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Atividade imunomoduladora de Lactobacillus rhamnosus em macrófagos de camundongos estimulados com Lipopolisacarídeo, Ácido Lipoteicóico e manana /

Oliveira, Felipe Eduardo de. January 2013 (has links)
Orientador: Luciane Dias de Oliveira / Co-orientador: Mariella Vieira Pereira Leão / Banca: Antônio Olavo Cardoso Jorge / Banca: Célia Regina Gonçalves e Silva / Resumo: Os probióticos são capazes de equilibrar a microbiota residente e modular a resposta imune aos diferentes estímulos microbianos, entretanto, seus efeitos imunomoduladores ainda não estão claramente elucidados. O presente estudo avaliou o efeito imunomodulador de Lactobacillus rhamnosus ou seus produtos sobre macrófagos (RAW 264.7) ativados por lipopolissacarídeo (LPS), ácido lipoteicóico (LTA) ou manana, pela análise da produção de citocinas pró e anti-inflamatórias (TNF-α, IL-1 β, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12). Foi utilizada a cepa padrão de L. rhamnosus ATCC 7469, semeada em Ágar Man-Rogosa-Shape (MRS) e cultivada a 37ºC/5% CO2 por 24 h. Foram empregadas três diferentes preparações de probióticos: 1) L. rhamnosus vivo (LV) na concentração de 2,5 x 107 células/mL; 2) L. rhamnosus morto (LM) obtido por autoclavagem da preparação anterior a 121°C/15 min; 3) Sobrenadante da suspensão de L. rhamnosus (SL), resultante da centrifugação da suspensão LM a 8300 xg/10min. Foram utilizados macrófagos de camundongos (RAW 264.7), cultivados em meio DMEM completo (suplementado com 10% de soro fetal bovino) foram distribuídos em microplacas de poliestireno na concentração de 5 x 105 células viáveis/poço/mL de meio DMEM completo. Após 24 h de incubação (37°C/5% CO2) para adesão celular, as placas foram lavadas com PBS estéril e apirogênico e as células foram estimuladas com LPS de Escherichia coli, LTA de Streptococcus faecalis ou manana de Saccharomyces cerevisiae na concentração de 1 μg/mL, na presença ou ausência das diferentes preparações dos probióticos por 2,5h. Em seguida as placas foram lavadas com PBS, tiveram seu meio trocado e foram incubadas por 16h (37°C/5% CO2). Os sobrenadantes das culturas foram coletados para a detecção e quantificação das citocinas (TNF-α, IL-1β, IL-4, IL-6, IL-10 e IL-12) pelo método imunoenzimático ELISA. Os .... / Abstract: Probiotics are able to balance the resident microbiota and modulate the immune response to different microbial stimuli, however its immunomodulatory effects are not clearly understood. This study intends to evaluate the immunomodulatory effect of Lactobacillus rhamnosus or its products on macrophages (RAW 264.7) activated by lipopolysaccharide (LPS), lipoteicoic acid (LTA) or mannan through the analysis of the production of pro and anti-inflammatory cytokines (TNF-α, IL-1 β, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12). It was used the standard strain of L. rhamnosus ATCC 7469, seeded on Agar Man-Rogosa-Shape (MRS) and grown at 37°C/5% CO2 for 24 h. Three different preparations of probiotics were prepared: 1) L. rhamnosus solution at a concentration of 5 x 107 cells/mL; 2) Heat-killed L. rhamnosus, obtained by autoclaving previous preparation at 121°C/15 min, 3) Supernatant of L. rhamnosus suspension, obtained through centrifugation of the suspension with heat-killed probiotic at 8300 xg/10 min. Mouse macrophages (RAW 264.7) grown in complete DMEM medium (supplemented with 10% fetal bovine serum) were distributed in polystyrene microplates at a concentration of 1 x 106 viable cells/well/ml complete DMEM medium. After 24 h incubation (37°C/5% CO2) for cell adhesion, plates were washed with sterile-apirogenic physiologic saline and cells were stimulated with Escherichia coli LPS, Enterococcus faecalis LTA or Saccharomyces cerevisiae mannan at a concentration of 1 μg/mL, in the presence or absence of the different preparations of probiotics at the same time for 2,5 h. Then the plates were washed, had its medium traded and were incubated for 16 h (37°C/5% CO2). Culture supernatants were 14 collected for the detection and quantification of cytokines (TNF-α, IL-1β, IL-4, IL-6, IL-10 and IL-12) by ELISA immunoenzymatic method. The results were statistically analyzed by ANOVA and Tukey tests (p≤0,05). With ... / Mestre
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Caracterização da ação modulatória de citocinas inflamatórias pelo óleo de Melaleuca alternifolia e seus componentes (terpinen-4ol e alfa-terpineol) em macrófagos humanos ativados lipopolissacarídeos de Porphyromonas gingivalis e Escherichia coli /

Nogueira, Marianne Nicole Marques. January 2013 (has links)
Orientador: Denise Madalena Palomari Spolidorio / Coorientador: Carlos Rossa Junior / Banca: Flavia Sammartino Mariano Rodrigues / Banca: Juliana Rico Pires / Banca: Raquel Mantuaneli Scarel Caminaga / Banca: Joni Augusto Cirelli / Resumo: O óleo de Melaleuca alternifolia (TTO) tem propriedades antimicrobianas e somado a isso, sugere-se que apresente características anti-inflamatórias. Este estudo investigou o potencial do TTO e seus componentes (terpinen-4-ol e alfa-terpineol) em modular citocinas e os mecanismos intracelulares participantes desta ação. Células monocíticas (U937) foram diferenciados em macrófagos com 40ng/mL de 12-miristato 13-acetato de forbol. A citotoxicidade dos óleos foi determinada com o ensaio de redução de Metil-tetrazolium (MTT). A habilidade em modular a produção das citocinas após o estímulo com LPS de Porphyromonas gingivalis (agonista de TLR2) e Escherichia coli (agonista de TLR4), foi estabelecida por meio de ensaios ELISA. Os efeitos dos compostos testados, na ativação de vias de sinalização intracelular, foram avaliados por western blot. As concentrações selecionadas pelo MTT foram: 0,015% e 0,004% para o TTO, 0,059% e 0,0073% para o terpinen-4-ol e 0,0064% e 0,0007% para alfa-terpineol. A influência do TTO na produção de citocinas foi mais marcante após estímulo de TLR4, com diminuição de IL-1β, IL-6 e IL-10. O terpinen-4-ol reduziu a produção de INF-γ, IL-1β, IL-6, IL-4, IL-10 e IL-17 após ativação tanto TLR4 quanto TLR2. O alfa-terpienol atua após ativação de TLR2 e 4 inibindo a produção de IL-1β, IL-6 e IL-10. Nenhuma das vias analisadas (NF-kB, ERK, p38 MAP-Kinase) sofreram interferência dos óleos. O TTO tem ação 8 modulatória inibindo produção de citocinas inflamatórias e o terpinen-4-ol é o seu maior componente ativo, entretanto este mecanismo não ocorre via inibição de NF-kB, ERK e p38 MAP-Kinase / Abstract: The oil of Melaleuca alternifolia (TTO) has antimicrobial properties, coupled with this, it is suggested that it also has antiinflammatory characteristics. This study investigated the potential of TTO and its components (terpinen-4-ol and alpha-terpineol) and cytokines in modulating the intracellular mechanisms that participate in this action. Monocytic cells (U937) were differentiated into macrophages with 40ng/mL 12-myristate 13-acetate phorbol. The olil cytotoxicity was determined with the reduction assay Methyl-tetrazolium (MTT). The ability to modulate cytokine production after stimulation with LPS of Porphyromonasgingivalis (TLR2 agonist) and Escherichia coli (TLR4 agonist), was established by ELISA assays. The effects of the tested compounds, the activation of intracellular signaling pathways were evaluated by western blot. The concentrations selected by the MTT were 0.015% and 0.004% for the TTO, 0.059% and 0.0073% to terpinen-4-ol and 0.0064% and 0.0007% for alpha-terpineol. The influence of TTO in cytokine production was more marked after TLR4 stimulation, with decreased IL-1β, IL-6 and IL-10. The terpinen-4-ol reduced the production of INF-γ, IL-1β, IL-6, IL-4, IL-10 and IL-17 activation after both TLR4 as TLR2. The alpha-terpienol acts upon activation of TLR2 and four inhibiting the production of IL-1β, IL-6 and IL-10. None of the analyzed pathways (NF-kB, ERK, p38 MAP-Kinase) suffered interference oils. The TTO has modulatory action by 10 inhibiting the production of inflammatory cytokines and terpinen-4-ol is your greatest asset component however, this mechanism does not occur via inhibition of NF-kB, ERK and p38 MAP-kinase / Doutor
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Influência do tratamento com inibidores da protease do Vírus da Imunodeficiência Humana sobre funções dos macrófagos peritoneais murinos incubados in vitro com Leishmania (L.) amazonensis

Alves, Érica Alessandra Rocha 19 December 2013 (has links)
Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2013. / Submitted by Diego Araújo Campos (diegoa@bce.unb.br) on 2014-05-29T16:09:51Z No. of bitstreams: 1 2013_ÉricaAlessandraRochaAlves.pdf: 2385299 bytes, checksum: 03bdd9a5cec34798dfe49b99c553f60e (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-05-29T16:19:46Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_ÉricaAlessandraRochaAlves.pdf: 2385299 bytes, checksum: 03bdd9a5cec34798dfe49b99c553f60e (MD5) / Made available in DSpace on 2014-05-29T16:19:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_ÉricaAlessandraRochaAlves.pdf: 2385299 bytes, checksum: 03bdd9a5cec34798dfe49b99c553f60e (MD5) / Alguns estudos têm demonstrado que os inibidores da protease do VIH modulam várias funções do sistema imunitário, porém não se sabe ainda se estes medicamentos podem modificar a resposta de defesa contra as leishmânias. Portanto, o objetivo deste trabalho foi avaliar a influência do tratamento com os inibidores da protease do VIH lopinavir/ritonavir e atazanavir sobre funções dos macrófagos durante as primeiras horas de interação com as leishmânias. Utilizamos macrófagos peritoneais de camundongos BALB/c, tratados por 10 dias, por via oral, com lopinavir/ritonavir (200/50 mg/Kg) e atazanavir (90 mg/Kg), que foram infectados ou não in vitro com um menor (proporção 2:1) e um maior número (proporção 10:1) de promastigotas de L. (L.) amazonensis e que denominamos condições subótimas e ótimas, respectivamente. Analisamos o efeito desses medicamentos sobre o índice de infecção, a capacidade de aderência, a viabilidade dos macrófagos, a viabilidade das leishmânias, a produção de moléculas microbicidas, a produção de citocinas, a expressão de corpúsculos lipídicos, e parte das vias de sinalização intracelular do NF-B e PPAR-. O índice de infecção e o número de macrófagos aderentes foram avaliados por microscopia ótica, após coloração com Giemsa 10%. O percentual de macrófagos viáveis foi analisado por microscopia de fluorescência, após coloração com laranja de acridina (5 mg/mL). A viabilidade dos parasitos foi estimada contando-se, em câmara de Neubauer, o número de parasitos que proliferaram a partir das amastigotas recuperadas dos macrófagos infectados. A produção de óxido nítrico (NO) e peróxido de hidrogênio (H2O2) foi determinada pelos métodos de Griess e Pick, respectivamente. A produção das citocinas IL-1, IL-6, IL-12p70, TNF-α e IL-10 foi analisada pela técnica de ELISA. A influência dos medicamentos sobre a expressão dos corpúsculos lipídicos foi analisada tanto por microscopia ótica, após coloração com Oil Red O, quanto por microscopia confocal, após coloração com Bodipy e as vias do NF-B e PPAR- foram investigadas por microscopia confocal e quantificadas utilizando o software ImageJ. O número de células recuperadas da cavidade peritoneal dos camundongos BALB/c tratados com LPV/RTV (p=0,003) e ATV (p=0,003) foi menor do que o número recuperado dos animais que foram tratados com salina. O índice de infecção dos macrófagos dos camundongos tratados com LPV/RTV foi maior do que o dos macrófagos dos animais tratados com salina, tanto quando as células foram incubadas com um menor número de parasitos (p=0,0005) como quando foram incubadas com um maior número de leishmânias (p=0,004). Em ambos os casos, esse aumento foi ocasionado por uma elevação do percentual de macrófagos infectados por L. (L.) amazonensis (p<0,05), porém quando a infecção foi feita com um menor número de parasitos, também deveu-se a uma elevação do número médio de L.(L.) amazonensis interiorizada por macrófago (p=0,004). Diferentemente, o índice de infecção dos macrófagos dos camundongos tratados com ATV somente foi maior do que o dos macrófagos dos animais tratados com salina quando as células foram incubadas com um menor número de leishmânias (p=0,04) e esse aumento foi ocasionado por uma elevação do percentual de células infectadas por L. (L.) amazonensis (p=0,02). Quando as células foram incubadas com um maior número de parasitos, ambos os medicamentos não influenciaram a viabilidade dos macrófagos, bem como sua capacidade de aderência ao vidro, entretanto tanto o LPV/RTV quanto o ATV aumentaram a capacidade de aderência dos macrófagos que foram incubados com um menor número de leishmânias (p=0,02). Um maior número de parasitos proliferaram a partir dos macrófagos dos animais tratados com LPV/RTV e ATV em todos os dias analisados, sendo que no terceiro dia de cultivo, foram recuperadas 45,1% (p=0,001) e 56,4% (p=0,001) mais promastigotas/mL a partir dos macrófagos dos animais tratados com antiretrovirais do que daqueles provenientes dos animais tratados com salina. Os antiretrovirais não influenciaram a produção de H2O2 pelos macrófagos. Quando os macrófagos foram incubados com um menor número de parasitos, a infecção com pelas leishmânias deprimiu a produção do NO (p=0,054), entretanto o tratamento com LPV/RTV (p=0,03) aumentou a produção desse reativo de nitrogênio pelos macrófagos incubados com leishmânias em relação aos macrófagos dos animais que foram tratados com salina. Ambos os medicamentos não interferiram na produção de IL-23, IL-6 e na expressão dos corpúsculos lipídicos pelos macrófagos incubados ou não com as leishmânias. A infecção dos macrófagos pela incubação com um maior número de parasitos deprimiu a produção de IL-12p70 pelos macrófagos dos camundongos tratados com ATV (p=0,058). A incubação dos macrófagos com um maior número de parasitos acarretou uma diminuição da produção do TNF-α pelos macrófagos dos camundongos tratados com salina (p=0,047). O tratamento com ATV deprimiu a produção de TNF-α pelos macrófagos (p<0,0001), entretanto houve um aumento da produção do TNF-α após incubação in vitro com as leishmânias (p=0,025), porém, sem ultrapassar os níveis máximos observados nos animais não tratados. Ambos os tratamentos reduziram a produção de IL-10 pelas células que foram incubadas apenas com o meio de cultura (p=0,01), e essa produção se manteve baixa mesmo quando os macrófagos foram incubados com um maior número de leishmânias. O tratamento com o ATV estimulou a translocação do NF-B p65 do citoplasma para os núcleos dos macrófagos incubados apenas com o meio de cultura e favoreceu a translocação mais precoce desse fator de transcrição para os núcleos dos macrófagos incubados com um menor número de parasitos. A infecção com um maior número de leishmânias diminuiu a translocação do NF-B RelB do citoplasma para os núcleos dos macrófagos nos animais tratados com o LPV/RTV (p=0,0001) e ainda a expressão citoplasmática do NF-B RelB nos animais tratados com o atazanavir (p=0,0003). A infecção dos macrófagos com uma maior número de leishmânias aumentou a expressão citoplasmática do PPAR- nos animais tratados com ATV (p=0,02), sem modificar a translocação do PPAR- do citoplasma para os núcleos dos macrófagos. Os nossos resultados mostraram que os inibidores da protease do VIH influenciaram diversos mecanismos de defesa inato que são importantes para a imunidade e imunopatogenia das leishmanioses. Embora esses medicamentos sejam altamente efetivos para controlar a replicação do Vírus da Imunodeficiência Humana, é possível que essas drogas possam influenciar o curso clínico das leishmanioses nos indivíduos coinfectados pelo VIH e Leishmania. ___________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Some studies have shown that HIV protease inhibitors modulate many functions of the immune system, but it is unknown whether these drugs may influence the defense response against Leishmania. Therefore, the aim of this research was to evaluate the influence of the treatment with the HIV protease inhibitors lopinavir/ritonavir and atazanavir on macrophage functions during its first interaction with Leishmania. We used peritoneal macrophages from BALB/c mice treated orally, for 10 days, with lopinavir/ritonavir (200/50 mg / kg) and atazanavir (90 mg/kg ), which were infected or not in vitro with a low (2:1) or high (10:1) amount of promastigotes of L. ( L. ) amazonensis. We analyzed the effect of these drugs on infection index, viability of macrophages, adhesion capacity, viability of Leishmania, production of microbicidal molecules and cytokines production, expression of lipid bodies and NFB and PPAR- intracellular signaling pathways. The infection index and the number of adherent macrophages were evaluated by light microscopy after staining with 10% Giemsa solution. The percentage of viable macrophages were assessed by fluorescence microscopy after staining with acridine orange (5 mg/mL). The viability of the parasites was determined by counting the number of parasites that proliferated in culture after recovered from infected macrophages using a Neubauer chamber. The production of nitric oxide (NO) and hydrogen peroxide (H2O2) was determined by Griess and Pick methods, respectively. The production of IL-1 , IL-6 , IL-12p70, TNF-α and IL-10 was assessed by ELISA. The influence of the drugs on the NF-B and PPAR- signaling pathways was investigated by confocal microscopy, whereas the expression of lipid bodies was studied by optical microscopy, after staining with Oil Red, and by confocal microscopy, after staining with Bodipy. The number of cells recovered from peritoneal cavity of LPV/RTV treated-BALB/c mice (p=0.003) and ATV-treated-BALB/c mice (p=0.003) was lower than the number recovered from animals treated with saline. The infection index of macrophages from LPV/RTV-treated animals was higher than that of macrophages from saline-treated animals, both when cells were incubated with a low amount of parasites (p=0.0005) as when they were incubated with a high amount of Leishmania (p=0.004). In both cases, this elevation was due to an increase in the percentage of macrophages infected by L. (L.) amazonensis (p<0.05), but when infection was performed with a low amount of parasites, was also due to the increase in the average number of L. (L.) amazonensis by macrophage (p=0.004). Differently, the infection index of macrophages from ATV-treated mice was only higher than that of macrophages from animals treated with saline when cells were incubated with a high amount of Leishmania (p=0.04), and this elevation was due to the increase of the percentage of macrophages infected by L. (L.) amazonensis (p=0.02). When cells were incubated with a high amount of parasites, no treatment influenced the viability of macrophages as well as their abilities to adhere to glass slides, however LPV/RTV and ATV increased adhesion capacity of macrophages when they were incubated with a low amount of parasites (p=0.02). An increased number of Leishmania proliferated after recovered from macrophages of mice treated with antiretrovirals, and on third day in culture, 45.1% (p=0.001) and 56.4% (p=0.001) more promastigotes/mL were recovered from macrophages of LPV/RTV- and ATV- treated mice than from saline-treated mice. Both drugs did not influence H2O2 production by macrophages. Leishmania infection decreased NO production by macrophages treated with saline (p=0.054), however, when macrophages were incubated with a low amount of parasites, the NO production by macrophages from LPV/RTV-treated mice (p=0.03) was higher than the NO production by macrophages from saline-treated mice. Both drugs did not influence the production of IL-23, IL-6 and the expression of lipid bodies by macrophages incubated with or without Leishmania. The infection of macrophages with a high amount of parasites decreased the IL- 12p70 production by macrophages from ATV-treated mice (P=0.058). The infection of macrophages with a high amount of parasites decreased TNF-α production by macrophages from saline-treated mice (P=0.047). The ATV treatment decreased the production of TNF-α by macrophages (p<0.0001), however, there was an increased production of TNF-α after incubation in vitro with a high amount of Leishmania (p=0.025), however, without exceeding the TNF-α levels observed in macrophages from untreated animals. Both treatments reduced the production of IL-10 when cells were incubated only with culture medium (p=0.01) that remained low even when macrophages were incubated with a high amount of Leishmania. The treatment with ATV stimulated NF-B p65 nuclear translocation when macrophages were incubated in medium and favored an earlier nuclear translocation of this transcription factor when macrophages were incubated with a low amount of parasites. Infection with a high amount of parasites decreased the nuclear translocation of NF- RelB B in macrophages recovered from LPV/RTV-treated animals (p=0.0001) and also the cytoplasmic expression of NF-B RelB when macrophages were recovered from atazanavir-treated animals (p=0.0003). Infection of macrophages with a high amount of Leishmania increased cytoplasmic expression of PPAR- when macrophages were derived from ATV treated-mice (p=0.02), without changing the cytoplasm-to-nucleus PPAR- translocation in macrophages. Our results showed that HIV protease inhibitors were able to influence the innate defense mechanisms, which are important for immunity and immunopathogenesis of leishmaniasis. Although these drugs are highly effective in controlling the HIV replication, it is possible that they may influence the clinical course of leishmaniasis in individuals HIV and Leishmania coinfected.
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Produção de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio e índice de infecção por macrófagos peritoneais de camundongos suscetíveis ou resistentes à leishmaniose infectados in vitro com Leishmania amazonensis

Miranda, Marthina Gomes de 10 July 2012 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Pós-graduação em Patologia Molecular, 2012. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2012-09-25T15:49:45Z No. of bitstreams: 1 2012_MarthinaGomesMiranda.pdf: 2033955 bytes, checksum: efb3978c46cb7852b5438193e339efaf (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2012-10-02T11:12:24Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_MarthinaGomesMiranda.pdf: 2033955 bytes, checksum: efb3978c46cb7852b5438193e339efaf (MD5) / Made available in DSpace on 2012-10-02T11:12:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_MarthinaGomesMiranda.pdf: 2033955 bytes, checksum: efb3978c46cb7852b5438193e339efaf (MD5) / A leishmaniose é endêmica em várias partes do mundo, e ainda nos dias atuais a doença permanece um sério problema de saúde pública. A doença tem diferentes formas clínicas, afeta cerca de 12 milhões de pessoas no mundo com um aumento de 1,5 a 2 milhões de novos casos ao ano. A Leishmania amazonensis é uma das espécies causadora da leishmaniose tegumentar americana que pode manifestar a forma cutânea ou difusa dependendo do estado imunológico do indivíduo. A imunidade inata participa da defesa inicial contra o parasita e pode determinar a evolução da doença. Camundongos da linhagem BALB/c são suscetíveis à infecção pela leishmânia desenvolvendo uma forma disseminada que evolui para morte, enquanto que camundongos C57BL/6 possuem características de resistência parcial, desenvolvem lesão, porém exercem controle sobre o crescimento do parasito, evoluindo para a cura. O objetivo deste trabalho foi avaliar a resposta imune inata dos macrófagos de camundongos suscetíveis e resistentes nas primeiras 24 h de contato do parasita com o fagócito. De 14 camundongos BALB/c e C57BL/6 foram obtidos macrófagos peritoneias para análise do índice de infecção, da capacidade microbicida dos macrófagos dos dois modelos e capacidade de produção de óxido nítrico e peróxido de hidrogênio na presença ou ausência da Leishmania amazonensis. Não houve diferença no índice de infecção dos macrófagos dos camundongos dos dois modelos estudados. A capacidade microbicida dos macrófagos obtidos dos camundongos resistentes foi mais efetiva do que a dos macrófagos dos camundongos suscetíveis, sendo que observamos um retardo e um menor crescimento em cultura dos parasitos recuperados dos macrófagos dos animais resistentes, que foram estatisticamente significantes a partir do quarto dia de acompanhamento. Ocorreu produção inicial de óxido nítrico pelos macrófagos peritoneais dos camundongos suscetíveis à infecção na presença de L. amazonensis, entretanto, estes animais não conseguiram manter a produção deste radical após 24 h em cultura, ocorrendo uma modulação negativa da produção deste radical na presença da leishmânia. Enquanto a produção do NO pelos macrófagos dos animais resistentes aumentou progressivamente e manteve-se 24 horas após. A produção do peróxido de hidrogênio pelos macrófagos peritoneais dos camundongos C57BL/6 foi maior do que o dos camundongos BALB/c mesmo quando infectados com L. amazonensis. Concluímos que a interação da Leishmania amazonensis com os macrófagos modulou negativamente a produção de óxido nítrico em camundongos suscetíveis, mas não nos camundongos resistentes. Os macrófagos dos camundongos C57BL/6, resistentes à leishmânia, foram capazes de eliminar o parasito mais eficientemente do que os macrófagos da linhagem suscetível BALB/c. A produção precoce mais elevada de H2O2 e a capacidade de manter a resposta de NO por tempo mais prolongado parecem ter sido fatores importantes para a resposta de suscetibilidade ou resistência a Leishmania amazonensis. Nossos dados, portanto, contribuíram para esclarecer alguns mecanismos iniciais envolvidos nas respostas de suscetibilidade ou resistência à infecção pela Leishmania amazonensis. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Leishmaniasis is endemic in several parts of the world and still remains an important healthy problem. The disease affects about 12 million people worldwide, with an increase of 1.5 to 2 million new cases by year. There are different clinical forms of the disease depending on the host, parasite species, and immunological response to infection. The innate immunity response is responsible by the initial defense against the parasite and may determine the evolution of the disease. BALB/c mice are susceptible to Leishmania infection and show disseminated disease that progress to death, whereas C57BL/6 mice show partial resistance to the disease, develop lesions, but control the growth of the parasite evolving to healing. This work aimed to evaluate the innate immune response of macrophages from susceptible or resistant mice during the first 24h in culture. The macrophage infection rate, the microbicidal activity of macrophages, and the nitric oxide and hydrogen peroxide production by macrophages of 14 BALB/c and 14 C57BL/6 mice were in vitro assessed in presence or absence of Leishmania amazonensis. There was no difference in macrophage infection rate by Leishmania between both models evaluated. The microbicidal capacity of macrophages from resistant mice was more effective than that of macrophages from susceptible animals, which showed statistical difference in the fourth day. Enhanced nitric oxide production by peritoneal macrophages from BALB/c susceptible mice stimulated with L. amazonensis occurred at the beginning of the incubation, but there was a decrease in production after that, showing a downmodulation of nitric oxide production by Leishmania in this mouse model. However, differently, the nitric oxide production by C57BL/6 resistant mice gradually increased until 24 h. The hydrogen peroxide production by peritoneal macrophages from C57BL/6 mice was higher than that of BALB/c mice when infected with L. amazonensis. We conclude that the interaction of macrophages with Leishmania amazonensis dowmodulates nitric oxide production in susceptible but not in resistant mice. Furthermore, macrophages from C57BL6 mice resistant to Leishmania were able to eliminate the parasite more efficiently than macrophages from the susceptible strain BALB/c. The higher early production of H2O2 and the capacity to maintain NO production for a longer period appear to be important factors in the response of susceptibility or resistance to Leishmania amazonensis. Our data therefore may clarify some mechanisms involved in the initial responses of susceptibility or resistance to Leishmania amazonensis infection.
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Riqueza e densidade de macroinvertebrados aquáticos associados às macrófitas aquáticas nos lagos de várzea Janauacá (AM) e grande de Curuai (PA) da Amazonia central brasileira

Salcedo, Ana Karina Moreyra 16 February 2011 (has links)
Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Ecologia, Programa de Pós-Graduação em Ecologia, 2011 / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2013-05-23T12:55:48Z No. of bitstreams: 1 2011_AnaKarinaMoreyraSalcedo.pdf: 5976486 bytes, checksum: 4222f76f6fc88d24a997cf0a655407c6 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-05-23T14:33:06Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_AnaKarinaMoreyraSalcedo.pdf: 5976486 bytes, checksum: 4222f76f6fc88d24a997cf0a655407c6 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-05-23T14:33:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_AnaKarinaMoreyraSalcedo.pdf: 5976486 bytes, checksum: 4222f76f6fc88d24a997cf0a655407c6 (MD5) / As planícies de inundação do rio Amazonas são hábitats para as mais diversas comunidades de macrófitas aquáticas e os macroinvertebrados destacam-se como um dos principais constituintes da sua fauna associada. O objetivo do presente trabalho foi caracterizar as comunidades de macroinvertebrados aquáticos associadas às macrófitas herbáceas em termos de densidade e riqueza de grupos taxonômicos e grupos funcionais tróficos em lagos de várzea da Amazônia Central. O estudo foi realizado no lago Janauacá proximo à cidade de Manaus (AM) e no lago Grande de Curuai próximo à cidade de Santarém (PA). Estes lagos recebem influencia direta do Rio Solimões e Amazonas, respetivamente. O estudo foi conduzido no período de cheia de 2008 e 2009. Foram realizadas as amostragens de macroinvertebrados com auxilio de um amostrador circular com rede de 250 µm de malha em estandes de macrofitas com dominância de plantas herbáceas na região litorânea dos lagos e também, medições de superfície de parâmetros físico-quimicos da água em ambos lagos e no rio Solimões e Amazonas. Os resultados obtidos em 2008 na comparação dos lagos Janauacá e Curuai apresentaram diferença siginificativa para as concentrações de calcio, potássio, carbonato, sulfato e cloro. Não foram observadas diferenças significativas para as demais variáveis. No lago Janauacá em comparação com o rio Solimões houve menor concentração média de Ca2+ e HCO3- e a condutividade elétrica também foi 66% menor. Na várzea do lago Grande de Curuai, para o mesmo período de estudo, os valores médios obtidos das variáveis físico-quimicas foram similares aos obtidos no rio Amazonas. Em períodos de cheia a maior conectividade da várzea do lago Curuai com o rio Amazonas através dos diversos igarapés e canais contribui à maior semelhança nas características físico-químicas da suas águas. Estudos da estimativa de riqueza de táxons da comunidade de macroinvertebrados aquáticos mostraram que os estandes de macrofitas aquáticas com predominância de plantas herbáceas do tipo não gramíneas detêm uma maior riqueza de táxons de macroinvertebrados associados. Os resultados da riqueza e densidade de macroinvertebrados sob o ponto de vista dos grupos funcionais tróficos deram maior informação sobre as composições dos grupos tróficas nos diferentes estandes de macrófitas dominadas por gramíneas e não gramíneas onde o GFT predador e raspador apresentaram as maiores diferenças em termo de representatividade relativa (%). _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The floodplains of Amazon River are habitat for diverse communities of aquatic macrophyte macroinvertebrates stand out as a mean constituent of its fauna. The aim of this study was to characterize the macroinvertebrates associated with macrophytes in terms of density and richness of taxonomic groups and trophic functional groups in floodplain lakes of Central Amazon. The study was carried out in Janauacá lake, near to Manaus city(AM) and Grande de Curuai lake near to Santarém city (PA). These lakes receive direct influence of the Solimões and Amazon river, respectively. The study was conducted during flooded period in 2008 and 2009. Macroinvertebrates were collected with net-sampling with 0,07 m² area and 250 mm in mesh in stands of macrophytes with dominance of herbaceous plants in the littoral region of lakes and also surface measurements of physical-chemical parameters in both lakes and Solimões and Amazonas river were collected. Janauacá and Curuai lakes had significant differences in the concentrations of calcium, potassium, carbonate, sulfate and chloride. There were no significant differences for other variables. In Janauacá lake compared with the Solimões River there was a lower mean concentration of Ca2+ and HCO3-and electrical conductivity was also 66% lower in the lake. Physico-chemical variables were similar in Grande de Curuai Lake and Amazon River. In periods of full connectivity of this lake with the Amazon River by channels and streams contributes to the greater similarity in the physicochemical characteristics of its waters. Estimate richness of aquatic macroinvertebrates taxa showed that the stands of macrophytes with a predominance of herbaceous plants “non grasses” have abundance of macroinvertebrates taxa associated. The results of macroinvertebrate richness and density from the point of view of functional trophic groups gave more information on the composition of trophic groups in different macrophyte stands dominated by herbaceous “grass” type and herbaceous “no grass” type. Funcional trophic groups predator and scraper showed the greatest differences in terms of relative representativeness (%).
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Avaliação da capacidade fagocitária, produção de peróxido de hidrogênio e fator de necrose tumoral por monócitos de pacientes com leishmaniose tegumentar americana

Papa, Marianna Carminatti Martins January 2007 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2007. / Submitted by Kathryn Cardim Araujo (kathryn.cardim@gmail.com) on 2009-12-10T16:07:08Z No. of bitstreams: 1 2007_MariannaCarminattiMartinsPapa.PDF: 316803 bytes, checksum: d82df5e83e6990e312f5a5e758fafa82 (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2010-01-08T00:02:55Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2007_MariannaCarminattiMartinsPapa.PDF: 316803 bytes, checksum: d82df5e83e6990e312f5a5e758fafa82 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-01-08T00:02:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2007_MariannaCarminattiMartinsPapa.PDF: 316803 bytes, checksum: d82df5e83e6990e312f5a5e758fafa82 (MD5) Previous issue date: 2007 / A leishmaniose é endêmica em 88 paises e é estimado que mais de 12 milhões de indivíduos são infectados pelas várias espécies do parasita, ocorrendo aproximadamente 1,5 a 2 milhões de casos clínicos por ano da doença no mundo. Os macrófagos são importantes na defesa contra a doença, pela fagocitose e os mecanismos microbicidas intracelulares. Este trabalho teve como objetivo avaliar a capacidade fagocitária, a capacidade de produção de peróxido de hidrogênio e a capacidade de produção de fator de necrose tumoral- pelos monócitos de indivíduos com leishmaniose tegumentar americana. A capacidade fagocitária foi avaliada em 18 indivíduos com leishmaniose e 15 indivíduos controles normais utilizando-se Saccharomyces cerevisiae, pelos receptores que reconhecem padrões moleculares de patógenos e pelos receptores que reconhecem opsoninas. A produção de peróxido de hidrogênio foi avaliada pela técnica de oxidação do vermelho fenol na presença de peroxidase, e a avaliação da produção de fator de necrose tumoral- foi realizada pela técnica de ELISA no sobrenadante das culturas dos monócitos. A capacidade fagocitária dos monócitos dos indivíduos com leishmaniose tegumentar americana foi menor do que a dos indivíduos normais, tanto pelos receptores que reconhecem padrões moleculares de patógenos quanto pelos receptores para opsoninas. A menor capacidade fagocitária deveu-se ao menor envolvimento de macrófagos na fagocitose, não havendo alteração no número médio de leveduras fagocitadas, para a fagocitose testada por ambos os tipos de receptores. A produção de peróxido de hidrogênio pelos monócitos dos indivíduos com LTA foi maior do que a do grupo controle, tanto basal quanto após estímulo com LPS e PMA. A produção de fator de necrose tumoral- também foi maior nos indivíduos com leishmaniose. Nossos dados mostraram pela primeira vez que a capacidade fagocitária dos monócitos de indivíduos com LTA é menor do que a dos indivíduos normais, embora a produção de substâncias microbicidas, como radicais de oxigênio e FNT- foi maior do que os valores dos indivíduos normais. É possível que estas alterações das funções dos fagócitos tenham repercussões tanto nos mecanismos de defesa antiparasitária quanto nos mecanismos de imunopatogenia da doença. ____________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Leishmaniasis threatens 350 million people in 88 countries and remains a serious public health problem in several parts of the world with more than 12 million infected individuals by some species of the parasite, and about 1,5 million clinical cases by year. Macrophages are important in defense against parasite through phagocytosis and microbicidal mechanisms. This work aimed to evaluate the phagocytosis, hydrogen peroxide and TNF- production by monocytes from leishmaniasis individuals. Phagocytosis was assessed in 18 infected individuals and 15 normal control using Saccharomyces cerevisiae, through pattern recognition receptors and opsonin receptors. The hydrogen peroxide production was assessed by the phenol red oxidation technique. Tumor necrosis factor-a was assessed in the supernatant of monocyte cultures by an immunoassay test. Phagocytosis was decreased in leishmaniasis individuals, through pattern recognition receptors and opsonin receptors. However, hydrogen peroxide and TNF-a production were increased in leishmaniasis individuals. Our data showed for the first time that phagocytic index of monocytes were decreased in leishmaniasis individuals. However, TNF-a production and the microbicidal hydrogen peroxide were increased in these individuals. These data suggest these alterations in monocytes might play a role both in defense against parasites as in pathogenesis of the disease.
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Forma mucosa da Leishmaniose Tegumentar Americana : estudo histopatológico e imuno-histoquímico de casos do Hospital Universitário de Brasília

Peixoto, Marco Aurélio da Silva 05 February 2009 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, 2009. / Submitted by Thaíza da Silva Santos (thaiza28@hotmail.com) on 2010-03-07T17:17:10Z No. of bitstreams: 1 2009_MarcoAurelioSilvaPeixoto.pdf: 2637387 bytes, checksum: 1a76f8f7944669c1b032e4ab59d38fed (MD5) / Approved for entry into archive by Carolina Campos(carolinacamposmaia@gmail.com) on 2010-03-11T13:37:30Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_MarcoAurelioSilvaPeixoto.pdf: 2637387 bytes, checksum: 1a76f8f7944669c1b032e4ab59d38fed (MD5) / Made available in DSpace on 2010-03-11T13:37:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_MarcoAurelioSilvaPeixoto.pdf: 2637387 bytes, checksum: 1a76f8f7944669c1b032e4ab59d38fed (MD5) Previous issue date: 2009-02-05 / A Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) é uma doença parasitária endêmica, principalmente na região Centro-Oeste. A Leishmania é um parasita que através de seus antígenos secretados e não secretados desencadeiam, respectivamente, uma resposta imune predominantemente celular (inata e adquirida) e em menor proporção humoral. Na resposta inata participam o sistema complemento, polimorfonucleares, macrófagos e células natural killer numa resposta inicial. Desta resposta inicial, há produção de citocinas (IL-12 e INF-γ e TNF-α) que ativam linfócitos T CD4+ e T CD8+ para resposta imune celular adquirida. A IL-12 diferencia os linfócitos T CD4 numa resposta Th1, com produção de INF-γ, ativação de macrófagos e resolução da doença. Enquanto, a IL-4 tem efeito reverso direcionando para uma resposta Th2 com diminuição da ativação de macrófagos, prevenindo o dano tecidual e permitindo a persistência do parasita. Foram descritos casos de pacientes com a forma mucosa da LTA do Hospital Universitário de Brasília, analisando dados epidemiológicos, clínico-laboratoriais e correlacionando com os aspectos histopatológicos e imuno-histoquímico (CD45ro, CD4, CD8, CD20, CD15, CD68 e Bcl-2). Perfil mais freqüente dos pacientes: sexo masculino, com média de idade de 50 anos, da região Centro-Oeste, com queixa de obstrução nasal e lesão de mucosa nasal infiltrada com ulceração e perfuração de septo ao exame otorrinolaringológico. A maioria com exames laboratoriais (IFA, inoculação em hamster, cultura, esfregaço e intradermorreação de Montenegro) compatíveis com a doença, sendo que em 44,44% dos casos foi possível a identificação da Leishmania por algum método auxiliar. Na histopatologia, de maneira geral, encontrou-se um infiltrado inflamatório linfohistioplasmocitário, às vezes acompanhado de uma reação granulomatosa com ou sem necrose. As classes histopatológicas encontradas foram: REC (reação exsudativa celular), REN (reação exsudativa necrótica), RENG (reação exsudativa necrótico-granulomatosa) e REG (reação exsudativa granulomatosa), sendo a primeira a mais freqüente (66,67%). Essas classes são estatisticamente significantes (p<0,05) diferentes quando comparadas entre si em relação à quantidade de células positivas na imuno-histoquímica, exceto entre as classes REG e REN (p>0,05). Esse estudo atestou a aplicabilidade e a praticidade do programa UnBVision na análise quantitativa das células nas reações imuno-histoquímicas. Na imuno-histoquímica, os linfócitos T predominaram em relação aos linfócitos B, comprovando que a doença tem reação imune mais celular do que humoral, sendo que dentre os linfócitos T, prevaleceu os linfócitos T CD4+ em relação aos linfócitos T CD8+, exceto em único exemplo de caso REG. Houve expressão considerável de Bcl- 2 no infiltrado inflamatório. Grupos com contato prévio com o antimonial pentavalente e com presença de granulomas ou de Leishmania ao método histopatológico não tiveram significância estatística (p>0,05) para explicar a diferença de número de células positivas para todos os marcadores aplicados no estudo. Em estudos complementares, o uso da imuno-histoquímica para identificar as citocinas e marcadores pró e antiapoptóticos podem contribuir para melhores esclarecimentos da imunopatologia da doença. __________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The American Integumentary Leishmaniasis (AIL) is a parasitic endemic disease, mainly in the Center-West region. Leishmania is a parasite that through its secreted and not secreted antigens trigger, respectively, a predominantly cellular immune response (innate and acquired) and to a lesser extent humoral. In the innate response, complement system, neutrophils, macrophages and natural killer cells work in an initial response. In this initial response, there is production of cytokines (IL-12, INF-γ and TNF-α) that activate T CD4+ and T CD8+ cells for acquired cellular immune response. The IL-12 action differentiates CD4 T cell to Th1 response and production of INF-γ, activation of macrophages and resolution of the disease. While the IL-4 has reverse effect directing to Th2 response with decreased activation of macrophages, this reaction prevents tissue damage and allows the persistence of the parasite. In this study, we have described patients with the mucosal form of AIL, they were treated in the University Hospital of Brasilia, analyzing epidemiological, clinical and laboratory data and correlating with the histopathologic features and the following immunohistochemical antibodies: CD45RO, CD4, CD8, CD20, CD15, CD68 and Bcl-2. Most common profile of patients: male, mean age 50 years, from Center-West region, with complaint of nasal obstruction and injury of nasal mucosa infiltrated with septum ulceration and perforation detected in the otorhinolaryngologic examination. Most of them with laboratory tests (indirect immunofluorescence, inoculation in hamster, smear, culture and Montenegro Skin Test) compatible with the disease, and in 44.44% of the cases it was possible the identification of Leishmania by some auxiliary method. In histopathology, in general, there was an inflammatory infiltrate lynphohistioplasmocitary sometimes accompanied by a granulomatous reaction with or without necrosis. The histopathological grades found were: ECR (exudative cellular reaction), ENR (exudative necrotic reaction), NEGR (necrotic-exudative granulomatous reaction) and EGR (exudative granulomatous reaction), the first one was the most frequent (66.67%) These classes are statistically significant (p <0.05) different when compared to each other with the amount of positive cells in immunohistochemistry, except between ENR and EGR classes (p> 0.05). This study attested the applicability and practicality of the program UnBVision in quantitative analysis of cells in immunohistochemical reactions. In immunohistochemistry, the T cells were predominant on B cells, confirming that the disease as more cellular immune response than humoral, and in T cells, prevailed the CD4+ T on CD8+ T cells, except in only one instance case EGR. There was considerable expression of Bcl-2 in inflammatory infiltrate. In groups with previous contact with pentavalent antimony and presence of granulomas or Leishmania the histopathologic method were not statistically significant (p> 0.05) to explain the difference in the number of positive cells for all markers used in the study. In further studies, the use of immunohistochemistry to identify the cytokines and markers pro and antiapoptosis can contribute to better explanations of the immunopathology of disease.
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Participação da proteína Beta-2 integrina no curso da infecção experimental induzida pelo Paracoccidioides brasiliensis

Reis, Janayna Nunes dos January 2009 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2009. / Submitted by Larissa Ferreira dos Angelos (ferreirangelos@gmail.com) on 2010-03-24T18:02:11Z No. of bitstreams: 1 2009_JanaynaNunesReis.pdf: 1420472 bytes, checksum: 7304e910ea878ca163555f1fe65a4206 (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2010-05-06T19:31:03Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_JanaynaNunesReis.pdf: 1420472 bytes, checksum: 7304e910ea878ca163555f1fe65a4206 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-05-06T19:31:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_JanaynaNunesReis.pdf: 1420472 bytes, checksum: 7304e910ea878ca163555f1fe65a4206 (MD5) Previous issue date: 2009 / Paracoccidioides brasiliensis é um fungo intracelular facultativo causador da Paracoccidioidomicose (PCM), doença crônica e granulomatosa, frequente na América Latina. O principal mecanismo de defesa do hospedeiro contra a PCM é a imunidade celular mediada principalmente por macrófagos ativados por IFN-γ. A interação inicial entre macrófago-fungo é mediada pelas interações entre proteínas de superfície, tais como as moléculas de adesão β2 integrinas. Os mecanismos pelos quais as integrinas interferem no curso da PCM são desconhecidos até o momento. Assim, o objetivo deste trabalho foi investigar a participação da β2 integrina na evolução da PCM. Para isso, foram utilizados camundongos C57BL/6 selvagens (WT) e geneticamente deficientes para a produção dessa proteína (β2-/-), ambos infectados com 1x106 células do isolado virulento P. brasiliensis (Pb18) por via endovenosa. Após 15, 30 e 60 dias de infecção os animais foram sacrificados e a análise histológica e histocitométrica de tecidos do fígado e pulmão foi realizada. A carga fúngica, os níveis de NO3, a concentração de anticorpos no soro e de citocinas em sobrenadante de culturas também foram determinados. Os resultados encontrados mostraram que nos camundongos β2-/- a carga fúngica foi menor quando comparada aos animais WT. No 15° dia após a infecção, tecidos do fígado de ambos os grupos de animais analisados apresentaram lesões granulomatosas bem caracterizadas; além disso, nesse mesmo período, o tamanho da área granulomatosa de tecido pulmonar foi significantemente maior nos camundongos β2-/- do que nos WT. No 60° dia após infecção, camundongos β2-/-apresentaram lesões granulomatosas mais compactas, bem formadas no tecido pulmonar, caracterizada por pouco espaço alveolar e presença de muito fungo nas lesões. Os níveis de NO3 detectados nos períodos de 15 e 60 dias após infecção foram significativamente menores em camundongos β2-/-. Os níveis de anticorpos IgG1 foram significativamente maiores em animais β2-/-. A produção de IL-12 e IL-10 foi semelhante em ambos os grupos, mas o estímulo específico com antígenos protéicos da parede celular de Pb18 induziu um leve aumento da produção apenas de IL-10. A capacidade de proliferação celular avaliada em linfócitos do baço estimulados com extrato protéico da parede celular do fungo foi mais significativa em animais β2-/-, quando comparados aos animais WT. Finalmente, foi observado que macrófagos de ambos os grupos de animais estudados, infectados in vitro com P. brasiliensis aumentaram o número de leveduras internalizadas após o tempo de 24 horas de co-cultivo. Nossos dados sugerem que as β2 integrinas participam do processo de internalização de leveduras de P. brasiliensis, contribuindo para a permanência do fungo no interior dos macrófagos e conseqüente sobrevivência do fungo. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Paracoccidioides brasiliensis is a facultative intracellular fungus that causes paracoccidioidomycosis (PCM), a chronic and granulomatous disease, frequently diagnosed in Latin America. As in other systemic mycoses, the host's principal defense mechanism against PCM is the cellular immunity mediated mainly by IFN-gamma activation of macrophages. Macrophages appear to play a fundamental role in this infection acting as the first line of defense for organism. The first interaction between macrophages-fungi is very important in this mycosis progression and this interaction is mediated by surface proteins, like β2 integrin. The role of β2 integrin in the curse of PCM is still unclear, then in the present study the importance of β2 integrin to progression of the disease was investigated. We used β2 - deficient (β2-/-) and wildtype (WT) C57BL/6 mice both endovenous infected with 1x106 the virulent P. brasiliensis strain (Pb18). After 15, 30 and 60 days post infection the mice were killed and we evaluated the disease progression by histology and histocytometry of liver and lung sections and also the fungal burden. Besides we analyzed the NO3 levels, antibodies in the serum and the production of cytokines. Our data showed that in the β2-/- mice there was less fungal burden when compared with the WT mice. After 15 days of infection, liver sections from both mouse groups presented granulomatous lesions well characterized with organized cells. Conversely, 60 days post infection we observed less alveolar space and many fungi inside the lesions in lung tissue from β2-/- mice. The size of granulomas from lung sections was significantly higher in β2-/- mice than in the WT only 15 days after infection, and this result was inverted in the 60º day post infection. Analysis of the NO3 levels from WT mice showed incresead after 8 weeks post infection; moreover IgG1a and IgG2 levels were higher in β2-/-mice. IL-12 and IL-10 production was similar in both groups, but the specific stimulus with the fungi antigens increased the IL-10 production. The spleen cell proliferation stimulated by protein extract from fungus (Pb 1:500) was more significative in β2-/- mice, while WT mice presented less efficient linfoproliferative response. We also observed that macrophages infected with P. brasiliensis in vitro from the two mouse strains had increased in internalized yeasts after 24h of co-culture. Our data suggest that β2 integrins that are probably involved with the fungi internalization contribute with the survival of the fungi inside macrophages and this phagocytosis may serve as a protected environment for the P. brasiliensis.
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Avaliação do efeito da miltefosina sobre a viabilidade e as funções de macrófagos peritoneais de camundongos C57BL/6

Ponte, Charlene Barreto 29 April 2011 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, 2011. / Submitted by Gabriela Ribeiro (gaby_ribeiro87@hotmail.com) on 2011-09-01T18:37:56Z No. of bitstreams: 1 2011_CharleneBarretoPonte.pdf: 1193218 bytes, checksum: 059d1531f12cab0b7b2679f1d24a9e9a (MD5) / Approved for entry into archive by Repositorio Gerência(repositorio@bce.unb.br) on 2011-10-25T18:45:40Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_CharleneBarretoPonte.pdf: 1193218 bytes, checksum: 059d1531f12cab0b7b2679f1d24a9e9a (MD5) / Made available in DSpace on 2011-10-25T18:45:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_CharleneBarretoPonte.pdf: 1193218 bytes, checksum: 059d1531f12cab0b7b2679f1d24a9e9a (MD5) / As leishmanioses têm gerado impacto na saúde pública e fazem parte do grupo de doenças negligenciadas segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS). O tratamento constitui um desafio de alta complexidade por se tratar de uma doença de difícil controle e cujos medicamentos disponíveis são injetáveis, têm alta toxicidade e são passíveis de falha terapêutica. A miltefosina (hexadecilfosfocolina) oral tem se mostrado eficaz e segura no tratamento da leishmaniose cutânea, mucocutânea e visceral, no entanto, pouco se sabe sobre seu mecanismo de ação e seus efeitos sobre os macrófagos, células parasitadas pelas leishmânias. Este estudo teve como objetivo avaliar, in vitro, o efeito da miltefosina sobre a viabilidade dos macrófagos, além de testar a influência da droga sobre a capacidade fagocitária e sobre a produção de espécies oxidativas por macrófagos peritoneais dos camundongos da linhagem C57BL/6. Para os testes de viabilidade celular, utilizou-se o método do MTT (3-(4,5-dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil-2-H brometo de tetrazolium) e partiu-se das concentrações de 1200 e 1600μg/mL da miltefosina e as demais foram obtidas por diluição seriada. Para os demais testes foram empregadas as doses: 10, 50 e 100μg/mL de miltefosina. A capacidade fagocitária foi avaliada utilizando-se 4 x 106 Saccharomyces cerevisiae, sensibilizadas ou não com o soro dos camundongos. A produção de óxido nítrico foi determinada pela reação de Griess e o peróxido de hidrogênio determinado pelo teste de oxidação do vermelho de fenol na presença de peroxidase. Os resultados indicaram um aumento na atividade mitocondrial, portanto as células permaneceram viáveis na presença de diferentes doses de miltefosina. Isso foi demonstrado pelo progressivo aumento no percentual de redução do MTT (p<0,05, teste t pareado). A droga aumentou em 53% a fagocitose na presença de S. cerevisiae não sensibilizadas nas preparações incubadas com 50μg/mL de miltefosina (p<0,001, teste de Wilcoxon), devido ao aumento no percentual de macrófagos envolvidos na fagocitose, embora tenha diminuído a média de leveduras fagocitadas. Na presença de S. cerevisiae sensibilizadas houve aumento do índice fagocitário com 10μg/mL, alterando a mediana de 202,0 para 382,5; e com 50μg/mL da droga, alterando a mediana de 202,0 para 602,0 (p<0,001, teste de Wilcoxon), pois aumentou o percentual de macrófagos envolvidos na fagocitose e a média de S. cerevisiae ingeridas pelos macrófagos. Todas as concentrações de miltefosina testadas diminuiram, pelo menos 93%, a produção de óxido nítrico pelos macrófagos em relação à produção basal (33,1 ± 15,0) ou estimulada com lipopolissacarídeo (50,2 ± 17,4) (p<0,001, teste t pareado); porém, não afetou a produção de peróxido de hidrogênio (p>0,05, teste t pareado). Portanto, este estudo mostrou que a miltefosina foi capaz de influenciar importantes funções do sistema imune inato dos macrófagos, principalmente potencializando a fagocitose. Além disso, a inibição da produção de óxido nítrico e a não alteração da produção de peróxido de hidrogênio sugerem que a ação microbicida da droga ocorre independente da produção destes radicais, por ação direta da miltefosina sobre o parasito. Isso pode trazer importantes implicações para o emprego deste medicamento na prática clínica, podendo trazer bons resultados aos indivíduos imunodeprimidos; além de também favorecer a redução dos efeitos deletérios gerados pelo excesso de radicais e, consequentemente, diminuir a imunopatogênese da leishmaniose. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The leishmaniasis have generated impact on public health and are part of the group of neglected diseases according to World Health Organization (WHO). Treatment is a highly complexity challenge because it is a difficult disease to control and whose medications available are injectable, have high toxicity and are susceptible of therapeutic failure. The oral miltefosine (hexadecylphosphocholine) is an effective and safe treatment of cutaneous leishmaniasis, mucocutaneous and visceral; however, little is known about its mechanism of action and its effects on macrophages, cells infected by leishmania. This study aimed at evaluating, in vitro, the effect of miltefosine on the viability of macrophages, and at testing the influence of drug on the phagocytic capacity and the production of oxidative species by peritoneal macrophages of mice C57BL/6. For the tests of cell viability, the MTT (3-(4,5-dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil-2-H brometo de tetrazolium) metod was used and started from the concentrations of 1200 and 1600μg/mL of miltefosine and the others were obtained by serial dilution. For all other tests doses of 10, 50 and 100μg/mL de miltefosine were used. The phagocytic capacity was assessed using 4 x 106 Saccharomyces cerevisiae, sensitized or not with the serum of mice. Nitric oxide production was determined by Griess reaction and the hydrogen peroxide production was determined by the phenol red oxidation in the presence of peroxidase. The results indicated a progressive increase in mitochondrial activity and therefore the cells remained viable in the presence of different doses of miltefosine. This was demonstrated by the progressive increase in the percentage of MTT reduction (p<0,05, paired t test). The drug increased phagocytosis by 53% using nonsensitized S. cerevisiae in preparations incubated with 50μg/mL of miltefosine (p<0,001, Wilcoxon test) due to the increased percentage of macrophages involved in phagocytosis, although the average number of phagocytosed yeasts has decreased. In the presence of sensitized S. cerevisiae, the phagocytic index increase with 10μg/mL by changing the median of 202,0 to 382,5; and with 50μg/mL, changing the median of 202,0 to 602,0 (p<0,001, Wilcoxon test), because the percentage of macrophages involved in phagocytosis and the average number S. cerevisiae ingested by macrophages was increased. All concentrations of miltefosine tested decreased at least 93%, nitric oxide production by macrophages in relation to the basal production (33,1 ± 15,0) or stimulated with lipopolysaccharide (50,2 ± 17,4) (p<0,001, paired t test); however, it did not affect the hydrogen peroxide production (p>0,05, paired t test). Therefore, this study showed that miltefosine was able to influence important functions of the innate immune system of macrophages, especially enhancing phagocytosis. Furthermore, the inhibition of nitric oxide production and the no change in the hydrogen peroxide production suggests that the antimicrobial action of the drug happens independently of production of these radicals, by direct action of miltefosine against the parasite. This can bring important implications for the use of this drug in clinical practice, and it can generate good results to the immunosuppressed individuals, in addition to also promote the reduction of harmful effects caused by excess of radicals and, consequently, reduce the immunopathogenesis of the leishmaniasis.
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Avaliação da citotoxicidade de quantum dots, in vitro, em células raw 264.7

RAELE, Renata Almeida 31 January 2013 (has links)
Submitted by Milena Dias (milena.dias@ufpe.br) on 2015-03-12T18:06:42Z No. of bitstreams: 2 Dissertaçao Renata Raele.pdf: 3359515 bytes, checksum: 46b18a28bc6517d1fd8e4e64d2c2680f (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-12T18:06:42Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertaçao Renata Raele.pdf: 3359515 bytes, checksum: 46b18a28bc6517d1fd8e4e64d2c2680f (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2013 / Quantum Dots (QDs) são nanocristais fluorescentes de semicondutores que vêm ganhando espaço em Ciências da Saúde como sondas fluorescentes para estudos de sistemas biológicos tanto in vitro como in vivo. Entretanto, para assegurar sua aplicabilidade em organismos vivos, são necessários testes de avaliação de toxicidade. Tendo em vista estes aspectos, o objetivo deste trabalho foi avaliar e comparar o efeito de diferentes concentrações de QDs de CdTe e ZnSe funcionalizados com Ácido Mercaptopropiônico (AMP) e/ou Ácido Mercaptosuccínico (AMS) sobre cultura de macrófagos da linhagem RAW 264.7, células imuno efetoras que desempenham papel relevante na defesa do organismo frente a patógenos. Para tanto, foram realizados testes de: (1) viabilidade celular através de MTT para definição de IC50 em 24 horas de exposição aos QDs, (2) viabilidade por exclusão de Iodeto de Propídio (PI) e análise de ciclo celular por PI na IC50 por 24 horas, e por fim (3) avaliação dos níveis de Ca2+ citoplasmático utilizando o Fluo-3. O teste estatístico utilizado foi One-Way ANOVA com nível de significância p ≤ 0,05. O teste MTT mostrou que após um período de 24 h de exposição aos QDs de CdTe houve redução da viabilidade para ~35 e 70% nas concentrações máximas e mínimas utilizadas (35,3+2% e 71+3,5% respectivamente) sendo a IC50 obtida para em ~76 nM (AMP=51,7+3,5% e AMS=56,3+8,6%). Essa toxicidade se apresentou de forma dose-dependente. Já o ZnSe se mostrou menos tóxico com IC50 em ~380 nM (48,7+11,3%). A análise da viabilidade com PI em 76 nM para todas as nanopartículas, indicou que não há lesão significativa da membrana plasmática após 24 h de incubação. O teste de ciclo celular, também em 76 nM, indicou que as amostras expostas aos QDs de CdTe apresentaram mais debris (AMP=27,4+3,8;%; AMS=28,4+3,9% e C=4,4+1,3) e menos células em S e G2 (AMP=7,3+0,3 e 4,7+0,5%; AMS=7,6+0,6 e 3,9+0,5% e C=16,1+2,3 e 13+1,7 % respectivamente). Já os resultados de ZnSe não diferiram do controle. As análises com Fluo-3 mostraram, para os QDs de CdTe, um aumento significativo de cálcio citoplasmático a partir da concentração de 76 nM (AMP=263,1+17,8; AMS=255,1+16,2 e C=102,5+6,5). Entretanto para o ZnSe só foi observado aumento significativo desse íon para concentrações a partir de 260 nM (ZnSe=188+15,8 e C=107,2+4,6). Concluímos que QDs de CdTe apresentam toxicidade consideravelmente maior que de ZnSe para as células RAW 264.7, independente do agente estabilizante/funcionalizante ou tamanho do QD. Isso indica que a toxicidade está provavelmente ligada à liberação do Cádmio. Com relação ao CdTe, acredita-se que danos posteriores à membrana plasmática nessas células podem ser reflexo dos eventos precoces ocorridos na mitocôndria e nos níveis de Ca2+. Por fim, de acordo com os resultados apresentados, observamos que a morte celular de RAW 264.7 devido à exposição aos QDs é um evento crescente e contínuo diretamente relacionado com o tempo de exposição e com a concentração de QDs ministrada.

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