A macieira (Malus x domestica) é uma das mais importantes frutíferas do mundo, e sua produção tem destaque na região sul do Brasil. Comparações entre padrões de expressão gênica de diferentes variedades constituem uma estratégia de alto valor científico para seu melhoramento genético. Contudo, a acurácia das análises é dependente de genes de referência estáveis para a normalização dos dados. A escolha de controles inapropriados pode resultar em determinações estatísticas e conclusões incorretas. Pelo presente trabalho, teve-se como objetivo selecionar os melhores genes-referência para estudos de expressão gênica em macieiras, via reação em cadeia da DNA polimerase quantitativa precedida de transcrição reversa (RT-qPCR). A expressão de 21 genes, incluindo tradicionais “housekeeping genes” ou genes sugeridos como constitutivos por dados de microarranjos disponíveis na literatura, foram avaliados em diferentes tecidos vegetativos e reprodutivos da cultivar ‘Gala’ de macieira. Para todos os genes, as combinações de primers testadas permitiram amplificações específicas e curvas de eficiência apropriadas. A estabilidade dos genes foi determinada por dois diferentes algoritmos estatísticos, geNorm e NormFinder. Os resultados permitiram concluir que, para os tecidos e condições avaliadas, EF1β, MDH, SAND, THFS e WD40 são os melhores genes normalizadores para quantificação relativa da abundância de transcritos de interesse em diferentes tecidos-alvos de macieira. A expressão de PAL foi utilizada para validação dos controles selecionados. Combinações específicas de dois ou três genes-referência demonstraram ser suficientes para a normalização dos dados em cada conjunto de amostras analisado. Finalmente, a expressão do gene MDP0000232313 ou MdDAM6, potencial gene MADS-box associado à dormência em macieira, foi avaliada em gemas da cultivar ‘Fuji Standard’, amostradas durante o ciclo vegetativo e de dormência das plantas ao longo do ano 2009. As análises foram conduzidas via RT-qPCR e de forma relativa aos genes EF1β e WD40. Observou-se um nível basal de expressão de MdDAM6 durante o verão e um aumento de cerca de 10 vezes no inverno, refletindo sua possível função no estabelecimento e/ou manutenção do estado endodormente das gemas de macieira, uma vez que este tenha sido estabelecido. / Apple (Malus x domestica) is one of the most important fruit tree crop in the world, and its production is prominent in southern Brazil. Comparisons among profiles of gene expression from different cultivars are valuable scientific tools for apple genetic breeding. However, the accuracy of the analyses is dependent on the evaluation of stable reference genes for data normalization. The inappropriate choice of controls may result in statistical significance undue or incorrect conclusions. In the present work, the objective was to select the best reference genes for gene expression studies by reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) in apple trees. The expression of 21 genes, including traditional housekeeping or genes suggested as constitutive by microarray data available in the literature, was evaluated in different vegetative and reproductive tissues of the apple ‘Gala’ cultivar. For all genes, tested combinations of primers allowed specific amplification and suitable efficiency curves. The stability of the genes was determined by two different statistical algorithms, geNorm and NormFinder. The results allowed us to conclude that, for tissues and conditions evaluated, EF1β, MDH, SAND, THFS and WD40 are the best normalizing genes for relative quantification of interest transcript abundance in different target tissues of apple. PAL expression was used to validate the selected normalizers. Specific combinations of two or three reference genes were shown to be sufficient to normalize each apple sample set analyzed. Finally, the MDP0000232313 or MdDAM6 gene expression, a potential MADS-box gene associated with dormancy in apple, was evaluated in buds of the apple 'Fuji' cultivar, sampled in the vegetative and dormant cycle of plants during the year of 2009. The analysis was performed by RT-qPCR and quantified in relation to the EF1β and WD40 normalizing genes. It a basal level of expression was observed during summer and a ten fold increase during winter, reflecting its possible function associated with the establishment and/or maintenance of the endodormant state of apple buds, once it has been established.

A macieira (Malus x domestica) é uma das mais importantes frutíferas do mundo, e sua produção tem destaque na região sul do Brasil. Comparações entre padrões de expressão gênica de diferentes variedades constituem uma estratégia de alto valor científico para seu melhoramento genético. Contudo, a acurácia das análises é dependente de genes de referência estáveis para a normalização dos dados. A escolha de controles inapropriados pode resultar em determinações estatísticas e conclusões incorretas. Pelo presente trabalho, teve-se como objetivo selecionar os melhores genes-referência para estudos de expressão gênica em macieiras, via reação em cadeia da DNA polimerase quantitativa precedida de transcrição reversa (RT-qPCR). A expressão de 21 genes, incluindo tradicionais “housekeeping genes” ou genes sugeridos como constitutivos por dados de microarranjos disponíveis na literatura, foram avaliados em diferentes tecidos vegetativos e reprodutivos da cultivar ‘Gala’ de macieira. Para todos os genes, as combinações de primers testadas permitiram amplificações específicas e curvas de eficiência apropriadas. A estabilidade dos genes foi determinada por dois diferentes algoritmos estatísticos, geNorm e NormFinder. Os resultados permitiram concluir que, para os tecidos e condições avaliadas, EF1β, MDH, SAND, THFS e WD40 são os melhores genes normalizadores para quantificação relativa da abundância de transcritos de interesse em diferentes tecidos-alvos de macieira. A expressão de PAL foi utilizada para validação dos controles selecionados. Combinações específicas de dois ou três genes-referência demonstraram ser suficientes para a normalização dos dados em cada conjunto de amostras analisado. Finalmente, a expressão do gene MDP0000232313 ou MdDAM6, potencial gene MADS-box associado à dormência em macieira, foi avaliada em gemas da cultivar ‘Fuji Standard’, amostradas durante o ciclo vegetativo e de dormência das plantas ao longo do ano 2009. As análises foram conduzidas via RT-qPCR e de forma relativa aos genes EF1β e WD40. Observou-se um nível basal de expressão de MdDAM6 durante o verão e um aumento de cerca de 10 vezes no inverno, refletindo sua possível função no estabelecimento e/ou manutenção do estado endodormente das gemas de macieira, uma vez que este tenha sido estabelecido. / Apple (Malus x domestica) is one of the most important fruit tree crop in the world, and its production is prominent in southern Brazil. Comparisons among profiles of gene expression from different cultivars are valuable scientific tools for apple genetic breeding. However, the accuracy of the analyses is dependent on the evaluation of stable reference genes for data normalization. The inappropriate choice of controls may result in statistical significance undue or incorrect conclusions. In the present work, the objective was to select the best reference genes for gene expression studies by reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) in apple trees. The expression of 21 genes, including traditional housekeeping or genes suggested as constitutive by microarray data available in the literature, was evaluated in different vegetative and reproductive tissues of the apple ‘Gala’ cultivar. For all genes, tested combinations of primers allowed specific amplification and suitable efficiency curves. The stability of the genes was determined by two different statistical algorithms, geNorm and NormFinder. The results allowed us to conclude that, for tissues and conditions evaluated, EF1β, MDH, SAND, THFS and WD40 are the best normalizing genes for relative quantification of interest transcript abundance in different target tissues of apple. PAL expression was used to validate the selected normalizers. Specific combinations of two or three reference genes were shown to be sufficient to normalize each apple sample set analyzed. Finally, the MDP0000232313 or MdDAM6 gene expression, a potential MADS-box gene associated with dormancy in apple, was evaluated in buds of the apple 'Fuji' cultivar, sampled in the vegetative and dormant cycle of plants during the year of 2009. The analysis was performed by RT-qPCR and quantified in relation to the EF1β and WD40 normalizing genes. It a basal level of expression was observed during summer and a ten fold increase during winter, reflecting its possible function associated with the establishment and/or maintenance of the endodormant state of apple buds, once it has been established.

A macieira (Malus x domestica) é uma das mais importantes frutíferas do mundo, e sua produção tem destaque na região sul do Brasil. Comparações entre padrões de expressão gênica de diferentes variedades constituem uma estratégia de alto valor científico para seu melhoramento genético. Contudo, a acurácia das análises é dependente de genes de referência estáveis para a normalização dos dados. A escolha de controles inapropriados pode resultar em determinações estatísticas e conclusões incorretas. Pelo presente trabalho, teve-se como objetivo selecionar os melhores genes-referência para estudos de expressão gênica em macieiras, via reação em cadeia da DNA polimerase quantitativa precedida de transcrição reversa (RT-qPCR). A expressão de 21 genes, incluindo tradicionais “housekeeping genes” ou genes sugeridos como constitutivos por dados de microarranjos disponíveis na literatura, foram avaliados em diferentes tecidos vegetativos e reprodutivos da cultivar ‘Gala’ de macieira. Para todos os genes, as combinações de primers testadas permitiram amplificações específicas e curvas de eficiência apropriadas. A estabilidade dos genes foi determinada por dois diferentes algoritmos estatísticos, geNorm e NormFinder. Os resultados permitiram concluir que, para os tecidos e condições avaliadas, EF1β, MDH, SAND, THFS e WD40 são os melhores genes normalizadores para quantificação relativa da abundância de transcritos de interesse em diferentes tecidos-alvos de macieira. A expressão de PAL foi utilizada para validação dos controles selecionados. Combinações específicas de dois ou três genes-referência demonstraram ser suficientes para a normalização dos dados em cada conjunto de amostras analisado. Finalmente, a expressão do gene MDP0000232313 ou MdDAM6, potencial gene MADS-box associado à dormência em macieira, foi avaliada em gemas da cultivar ‘Fuji Standard’, amostradas durante o ciclo vegetativo e de dormência das plantas ao longo do ano 2009. As análises foram conduzidas via RT-qPCR e de forma relativa aos genes EF1β e WD40. Observou-se um nível basal de expressão de MdDAM6 durante o verão e um aumento de cerca de 10 vezes no inverno, refletindo sua possível função no estabelecimento e/ou manutenção do estado endodormente das gemas de macieira, uma vez que este tenha sido estabelecido. / Apple (Malus x domestica) is one of the most important fruit tree crop in the world, and its production is prominent in southern Brazil. Comparisons among profiles of gene expression from different cultivars are valuable scientific tools for apple genetic breeding. However, the accuracy of the analyses is dependent on the evaluation of stable reference genes for data normalization. The inappropriate choice of controls may result in statistical significance undue or incorrect conclusions. In the present work, the objective was to select the best reference genes for gene expression studies by reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) in apple trees. The expression of 21 genes, including traditional housekeeping or genes suggested as constitutive by microarray data available in the literature, was evaluated in different vegetative and reproductive tissues of the apple ‘Gala’ cultivar. For all genes, tested combinations of primers allowed specific amplification and suitable efficiency curves. The stability of the genes was determined by two different statistical algorithms, geNorm and NormFinder. The results allowed us to conclude that, for tissues and conditions evaluated, EF1β, MDH, SAND, THFS and WD40 are the best normalizing genes for relative quantification of interest transcript abundance in different target tissues of apple. PAL expression was used to validate the selected normalizers. Specific combinations of two or three reference genes were shown to be sufficient to normalize each apple sample set analyzed. Finally, the MDP0000232313 or MdDAM6 gene expression, a potential MADS-box gene associated with dormancy in apple, was evaluated in buds of the apple 'Fuji' cultivar, sampled in the vegetative and dormant cycle of plants during the year of 2009. The analysis was performed by RT-qPCR and quantified in relation to the EF1β and WD40 normalizing genes. It a basal level of expression was observed during summer and a ten fold increase during winter, reflecting its possible function associated with the establishment and/or maintenance of the endodormant state of apple buds, once it has been established.

A macieira (Malus x domestica Borkh.), uma das frutíferas mais importantes das regiões de clima temperado, é caracterizada pela cessação de crescimento visível durante o inverno, processo este chamado de dormência. A dormência de gemas permite que a planta sobreviva às baixas temperaturas e é determinante para a eficiência na produção de maçãs. Entender o processo de dormência, assim como seus mecanismos de controle, tornou-se fundamental para contornar as perdas na produção, seja por meio de técnicas de manejo ou pela geração de variedades comerciais melhor adaptadas às regiões de cultivo. A enzima galactinol sintase (GolS) catalisa a primeira etapa da via de síntese de oligossacarídeos da família da rafinose, cujo acúmulo em resposta a estresses abióticos é fato bem conhecido. Em trabalho anterior, nosso grupo mostrou um acúmulo de transcritos constrastante de quatro genes MdGolS durante o inverno, sugerindo-se uma possível função adaptativa desses genes durante a dormência de gemas em macieira. Pelo presente trabalho, tem-se como objetivo quantificar o acúmulo de quatro proteínas MdGolS em gemas apicais da macieira Fuji Standard visando confirmar os perfis transcricionais previamente obtidos. Anticorpos policlonais capazes de reconhecer as quatro MdGolS foram separadamente produzidos para emprego na técnica de Western blot Análise por Dot blot permitiu-nos mostrar que os quatro conjuntos de anticorpos são específicos para o seu respectivo peptídeo, sem reações cruzadas. Cinco protocolos de extração de proteínas foram testados e otimizados para a obtenção de maiores quantidades de proteínas de gemas fechadas de macieira. Dois desses extratos foram escolhidos para realizar a técnica de Western blot. Proteínas totais foram quantificadas pelo método de Bradford e 20 μg foi considerada a quantidade mais adequada para os ensaios. O anticorpo MdGolS1 permitiu a detecção de sinais em ambos os extratos, mas nenhum no tamanho esperado para a respectiva proteína, isto é, com aproximadamente 38 kDa. Os anticorpos MdGolS2, MdGolS3 e MdGolS4 não permitiram detectar quaisquer sinais ou, ainda, sinais fracos que não puderam ser relacionados com o perfil transcricional previamente obtido. Estratégias alternativas, em nível proteico, para validar os níveis aumentados de transcritos de GolS anteriormente observados são discutidas. / Apple tree (Malus x domestica Borkh), one of the world’s most important fruit crops in temperate regions, is characterized by the cessation of visible growth during winter, a process called dormancy. Bud dormancy allows plant survival under low temperatures and it is crucial for the efficiency of apple production. The knowledge about the dormancy process, as well as its control mechanisms, became an essential approach to circumvent production losses either through management techniques or by the generation of new commercial varieties better adapted to each regional cultivation environment. The galactinol synthase (GolS) enzyme catalyzes the first step in the synthesis pathway of the raffinose family of oligosaccharides, whose accumulation in response to abiotic stress is well known. A previous work of our group allowed us to show contrasting transcript levels of four MdGolS during winter, suggesting a possible adaptative role for some of these genes during bud dormancy. The present work aims to quantify MdGolS protein accumulation in apical buds of the Fuji Standard apple tree cultivar in order to verify and associate with transcriptional profiles previously obtained. Polyclonal antibodies that recognize the four MdGolS produced to perform Western blot assays. Dot blot analysis revealed that the four sets of antibodies were specific to their respective peptides, without cross-reactions. Five protein extraction protocols were tested and optimized for obtaining greater amounts of proteins from apple apical buds. Two of these extracts were chosen to perform Western blot assays. Total protein was quantified using the Bradford method and 20 μg was found to be the most adequate for the assay. MdGolS1 antibody allowed the detection of signals in both extracts, but none in the expected protein mass, i.e., approximately 38 kDa. MdGolS2, MdGolS3 and MdGolS4 antibodies allowed us to detect only weak or no signals, that could not be correlated to the transcript profile previously obtained. Alternative strategies to validate the previously observed increased GolS transcript levels at the protein level are discussed.

A macieira (Malus x domestica Borkh.) é uma frutífera de clima temperado que possui grande importância econômica mundialmente, sendo sua produtividade intimamente relacionada à saída do processo de dormência hibernal. Este processo pode ser definido como a incapacidade da planta iniciar o crescimento meristemático mesmo sob condições favoráveis e os mecanismos de controle molecular da dormência em macieiras ainda são pouco compreendidos. O objetivo do presente trabalho foi investigar o perfil gênico diferencial entre cultivares de macieiras contrastantes para requerimento de frio. As cultivares selecionadas foram Gala e sua mutante espontânea Castel Gala, as quais apresentam alto e baixo requerimento de frio, respectivamente. A técnica de hibridização supressiva subtrativa (SSH) permitiu a identificação de 28 genes candidatos à regulação da dormência. Análises de RT-qPCR foram realizadas visando a validação da expressão diferencial dos genes selecionados, assim como caracterizá-los transcricionalmente em três cultivares distintas durante um ciclo de crescimento e de dormência. Dos 28 genes candidatos, 17 apresentaram o mesmo perfil diferencial identificado por SSH. Um acúmulo sazonal de transcritos durante o inverno foi identificado para alguns genes e as cultivares de maior requerimento de frio apresentaram acúmulo de transcritos por mais tempo. Este perfil permitiu-nos sugerir que estes genes podem estar atuando na regulação dos processos de dormência e de aclimatação ao frio. Dos 17 genes validados, aqueles codificadores de proteínas DAM, desidrinas, GAST1, LTI65, NAC, histonas variantes H2A.Z e RAP2.12 apresentaram os maiores contrastes transcricionais entre as cultivares analisadas durante o inverno e constituem-se como fortes candidatos a participantes do processo de progressão da dormência em macieiras. Finalmente, a família de genes codificadores de desidrinas de macieira teve seus membros identificados e caracterizados transcricionalmente. Análises in silico permitiram a identificação de oito modelos gênicos preditos de desidrinas no genoma de macieira. As cadeias peptídicas deduzidas foram classificadas conforme a presença dos segmentos conservados YnSKn. Um perfil sazonal de regulação da expressão foi identificado, com a presença de um pico de acúmulo de transcritos durante o inverno, o que sugere a presença de um mecanismo similar de regulação entre genes de desidrinas de macieira. / Apple tree (Malus x domestica Borkh.) is a temperate fruit crop of great economic importance worldwide and its productivity is related with the release from a bud dormancy process. This process is defined as the plant inability to initiate growth from meristems under favorable conditions and molecular information about dormancy control in apple trees is limited. The aim of the present work was to investigate the differential gene expression profiles between apple tree cultivars contrasting in chilling requirement for breaking dormancy. The selected apple cultivars were Gala and its derived bud sport Castel Gala, which displays high and low chilling requirement, respectively. A suppression subtractive hybridization (SSH) assay yielded 28 candidate genes putatively associated to dormancy cycling. RT-qPCR analyses were performed in order to validate the differential expression profiles and also to transcriptionally characterize the selected genes in three distinct apple tree cultivars during a growth to dormancy cycle. Among the 28 candidate genes, 17 confirmed the differential expression profile predicted by SSH. A seasonal transcript accumulation during the winter was identified to some genes, with high chilling requirement cultivars presenting higher levels of transcripts. This profile allowed us to suggest that these genes may be acting on dormancy regulation and cold acclimation. Out of the 17 candidate genes, those coding for DAM, dehydrins, GAST1, LTI65, NAC, histone variants H2A.Z and RAP2.12 displayed major differences in gene expression between cultivars through the winter and are strong candidates to play key roles on dormancy progression in apple trees. Finally, we identified and transcriptionally characterized the dehydrin gene family in apple trees. In silico analyses allowed us to identify eight predicted gene models for dehydrins in the apple genome. Deduced polypeptides were classified according to the presence of the conserved YnSKn segments. A seasonal regulation of gene expression was observed, with higher transcript accumulation during the winter. This data suggests that a similar mechanism of transcript regulation is acting through the apple dehydrin genes.

A macieira (Malus x domestica Borkh.) é uma frutífera de clima temperado que possui grande importância econômica mundialmente, sendo sua produtividade intimamente relacionada à saída do processo de dormência hibernal. Este processo pode ser definido como a incapacidade da planta iniciar o crescimento meristemático mesmo sob condições favoráveis e os mecanismos de controle molecular da dormência em macieiras ainda são pouco compreendidos. O objetivo do presente trabalho foi investigar o perfil gênico diferencial entre cultivares de macieiras contrastantes para requerimento de frio. As cultivares selecionadas foram Gala e sua mutante espontânea Castel Gala, as quais apresentam alto e baixo requerimento de frio, respectivamente. A técnica de hibridização supressiva subtrativa (SSH) permitiu a identificação de 28 genes candidatos à regulação da dormência. Análises de RT-qPCR foram realizadas visando a validação da expressão diferencial dos genes selecionados, assim como caracterizá-los transcricionalmente em três cultivares distintas durante um ciclo de crescimento e de dormência. Dos 28 genes candidatos, 17 apresentaram o mesmo perfil diferencial identificado por SSH. Um acúmulo sazonal de transcritos durante o inverno foi identificado para alguns genes e as cultivares de maior requerimento de frio apresentaram acúmulo de transcritos por mais tempo. Este perfil permitiu-nos sugerir que estes genes podem estar atuando na regulação dos processos de dormência e de aclimatação ao frio. Dos 17 genes validados, aqueles codificadores de proteínas DAM, desidrinas, GAST1, LTI65, NAC, histonas variantes H2A.Z e RAP2.12 apresentaram os maiores contrastes transcricionais entre as cultivares analisadas durante o inverno e constituem-se como fortes candidatos a participantes do processo de progressão da dormência em macieiras. Finalmente, a família de genes codificadores de desidrinas de macieira teve seus membros identificados e caracterizados transcricionalmente. Análises in silico permitiram a identificação de oito modelos gênicos preditos de desidrinas no genoma de macieira. As cadeias peptídicas deduzidas foram classificadas conforme a presença dos segmentos conservados YnSKn. Um perfil sazonal de regulação da expressão foi identificado, com a presença de um pico de acúmulo de transcritos durante o inverno, o que sugere a presença de um mecanismo similar de regulação entre genes de desidrinas de macieira. / Apple tree (Malus x domestica Borkh.) is a temperate fruit crop of great economic importance worldwide and its productivity is related with the release from a bud dormancy process. This process is defined as the plant inability to initiate growth from meristems under favorable conditions and molecular information about dormancy control in apple trees is limited. The aim of the present work was to investigate the differential gene expression profiles between apple tree cultivars contrasting in chilling requirement for breaking dormancy. The selected apple cultivars were Gala and its derived bud sport Castel Gala, which displays high and low chilling requirement, respectively. A suppression subtractive hybridization (SSH) assay yielded 28 candidate genes putatively associated to dormancy cycling. RT-qPCR analyses were performed in order to validate the differential expression profiles and also to transcriptionally characterize the selected genes in three distinct apple tree cultivars during a growth to dormancy cycle. Among the 28 candidate genes, 17 confirmed the differential expression profile predicted by SSH. A seasonal transcript accumulation during the winter was identified to some genes, with high chilling requirement cultivars presenting higher levels of transcripts. This profile allowed us to suggest that these genes may be acting on dormancy regulation and cold acclimation. Out of the 17 candidate genes, those coding for DAM, dehydrins, GAST1, LTI65, NAC, histone variants H2A.Z and RAP2.12 displayed major differences in gene expression between cultivars through the winter and are strong candidates to play key roles on dormancy progression in apple trees. Finally, we identified and transcriptionally characterized the dehydrin gene family in apple trees. In silico analyses allowed us to identify eight predicted gene models for dehydrins in the apple genome. Deduced polypeptides were classified according to the presence of the conserved YnSKn segments. A seasonal regulation of gene expression was observed, with higher transcript accumulation during the winter. This data suggests that a similar mechanism of transcript regulation is acting through the apple dehydrin genes.

A macieira (Malus x domestica Borkh.), uma das frutíferas mais importantes das regiões de clima temperado, é caracterizada pela cessação de crescimento visível durante o inverno, processo este chamado de dormência. A dormência de gemas permite que a planta sobreviva às baixas temperaturas e é determinante para a eficiência na produção de maçãs. Entender o processo de dormência, assim como seus mecanismos de controle, tornou-se fundamental para contornar as perdas na produção, seja por meio de técnicas de manejo ou pela geração de variedades comerciais melhor adaptadas às regiões de cultivo. A enzima galactinol sintase (GolS) catalisa a primeira etapa da via de síntese de oligossacarídeos da família da rafinose, cujo acúmulo em resposta a estresses abióticos é fato bem conhecido. Em trabalho anterior, nosso grupo mostrou um acúmulo de transcritos constrastante de quatro genes MdGolS durante o inverno, sugerindo-se uma possível função adaptativa desses genes durante a dormência de gemas em macieira. Pelo presente trabalho, tem-se como objetivo quantificar o acúmulo de quatro proteínas MdGolS em gemas apicais da macieira Fuji Standard visando confirmar os perfis transcricionais previamente obtidos. Anticorpos policlonais capazes de reconhecer as quatro MdGolS foram separadamente produzidos para emprego na técnica de Western blot Análise por Dot blot permitiu-nos mostrar que os quatro conjuntos de anticorpos são específicos para o seu respectivo peptídeo, sem reações cruzadas. Cinco protocolos de extração de proteínas foram testados e otimizados para a obtenção de maiores quantidades de proteínas de gemas fechadas de macieira. Dois desses extratos foram escolhidos para realizar a técnica de Western blot. Proteínas totais foram quantificadas pelo método de Bradford e 20 μg foi considerada a quantidade mais adequada para os ensaios. O anticorpo MdGolS1 permitiu a detecção de sinais em ambos os extratos, mas nenhum no tamanho esperado para a respectiva proteína, isto é, com aproximadamente 38 kDa. Os anticorpos MdGolS2, MdGolS3 e MdGolS4 não permitiram detectar quaisquer sinais ou, ainda, sinais fracos que não puderam ser relacionados com o perfil transcricional previamente obtido. Estratégias alternativas, em nível proteico, para validar os níveis aumentados de transcritos de GolS anteriormente observados são discutidas. / Apple tree (Malus x domestica Borkh), one of the world’s most important fruit crops in temperate regions, is characterized by the cessation of visible growth during winter, a process called dormancy. Bud dormancy allows plant survival under low temperatures and it is crucial for the efficiency of apple production. The knowledge about the dormancy process, as well as its control mechanisms, became an essential approach to circumvent production losses either through management techniques or by the generation of new commercial varieties better adapted to each regional cultivation environment. The galactinol synthase (GolS) enzyme catalyzes the first step in the synthesis pathway of the raffinose family of oligosaccharides, whose accumulation in response to abiotic stress is well known. A previous work of our group allowed us to show contrasting transcript levels of four MdGolS during winter, suggesting a possible adaptative role for some of these genes during bud dormancy. The present work aims to quantify MdGolS protein accumulation in apical buds of the Fuji Standard apple tree cultivar in order to verify and associate with transcriptional profiles previously obtained. Polyclonal antibodies that recognize the four MdGolS produced to perform Western blot assays. Dot blot analysis revealed that the four sets of antibodies were specific to their respective peptides, without cross-reactions. Five protein extraction protocols were tested and optimized for obtaining greater amounts of proteins from apple apical buds. Two of these extracts were chosen to perform Western blot assays. Total protein was quantified using the Bradford method and 20 μg was found to be the most adequate for the assay. MdGolS1 antibody allowed the detection of signals in both extracts, but none in the expected protein mass, i.e., approximately 38 kDa. MdGolS2, MdGolS3 and MdGolS4 antibodies allowed us to detect only weak or no signals, that could not be correlated to the transcript profile previously obtained. Alternative strategies to validate the previously observed increased GolS transcript levels at the protein level are discussed.

A macieira (Malus x domestica Borkh.) é uma frutífera de clima temperado que possui grande importância econômica mundialmente, sendo sua produtividade intimamente relacionada à saída do processo de dormência hibernal. Este processo pode ser definido como a incapacidade da planta iniciar o crescimento meristemático mesmo sob condições favoráveis e os mecanismos de controle molecular da dormência em macieiras ainda são pouco compreendidos. O objetivo do presente trabalho foi investigar o perfil gênico diferencial entre cultivares de macieiras contrastantes para requerimento de frio. As cultivares selecionadas foram Gala e sua mutante espontânea Castel Gala, as quais apresentam alto e baixo requerimento de frio, respectivamente. A técnica de hibridização supressiva subtrativa (SSH) permitiu a identificação de 28 genes candidatos à regulação da dormência. Análises de RT-qPCR foram realizadas visando a validação da expressão diferencial dos genes selecionados, assim como caracterizá-los transcricionalmente em três cultivares distintas durante um ciclo de crescimento e de dormência. Dos 28 genes candidatos, 17 apresentaram o mesmo perfil diferencial identificado por SSH. Um acúmulo sazonal de transcritos durante o inverno foi identificado para alguns genes e as cultivares de maior requerimento de frio apresentaram acúmulo de transcritos por mais tempo. Este perfil permitiu-nos sugerir que estes genes podem estar atuando na regulação dos processos de dormência e de aclimatação ao frio. Dos 17 genes validados, aqueles codificadores de proteínas DAM, desidrinas, GAST1, LTI65, NAC, histonas variantes H2A.Z e RAP2.12 apresentaram os maiores contrastes transcricionais entre as cultivares analisadas durante o inverno e constituem-se como fortes candidatos a participantes do processo de progressão da dormência em macieiras. Finalmente, a família de genes codificadores de desidrinas de macieira teve seus membros identificados e caracterizados transcricionalmente. Análises in silico permitiram a identificação de oito modelos gênicos preditos de desidrinas no genoma de macieira. As cadeias peptídicas deduzidas foram classificadas conforme a presença dos segmentos conservados YnSKn. Um perfil sazonal de regulação da expressão foi identificado, com a presença de um pico de acúmulo de transcritos durante o inverno, o que sugere a presença de um mecanismo similar de regulação entre genes de desidrinas de macieira. / Apple tree (Malus x domestica Borkh.) is a temperate fruit crop of great economic importance worldwide and its productivity is related with the release from a bud dormancy process. This process is defined as the plant inability to initiate growth from meristems under favorable conditions and molecular information about dormancy control in apple trees is limited. The aim of the present work was to investigate the differential gene expression profiles between apple tree cultivars contrasting in chilling requirement for breaking dormancy. The selected apple cultivars were Gala and its derived bud sport Castel Gala, which displays high and low chilling requirement, respectively. A suppression subtractive hybridization (SSH) assay yielded 28 candidate genes putatively associated to dormancy cycling. RT-qPCR analyses were performed in order to validate the differential expression profiles and also to transcriptionally characterize the selected genes in three distinct apple tree cultivars during a growth to dormancy cycle. Among the 28 candidate genes, 17 confirmed the differential expression profile predicted by SSH. A seasonal transcript accumulation during the winter was identified to some genes, with high chilling requirement cultivars presenting higher levels of transcripts. This profile allowed us to suggest that these genes may be acting on dormancy regulation and cold acclimation. Out of the 17 candidate genes, those coding for DAM, dehydrins, GAST1, LTI65, NAC, histone variants H2A.Z and RAP2.12 displayed major differences in gene expression between cultivars through the winter and are strong candidates to play key roles on dormancy progression in apple trees. Finally, we identified and transcriptionally characterized the dehydrin gene family in apple trees. In silico analyses allowed us to identify eight predicted gene models for dehydrins in the apple genome. Deduced polypeptides were classified according to the presence of the conserved YnSKn segments. A seasonal regulation of gene expression was observed, with higher transcript accumulation during the winter. This data suggests that a similar mechanism of transcript regulation is acting through the apple dehydrin genes.

A macieira (Malus x domestica Borkh.), uma das frutíferas mais importantes das regiões de clima temperado, é caracterizada pela cessação de crescimento visível durante o inverno, processo este chamado de dormência. A dormência de gemas permite que a planta sobreviva às baixas temperaturas e é determinante para a eficiência na produção de maçãs. Entender o processo de dormência, assim como seus mecanismos de controle, tornou-se fundamental para contornar as perdas na produção, seja por meio de técnicas de manejo ou pela geração de variedades comerciais melhor adaptadas às regiões de cultivo. A enzima galactinol sintase (GolS) catalisa a primeira etapa da via de síntese de oligossacarídeos da família da rafinose, cujo acúmulo em resposta a estresses abióticos é fato bem conhecido. Em trabalho anterior, nosso grupo mostrou um acúmulo de transcritos constrastante de quatro genes MdGolS durante o inverno, sugerindo-se uma possível função adaptativa desses genes durante a dormência de gemas em macieira. Pelo presente trabalho, tem-se como objetivo quantificar o acúmulo de quatro proteínas MdGolS em gemas apicais da macieira Fuji Standard visando confirmar os perfis transcricionais previamente obtidos. Anticorpos policlonais capazes de reconhecer as quatro MdGolS foram separadamente produzidos para emprego na técnica de Western blot Análise por Dot blot permitiu-nos mostrar que os quatro conjuntos de anticorpos são específicos para o seu respectivo peptídeo, sem reações cruzadas. Cinco protocolos de extração de proteínas foram testados e otimizados para a obtenção de maiores quantidades de proteínas de gemas fechadas de macieira. Dois desses extratos foram escolhidos para realizar a técnica de Western blot. Proteínas totais foram quantificadas pelo método de Bradford e 20 μg foi considerada a quantidade mais adequada para os ensaios. O anticorpo MdGolS1 permitiu a detecção de sinais em ambos os extratos, mas nenhum no tamanho esperado para a respectiva proteína, isto é, com aproximadamente 38 kDa. Os anticorpos MdGolS2, MdGolS3 e MdGolS4 não permitiram detectar quaisquer sinais ou, ainda, sinais fracos que não puderam ser relacionados com o perfil transcricional previamente obtido. Estratégias alternativas, em nível proteico, para validar os níveis aumentados de transcritos de GolS anteriormente observados são discutidas. / Apple tree (Malus x domestica Borkh), one of the world’s most important fruit crops in temperate regions, is characterized by the cessation of visible growth during winter, a process called dormancy. Bud dormancy allows plant survival under low temperatures and it is crucial for the efficiency of apple production. The knowledge about the dormancy process, as well as its control mechanisms, became an essential approach to circumvent production losses either through management techniques or by the generation of new commercial varieties better adapted to each regional cultivation environment. The galactinol synthase (GolS) enzyme catalyzes the first step in the synthesis pathway of the raffinose family of oligosaccharides, whose accumulation in response to abiotic stress is well known. A previous work of our group allowed us to show contrasting transcript levels of four MdGolS during winter, suggesting a possible adaptative role for some of these genes during bud dormancy. The present work aims to quantify MdGolS protein accumulation in apical buds of the Fuji Standard apple tree cultivar in order to verify and associate with transcriptional profiles previously obtained. Polyclonal antibodies that recognize the four MdGolS produced to perform Western blot assays. Dot blot analysis revealed that the four sets of antibodies were specific to their respective peptides, without cross-reactions. Five protein extraction protocols were tested and optimized for obtaining greater amounts of proteins from apple apical buds. Two of these extracts were chosen to perform Western blot assays. Total protein was quantified using the Bradford method and 20 μg was found to be the most adequate for the assay. MdGolS1 antibody allowed the detection of signals in both extracts, but none in the expected protein mass, i.e., approximately 38 kDa. MdGolS2, MdGolS3 and MdGolS4 antibodies allowed us to detect only weak or no signals, that could not be correlated to the transcript profile previously obtained. Alternative strategies to validate the previously observed increased GolS transcript levels at the protein level are discussed.

A macieira (Malus x domestica Borkh.) é uma frutífera de clima temperado de grande importância econômica, e sua produtividade está diretamente relacionada à dormência. Além dos genes responsáveis pelo controle molecular, uma série de proteínas e metabólitos também é recrutada para proteger a integridade da gema dormente, destacando-se as desidrinas (DHN) e as enzimas galactinol sintases (GolS). As DHNs são proteínas que atuam na resposta adaptativa vegetal a estresses abióticos, enquanto que GolS são enzimas responsáveis pela síntese de galactinol, essencial à síntese de oligossacarídeos da família da rafinose (RFOs), os quais se acumulam em resposta a estresses abióticos. O objetivo do presente trabalho foi explorar a adaptação das gemas a condições de estresse a que são submetidas na dormência, visando identificar genes com potencial uso biotecnológico. Para tal, foram identificados e caracterizados os genes codificadores de DHNs e GolS no genoma da macieira por meio da utilização de ferramentas in silico para estudar a evolução, experimentos a campo e sob condições controladas, análises de expressão, localização subcelular, e geração de plantas transgênicas. As análises evolutivas sugerem que eventos de duplicação do genoma inteiro (WGD) foram responsáveis por moldar a evolução e diversificação dos genes GolS em macieira, enquanto que no caso das DHN eventos de duplicação em tandem e WGD nortearam a sua evolução. Nossos resultados sugerem que DHNs, galactinol e rafinose integram uma série de mecanismos que agem em conjunto durante a dormência a fim de proteger a integridade da gema, além dos carboidratos constituírem uma fonte de energia para a brotação. Ao longo da evolução, o aparecimento de novas estruturas e programas de desenvolvimento, tais como a gema e a dormência, necessitaram de adaptação de vias moleculares já estabelecidas, o que ajuda a explicar por que as dormências de gemas e de sementes compartilham rotas moleculares comuns. Finalmente, o gene MdDHN11 foi funcionalmente caracterizado e nossos resultados fornecem evidências de que MdDHN11 desempenha importantes papéis durante o desenvolvimento da semente de maçã, protegendo o embrião e o endosperma de alterações no status da água. Além disso, apenas a planta superexpressando MdDHN11 sobreviveu ao ensaio de simulação de seca, confirmando o potencial uso biotecnológico de DHNs de macieira no aumento da tolerância ao déficit hídrico. / Apple tree (Malus x domestica Borkh.) is a temperate fruit crop of great economic importance worldwide and its productivity is related to bud dormancy. Besides genes responsible for the molecular control of the process, a number of proteins and metabolites are also recruited to protect bud integrity, such as dehydrins (DHN) and galactinol synthases (GolS). DHNs are proteins that act on plant adaptive responses to abiotic stresses, while GolS are enzymes that catalyze for the synthesis of galactinol, an essential carbohydrate in the synthesis of raffinose family oligosaccharides (RFOs), which also accumulate in response to abiotic stresses. The objective of this work was to explore bud adaptation to stress conditions that occur during dormancy to identify genes with potential biotechnological applications. DHN and GolS genes were identified and characterized in the apple genome employing in silico tools, experiments under field and controlled conditions, expression analysis, subcellular localization assays, and the generation of transgenic plants. Evolutionary analyses suggest that whole genome duplication (WGD) events were responsible for shaping the evolution and diversification of GolS genes in apple, whereas WGD and tandem duplication events could be held accountable for DHN evolution. Our results suggest that DHNs, galactinol and raffinose integrate a series of mechanisms that act together during dormancy in order to protect bud integrity, besides the carbohydrates being an energy source for budbreak. During evolution, the appearance of new structures and developmental programs, such as buds and dormancy, required the adaptation of already established molecular pathways, partially explaining why bud and seed dormancy share common pathways. Finally, the MdDHN11 gene has been functionally characterized and our results provide evidences that MdDHN11 plays important roles during apple seed development by protecting the embryo and the endosperm from water deficit. Moreover, only the plant overexpressing MdDHN11 survived the water withholding assay, confirming the potential biotechnological use of apple DHNs in increasing tolerance to drought.