnel des antagonistes D2. Étonnamment, la suppression de l’isoforme D2L chez la souris D2L KO ne réduit pas la réponse de l’éticlopride dans le striatum. Par contre, une lésion corticale avec l’acide iboténique bloque l’effet de l’éticlopride sur la transcription de Nur77, suggérant un rôle du glutamate. La combinaison d’un antagoniste des récepteurs métabotropes du glutamate de types 5 (mGluR5) et d’un antagoniste des récepteurs de l’adénosine A2A abolit complètement l’augmentation de la transcription de Nur77 induit par l’éticlopride dans le striatum. La modulation directe de l’expression striatale de Nur77 par les récepteurs mGluR5 et A2A a été confirmée dans un modèle de cultures organotypiques de tranches cérébrales. Ces résultats démontrent clairement que la modulation de l’expression génique dans le striatum, à la suite d’un traitement avec un antagoniste D2 pourrait être indépendante d’une interaction directe avec les récepteurs D2 post-synaptiques, et reposerait plutôt sur son interaction avec les récepteurs D2 hétérosynaptiques des afférences corticostriées et l’activation subséquente des récepteurs post-synaptiques du glutamate et de l’adénosine. En résumé, nos résultats suggèrent que l’interaction des antipsychotiques atypiques avec les récepteurs 5-HT2A et 5-HT1A pourrait expliquer la différence dans le patron d’expression génique induit par ces drogues en comparaison avec les antipsychotiques typiques. De plus, nos résultats révèlent un nouveau mécanisme d’action des antagonistes D2 et supportent un rôle primordial du glutamate et de l’adénosine dans les effets des antipsychotiques de première génération. / Antipsychotic drugs have been used to alleviate schizophrenia symptoms for more than 50 years. Despite extensive research, little is known about the molecular and cellular mechanism responsible for their clinical outcome. These drugs are usually recognized as dopamine D2 antagonists and are known to modulate gene expression in the striatum. In the present thesis, we used the expression of Nur77, a transcription factor of the orphan nuclear receptor family, to explore the role of dopamine, serotonin, glutamate and adenosine receptors in the effect of a dopamine D2 antagonist in the striatum. First, we examined the abilities of serotoninergic and adrenergic receptor drugs to modify the pattern of Nur77 mRNA expression induced by haloperidol, a first generation antipsychotic drug. We observed that 8-OH-DPAT and MDL11939 partially prevent haloperidol-induced Nur77 upregulation. On the contrary, idazoxan consistently potentiated haloperidol-induced Nur77 mRNA levels in the striatum whereas prazosin remained without effect. Taken together, these results show the ability of a 5-HT1A agonist or a 5-HT2A antagonist to reduce haloperidol-induced Nur77 striatal expression. Subsequently, we evaluated in different experimental designs the effect of eticlopride, a specific D2 antagonist, to provide additional information on the mechanism by which D2 antagonist controls transcriptional activity in the striatum. Surprisingly, deletion of the D2L receptor isoform did not reduce eticlopride-induced upregulation of Nur77 mRNA levels in the striatum. However, cortical lesions with ibotenic acid strongly reduced eticlopride-induced upregulation of Nur77 mRNA, suggesting a role for glutamate neurotransmission. A combination of a metabotropic glutamate type 5 (mGluR5) antagonist with an antagonist of its synergistic partner adenosine A2A receptor abolished eticlopride-induced upregulation of Nur77 mRNA levels in the striatum. Direct modulation of striatal Nur77 expression by glutamate and adenosine receptors was confirmed using corticostriatal organotypic cultures. Taken together, these results indicate that modulation of gene expression in the striatum, following a D2 antagonist, might not involve a direct interaction of the drug at postsynaptic D2 receptors, but rather relies on its interaction with corticostriatal presynaptic D2 receptors and subsequent activation of postsynaptic glutamate and adenosine receptors in the striatum. In summary, our results suggest that interaction of atypical antipsychotic drugs with 5-HT2A and 5-HT1A receptors participate in the differential pattern of gene expression induced by these drugs when compared with typical antipsychotic drugs. Moreover, our results uncover a new mechanism of action of D2 antagonists and support a prominent role of glutamate and adenosine in the effect of classic antipsychotic drugs.

One of the main difficulties of addiction treatment is the high risk of relapse even after a longabstinence and fully detoxification. Therefore, discovering the underlying molecular principlesof relapse is essential. The metabotropic glutamate receptor, mGluR5, is considered to beinvolved in this aspect. One of the brain structures expressing mGluR5 is the striatum, an areawith well-established role in addiction which is largely composed of medium-sized spinyneurons (MSNs). These neurons are basically divided into two major subpopulationscharacterized based on their projections and protein properties. It is known that the mGluR5receptor is expressed on both subpopulations of MSNs. Consequently, it can be used to establishthe proportional contribution of each of MSNs subpopulations in relapse to addiction. In ourconstellation, we have generated a mouse line designed to have a selective mGluR5 knock-downin one of these subpopulations – the dopamine D1 receptor (D1R) expressing neurons. It hashowever been unclear if the expression of the transgene is indeed limited to only D1R-expressingneurons. By immunofluorescence technique, I here show that the construct is expressed only inMSNs and is restricted to the D1R-expressing cell population in the striatum. Thus the transgenicmouse line is a good tool for the study of mGluR5 selectively in D1R expressing neurons.

Amyloid PET imaging with [11C]PIB enabled detection of Aβ for the first time in vivo. However, [11C]PIB is a small molecule that binds only the insoluble Aβ plaque. Rather, the soluble Aβ aggregates are considered the cause of Alzheimer’s disease (AD). As such, a more sensitive and specific PET tracer is needed for tracking longitudinal AD pathology. Soluble Aβ aggregates likely interact with the metabotropic glutamate receptor 5 (mGluR5) to cause neurotoxic effects. However, with [11C]ABP688 PET we were unable to detect aberrant mGluR5 binding in AD mouse models, although we find elevated mGluR5 protein levels with immunoblotting. Antibodies are highly specific large molecules that can bind specifically to soluble Aβ aggregates, thus they can be a good marker for AD pathology. Unfortunately, due to their large size they cannot cross the blood-brain barrier (BBB). However, it is possible to shuttle antibodies into the brain by taking advantage of endogenous transporter systems on the BBB. By creating bispecific antibodies binding both to soluble Aβ aggregates and to the transferrin receptor (BBB target), we successfully transported the antibody into the brain and could visually detect soluble Aβ aggregates with PET. Recombinant expression further improved and optimized antibody design, creating smaller bispecific antibody-based constructs that had better pharmacokinetic properties allowing for earlier PET scanning (1 day instead of 3), and more sensitive signal. Lastly, using TCO-tetrazine click chemistry, we indirectly labeled our antibodies with fluorine-18, and could successfully perform PET already 11 h post-injection with a fluorine-18 labeled antibody.

Dopamine (DA) is a modulatory neurotransmitter required for movement, learning, and reward. Several neuropsychiatric disorders exhibit DAergic dysfunction, including Parkinson’s disease (PD). The presynaptic DA transporter (DAT) constrains DAergic signaling via DA reuptake. Acute PKC activation drives DAT endocytosis, however, endogenous receptor-mediated DAT trafficking in striatal terminals remains ill-defined. Here, I present data supporting biphasic Gq-receptor-mediated DAT trafficking in striatum. Gq-receptor activation drives initial DAT insertion, which requires DA release, DAergic DRD2auto activation, and intact retromer. Subsequent DAT retrieval requires PKC and the neuronal GTPase Rit2. Furthermore, I demonstrate that the endogenous Gq-coupled metabotropic glutamate receptor, mGluR5, expressed on DAergic neurons exerts biphasic DAT regulation. DAergic mGluR5 silencing revealed that mGluR5 is required for motor learning and coordination. DAergic mGluR5 cKO motor deficits were rescued by DAT inhibition, suggesting mGluR5-mediated DAT trafficking is required for these behaviors. Apart from its requisite role in DAT trafficking, Rit2 is a PD associated risk allele. We previously demonstrated that Rit2 is required for psychostimulant response and generalized anxiety, but not basal locomotion. However, Rit2’s roles in more complex motor behaviors and PD pathology remain unknown. DAergic Rit2 silencing revealed that Rit2 is required for male motor learning and prolonged Rit2 suppression leads to progressive manifestation of PD biomarkers, coordination deficits, and decreased DAergic tone. Motor learning deficits were rescued by boosting DA availability, echoing Rit2-mediated hypodopaminergia. Together these results identify receptor-mediated DAT trafficking mechanisms in DA terminals, demonstrate that DAT surface dynamics are required for motor function, and implicate DAergic Rit2 loss in progressive PD-like phenotypes.