Avaluació geriàtrica en pacients nonagenaris: factors pronòstics, intervencions interdisciplinàries i eficàcia sobre la capacitat funcional Objectius: 1.Demostrar si els pacients nonagenaris milloren la seva capacitat funcional durant l’ingrés en una unitat de convalescència geriàtrica. 2.Identificar els factors pronòstics de guany funcional, de mortalitat i d’institucionalització. 3.Elaborar un instrument predictiu de guany funcional i fer una validació pilot del mateix instrument. Pacients i mètode: estudi prospectiu de 212 pacients nonagenaris (75,94% dones; edat mitjana 92,02 anys), que van ingressar en la unitat durant el període de 6 anys. A tots els pacients se’ls va fer una avaluació geriàtrica integral, un programa d’intervencions interdisciplinàries i quan va estar indicat un programa de rehabilitació (fisioteràpia i teràpia ocupacional). Variables registrades: edat, sexe, procedència, antecedents patològics, nombre de fàrmacs previs a l’ingrés i a l’alta, capacitat funcional prèvia (índex de Lawton i de Barthel), en el moment de l’ingrés i a l’alta (índex de Barthel), capacitat i característiques de la marxa prèvies i en el moment de l’alta, convivència i suport social previs, diagnòstic principal a l’ingrés, funció cognitiva (MMSE de Folstein), depressió (pregunta screening i GDS de Yesavage si procedia), estat nutricional (albúmina sèrica, colesterol plasmàtic total, ingesta alimentària), comorbiditat (índex de Charlson), presència de síndromes geriàtriques, complicacions durant l’ingrés i destinació a l’alta. La millora de la capacitat funcional es va avaluar mitjançant el càlcul del guany funcional relatiu o índex de Heinemann corregit (GFR-IHC) (adequat GFR-IHC ≥35%). Resultats: Cent vint-i-nou pacients van assolir un GFR-IHC ≥35% (62,62%). Factors relacionats amb guany funcional adequat: diagnòstic de fractura i/o lesió, millor funció cognitiva, millor estat nutricional i major ingesta alimentària; menys comorbiditat i menys complicacions durant l’ingrés, menys nombre i freqüència de síndromes geriàtriques (incontinència urinària, delirium, immobilitat). Divuit pacients van morir durant l’ingrés (8,49%). Factors relacionats amb la mortalitat: viure en família, pitjor funció cognitiva, pitjor estat nutricional i menor ingesta alimentària, més complicacions durant l’ingrés i la presència d’incontinència urinària, delirium, immobilitat i úlceres per pressió. Cinquanta-quatre pacients van ser institucionalitzats a l’alta (32,53%). Factors relacionats amb la institucionalització: deteriorament cognitiu previ, pitjor estat funcional previ i a l’ingrés, viure sol, pitjor situació cognitiva, menor ingesta alimentària, més complicacions durant l’ingrés, menys capacitat de marxa a l’alta, major nombre i freqüència de síndromes geriàtriques (úlceres per pressió, incontinència urinària, immobilitat i delirium). Variables relacionades amb un GFR-IHC ≥ 35% en una anàlisi multivariada: MMSE de Folstein ≥13 punts [OR=2,63;(p=0,011)]; albúmina plasmàtica ≥2,9 g/dl [OR=2,61;(p=0,017)]; ingressar per qualsevol malaltia que no sigui neurològica o vascular [OR=4,92;(p<0,001)] i l’absència de síndrome d’immobilitat [OR=5,62;(p<0,001)]. Amb les variables obtingudes en l’anàlisi multivariada, es va elaborar un instrument predictiu [pRognostic rEhabilitation InsTrument In NonAgenarian (REITINA)] [puntuació entre 0 i 6 (0 = molt baixa probabilitat de millorar la capacitat funcional; 6 = màxima probabilitat de millorar) (GFR-IHC ≥ 35%)]. Aquest intrument va ser validat en una segona cohort de pacients nonagenaris (cohort de validació). Els punts de tall de l’instrument ≥ 5 i 6 van obtenir una capacitat predictiva amb una sensibilitat 51,9% i 33,3%, i especificitat 78,9%, i 85,7%, respectivament (àrea sota la corba ROC = 0,675). La probabilitat pretest de guany funcional va ser 65,85%; puntuacions de 5 i 6 en l’instrument predictiu van obtenir probabilitats posttest de 83,33% i 81,81%, i quocients de probabilitat de 2,605 i 2,335, respectivament (impacte clínic alt). Conclusions: 1.Un nombre important de nonagenaris van millorar la seva capacitat funcional amb un GFR-IHC ≥ 35%. 2.L’avaluació geriàtrica i la història clínica habitual permeten identificar la major part dels factors predictius de guany funcional, mortalitat i institucionalització. 3.S’ha elaborat un instrument predictiu de guany funcional que permet identificar fàcilment els pacients nonagenaris amb més probabilitats de millora. / Geriatric assessment in nonagenarian patients: prognostic factors, interdisciplinary interventions and effectiveness on functional ability Objectives: 1.To prove whether nonagenarian patients improve their functional ability while admitted to a geriatric convalescence unit. 2. To identify the prognostic factors of functional gain, mortality and institutionalization at discharge. 3. To develop a functional gain predictive instrument and conduct a pilot validation study. Patients and method: prospective study of 212 nonagenarian patients (75.94% women; average age 92.02 years), who were admitted to the unit over a period of six years. An overall geriatric assessment of all the patients was performed, as well as a program of interdisciplinary interventions and, when indicated, a rehabilitation program (physiotherapy and occupational therapy). Variables: age, gender, referralsource, past medical history, number of drugs taken prior to being admitted and when discharged, previous functional ability (Lawton and Barthel indices), at admission and at discharge (Barthel index), previous walking ability and characteristics at discharge, cohabitation and previous social support, main diagnosis at admission, cognitive function (Folstein MMSE), depression (screening question and Yesavage GDS if necessary), nutritional status (seric albumin, total plasmatic cholesterol, food intake), comorbidity (Charlson index), presence of geriatric syndromes, complications during the stay in the unit. Functional improvement was assessed using the relative functional gain calculation or corrected Heinemann index (RFG-CHI) (adequate RFG-CHI ≥ 35%). Results: One hundred and twenty nine patients obtained a RFG-CHI ≥ 35% (62,62%). Factors associated with adequate functional gain: fracture and/or injury diagnosis, better cognitive function, better nutritional status and increased food intake; less comorbidity and fewer complications during the stay in the unit, less frequency and fewer number of geriatric syndromes (urinary incontinence, delirium, immobility). Eighteen patients died during the study (8.49%). Factors associated with mortality: living with the family, lower cognitive function, worse nutritional status and reduced food intake, more complications during hospitalization and the presence of urinary incontinence, delirium, immobility and pressure ulcers. Fifty-four patients were institutionalized at discharge (32.53%). Factors associated with institutionalization: previous cognitive and functional impairment, living alone, lower cognitive function, reduced food intake, more complications during hospitalization, reduced walking ability at discharge, higher number of and more frequent geriatric syndromes (pressure ulcers, urinary incontinence, immobility and delirium). Variables associated with a RFG-CHI ≥ 35% in a multivariate analysis: Folstein MMSE ≥ 13 points [OR=2.63; (p=0.011)]; plasmatic albumin ≥ 2.9 g/dl [OR=2.61; (p=0.017)]; admitted for any non-neurological/vascular disease [OR=4.92; (p<0.001)] and absence of immobility syndrome [OR=5.62; (p<0.001)]. With the variables obtained in the multivariate analysis, a predictive instrument was devised [pRognostic rEhabilitation InsTrument In NonAgenarian (REITINA)] [score between 0 and 6 (0 = very low probability of improving the functional ability; 6 = maximum probability of improving) (RFG-CHI ≥ 35%)]. This instrument was validated in a second cohort of nonagenarian patients (validation cohort). The instrument cut-off points ≥ 5 and 6 obtained a predictive ability with a sensitivity of 51.9% and 33.3%, and a specificity of 78.9%, and 85.7%, respectively (area under the ROC curve = 0.675). The pre-test probability of functional gain was 65.85%; scores of 5 and 6 in predictive instrument scored post-test probabilities of 83.33% and 81.81%, and likelihood ratios of 2.59 and 2.33, respectively (high clinical impact). Conclusions: 1. A high number of nonagenarians improved their functional ability with a RFG-CHI ≥ 35%. 2. The geriatric assessment and the usual clinical history make it possible to identify most of the predictive factors of functional gain, mortality and institutionalization. 3. A functional gain predictive instrument has been constructed which allows to identify easily the nonagenarian patients with more probabilities of functional improvement

Introducción: El ductus arterioso (DA) es la anomalía cardiovascular más frecuente en prematuros y se ha asociado con alteración de la perfusión regional con el subsiguiente riesgo de daño cerebral, insuficiencia renal y/o enterocolitis necrotizante (ECN) debido al cortocircuito izquierda derecha a través del mismo. La espectroscopia cercana al infrarrojo (NIRS) es una técnica no invasiva utilizada a pie de incubadora que se utiliza para monitorizar de forma continua la saturación regional mixta de oxígeno (rSO2). Objetivos: Analizar la factibilidad y la utilidad de la tecnología NIRS para identificar prematuros con DA en riesgo de hipoperfusión cerebral y mesentérica, así como estimar el efecto del tratamiento con ibuprofeno. Métodos: Estudio clínico prospectivo observacional en el que se reclutaron prematuros de <32 semanas de gestación de consecutivamente. Todos los pacientes se incluyeron antes de las 48 horas de vida y se monitorizaron mediante NIRS (modelo INVOS 5100). La presencia de DA fue estimada mediante ecocardiografía. Se consideró DA hemodinámicamente significativo (DAhs) cuando el diámetro transductal fue >1,5 mm y además presentaba flujo diastólico reverso en aorta descendente (DAo). Realizamos un análisis Bland-­‐Altman para estimar la repetibilidad intraobservador de la tecnología NIRS. El estudio fue aprobado por el Comité de Ética e Investigación del HUiP La Fe y los representantes legales firmaron el consentimiento informado. Resultados: Se reclutaron 72 prematuros. La media diaria de rSO2 en cada región evaluada se representó en función del tiempo. Se identificó un patrón evolutivo característico en cada región con el paso de los días y según la edad gestacional (EG). Los resultados mostraron cifras de tensión arterial (TA) menores y una menor oxigenación tisular regional tanto cerebral como mesentérica así como una fracción de extracción de oxígeno mayor (FOE) en presencia de DAhs. Se encontró una relación significativa entre el flujo diastólico reverso en DAo y rSO2M que permaneció significativa tras controlar el tamaño ductal. El efecto del tamaño ductal en la oxigenación tisular regional se estudió en modelos de regresión. Las cifras menores de rSO2 se observaron en pacientes con un gran DAhs con un patrón evolutivo diferente según la región explorada. Además, tras el tratamiento con ibuprofeno, se observó un aumento significativo de la rSO2C sin que hubiera efecto negativo adicional en la rSO2M como se demuestra por la estabilidad en los valores de rSO2M y FOE. Conclusiones: Este estudio confirma que la monitorización continua mediante NIRS en nacidos prematuros durante periodos prolongados, en diversas regiones simultáneas, es factible, segura y reproducible. En la práctica clínica se utilizan hallazgos clínicos junto con la ecocardiografía para estimar la repercusión hemodinámica. Hipoperfusión e hipoxia pueden contribuir al desarrollo de ECN de modo que hipotetizamos que la tecnología NIRS (junto con otros métodos) puede ser útil en la identificación de prematuros con robo ductal en DAo y, por tanto, en riesgo de hipoperfusión intestinal. La tecnología NIRS proporciona una evaluación más exhaustiva del DA y puede ayudar a diferenciar un DAhs de un espectador inocente. Además, nuestro estudio muestra que el tratamiento con ibuprofeno no tiene efecto negativo adicional en la oxigenación regional. Finalmente, hemos identificado patrones evolutivos de rSO2 según la edad postnatal y la EG diferentes según el territorio explorado. Estos cambios en la línea de base con el paso del tiempo pueden representar la maduración del control fisiológico de la entrega y utilización de oxígeno en los lechos vasculares regionales. Una limitación de nuestro estudio fue que los clínicos no estuvieron enmascarados para los valores de rS02. Sin embargo, el investigador principal no estuvo implicado en el cuidado clínico de los pacientes. / Introduction: Presence of a haemodynamically significant ductus arteriosus (hsDA) is the most common cardiovascular abnormality in preterm infants. Left to right shunting through hsDA has been associated with impaired regional perfusion and as a consequence development of brain injury, renal insufficiency and necrotizing enterocolitis (NEC). Near infrared spectroscopy (NIRS) is a non-­‐invasive, bedside technique, which can be used to monitor, mixed regional saturation (rS02). Objectives: To analyse the feasibility and utility of NIRS in identifying VLBW infants who are at risk of cerebral or mesenteric hypo-­‐perfusion in association with hsDA and its treatment with ibuprofen. Methods: This is a prospective observational clinical study in which consecutively admitted preterm infants with gestational age (GA) < 32 weeks’ gestation. All patients were enrolled before 48 hrs of life and monitored using an INVOS 5100 NIRS device. Presence of DA was routinely confirmed by echocardiography. PDA was considered haemodynamically significant when the transductal diameter was >1,5 mm and reversal diastolic flow in the abdominal aorta (DAo) was present. Statistical analysis including Bland Altman plots was performed to assess NIRS intraobserver repeatibility. The IRB of HUiP La Fe approved the study protocol and consent was signed by parents of all participants. Results: A total of 72 preterm infants were enrolled. The daily mean rSO2 for preterm infants was determined in cerebral and mesenteric sites for each group and plotted against time. We identified a differential temporary baseline rSO2 by postnatal and gestational age (GA). The results of our study show lower blood pressures during an hsDA and a lower regional cerebral and splanchnic oxygenation with an increased oxygen extraction (FOE). There was a significant relationship between reversal diastolic flow in the DAo and the rS02M, which remained significant after controlling for ductal size. The effect of the ductal size on regional tissue oxygenation was studied in general regression models. The lowest rS02 was seen in infants with a large hsDA with a different evolving pattern with respect of the studied area. Furthermore, subsequent treatment with ibuprofen caused a sustained increase in rS02-­‐C but had no further negative effect on splanchnic oxygenation, as indicated by the stable rSO2M and FOE values. Conclusions: This study confirms that continuous, long-­‐term, multisite monitoring of NIRS in premature infants is both safe and feasible. Clinical and echocardiography markers are normally used to assess haemodynamic significance in the clinical practice. Hypoperfusion and hypoxia may contribute to the developmental of NEC, so we hypothesized that NIRS (as an adjunct to other methods) could be useful in identifying infants with systemic steal from the DAo and therefore be at risk for intestinal hypo-­‐perfusion. NIRS technology provides a more comprehensive appraisal of the ductus, which may facilitate differentiating an hsDA from the innocent bystander ductus. Moreover, our study also showed that ibuprofen treatment had no further negative effect on regional oxygenation. Finally, we have identified temporal trends in rS02 with postnatal age and GA, and distinct rS02 patterns in cerebral and mesenteric tracts. These changes in the rS02 baseline over time may represent developmental maturation of the physiological control of oxygen delivery and utilization at regional organ vascular beds. Limitations to our study include that clinicians were not blinded to saturation values; however the principal investigator was not implicated in the clinical practice.

Un dels principals problemes en el camp del trasplantament clínic actualment és la seva escassetat d'òrgans; el xenotrasplantament és contempla com una possible alternativa. El propòsit d'aquesta tesi és incrementar els coneixements en aquest camp. Els objectius marcats són: en primer lloc dissenyar una pauta immunosupressora el menys agressiva possible, que ens permeti obtenir supervivències indefinides del xenoempelt hepàtic en la combinació concordant hàmster-rata. En segon lloc la valoració dels canvis a llarg termini del sistema immunològic que es poden apreciar en la sang perifèrica dels receptors i comparar-los amb els que es donen en una situació equivalent d'al·lotrasplantament. La caracterització histològica dels empelts a llarg termini. Caracteritzar i valorar els canvis que experimenta la cascada de la coagulació de la rata a diferents moments postrasplantament ja que el donant és de diferent espècie. Un cop aconseguit un estat "protolerant" amb dosis baixes d'anticalcineurínics, redissenyar i valorar la pauta immunosupressora per tal de poder aconseguir la tolerància de l'empelt hepàtic amb l'administració d'un immunomodulador com és l'antagonista del PAF UR-12670 i Avaluar-ne els canvis histològics. I finalment aprofundir en el coneixement dels antígens contra els que van dirigits els xenoanticossos.Les principals conclusions a que s'han arribat són que en el model de xenotrasplantament hepàtic ortotòpic hàmster-rata, es poden aconseguir supervivències indefinides en monoteràpia amb Tacrolimus a dosis baixes sense que es manifesti cap signe de rebuig i amb una correcta funció de l'empelt. S'ha vist que l'increment de la subpoblació de limfòcits T CD4+CD45RC- i la presència de gran quantitat de cèl·lules B (i no cèl·lules plasmàtiques) en els empelts de les rates xenotrasplantades, juntament amb el bon estat general dels animals, una preservació total de la histologia, una bona funció hepàtica, un equilibri de l'status hemostàtic acompanyat d'uns nivells molt baixos d'immunosupressió, ens fa assegurar que en aquests animals s'està donant un procés d'acceptació indefinida de l'empelt que anomenem "protolerant". Que els canvis de les proporcions i del nombre total de cada subpoblació limfocitària en sang perifèrica són bons indicadors del que està succeint a l'empelt i no s'observen diferències entre al·lotrasplantament i xenotrasplantament. En el model utilitzat de xenotrasplantament hepàtic es produeix una activació de la trombosi en els primers dies postrasplantament deguda a un desequilibri general com a conseqüència del recanvi de tots els components de síntesi hepàtica, però que no comporta més problemes perquè és corregida amb el temps i l'animal receptor adopta el perfil de paràmetres hemostàtics de l'espècie donant. L'administració continuada de l'antagonista del PAF UR-12670 a una dosi de 20 mg/kg no és suficient per perllongar la supervivència de l'empelt i induir tolerància. Tanmateix modula la resposta cel·lular, redueix la infiltració leucocitària, condiciona les subpoblacions limfocitàries infiltrants al parènquima, té un efecte citoprotector sobre els hepatòcits i millora l'estat general de l'empelt suggerint la implicació del PAF en el rebuig tardà del xenoempelt (LXR). I finalment podem dir que en el model de xenotrasplantament hepàtic hàmster-rata no es dóna un canvi d'especificitat dels anticossos d'isotip IgM a diferents dies postrasplantament. Així mateix, aquests anticossos polireactius de l'isotip IgM presents al sèrum de les rates xenotrasplantades a diferents dies postrasplantament no són específics d'espècie.

El glutamat i el GABA són, respectivament, el principal neurotransmissor excitador i inhibidor del sistema nerviós central. Un balanç incorrecte entre aquests dos sistemes de neurotransmissors pot conduir a estats patològics. L'excés de glutamat extracel·lular produeix neurotoxicitat per un mecanisme dependent de l'entrada de Ca2+ a través del receptor NMDA de glutamat. Aquest fenomen es coneix amb el nom d'excitotoxicitat. El paper del neurotransmissor GABA en el procés d'excitotoxicitat no és clar. Si bé alguns treballs descriuen que l'increment de la neurotransmissió GABAèrgica resulta protectora de l'excitotoxicitat, d'altres descriuen el cas contrari.L'exposició aguda al plaguicida organoclorat dieldrín produeix, en humans i en animals d'experimentació, síndrome d'hiperexcitabilitat, produint convulsions que poden arribar a causar la mort de l'organisme. Aquest efecte s'explica per l'acció antagonista del dieldrín en el receptor GABAA. Aquest plaguicida ja no s'utilitza en països desenvolupats. Tot i això, degut a l'elevada persistència i bioacumulació del dieldrín, i a què encara s'utilitza en països subdesenvolupats i que té una gran capacitat de viatjar llargues distàncies, a dia d'avui la població general de tot el món continua exposada a aquest plaguicida. Així, actualment, el dieldrín es considera un "contaminant orgànic persistent" (COP). Si bé es coneixen els efectes aguts de l'exposició a dieldrín, no estan clars quins efectes adversos sobre el sistema nerviós central podria produir l'exposició perllongada a baixes concentracions de dieldrín.En aquesta tesi es desenvolupa un model d'excitotoxicitat en cultius primaris de cèl·lules granulars de cerebel, basat en l'alliberament de glutamat endogen. En aquest model s'estudia la implicació del receptor GABAA i d'altres canals de clorur en la mort excitotòxica. Es descriu que l'entrada de clorur a través del receptor GABAA i de canals de clorur dependents d'àcid niflúmic incrementa l'excitotoxicitat. A més, s'estudien els efectes de concentracions subcitotòxiques de dieldrín sobre els sistemes GABAèrgic i glutamatèrgic en cultius de cèl·lules granulars de cerebel exposats durant períodes perllongats. Es descriu que el bloqueig parcial del receptor GABAA induït pel dieldrín, produeix una resposta compensatòria en els receptors NMDA de glutamat (disminució), de manera que quan s'exposen els cultius a l'estímul excitotòxic prèviament descrit, no es produeix excitotoxicitat. Els resultats obtinguts en aquesta tesi indiquen que el receptor GABAA és una diana preferencial de l'acció neurotòxica del plaguicida organoclorat dieldrín. Com a treball annex, es discuteix la utilització dels cultius primaris reagregats de cervell com a model in vitro en estudis de neurotoxicitat. / "Implication of glutamatergic and GABAergic systems in the mechanism of excitotoxicity in cerebellar granule cell culture. Alterations of these systems by the Persistent Organic Pollutant dieldrin".TEXT:Glutamate and GABA are, respectively, the main excitatory and inhibitory neurotransmitters in the central nervous system. An imbalance between these systems might produce a pathological state. An excess of extracellular glutamate produces neurotoxicity by a mechanism dependent on a Ca2+ influx through the NMDA receptor. This phenomenon is known as excitotoxicity. The role of the GABA neurotransmitter in the excitotoxicity process in not clear. While, some authors describe that an increment in the GABAergic neurotransmission results in neuroprotection from the excitotoxicity, other authors describe the other way round.The acute exposure to the organochlorine pesticide dieldrin produces an hiperexcitability syndrome. This effect is due to the GABAA antagonist action of dieldrin. This pesticide is not longer used in developed countries. Nevertheless, nowadays people all over the world are exposed to this pesticide due to the utilization in developing countries, the high capacity of dieldrin to travel long distances and the high persistence and bioaccumulation of this compound. Actually, we now refer to dieldrin as a Persistent Organic Pollutant (POP). Although the effects of the acute exposure to dieldrin are well documented, there is a lack of information about the effects of chronic exposure to lower concentrations of this contaminant. In this thesis an excitotoxicity model based in the release of the endogenous glutamate is developed in primary cultures of cerebellar granule cells. With this model we study the implication of the GABAA receptor and other chloride channels in the excitotoxic mechanism. It is described that the chloride influx through the GABAA receptor and through niflumic acid sensitive chloride channels increases excitotoxicity. The effects of subcitotoxic concentrations of dieldrin on GABAergic and glutamatergic systems in primary cultures of cerebellar granule cells exposed for long periods are also studied. We describe that the partial block of the GABAA receptor produced by dieldrin, produces a compensatory response in the NMDA receptors (decrease). The decrease of the functional NMDA receptors makes the cultures insensitive to the excitotoxicity induced by released glutamate. The results obtained in this thesis indicate that the GABAA receptor is an important target when considering the neurotoxic effects of dieldrin.

La mayoría de los estudios sobre la activación glial utilizan cultivos puros o mixtos de células gliales, y en general, los agentes que se emplean para inducirla ejercen directamente sobre las células gliales. En contraste, hay pocos trabajos donde se considere la muerte neuronal como el estímulo que se desencadena la activación glial. Se desconoce la señal que desencadena la activación glial en respuesta al daño neuronal, pero se sugiere que tanto alteraciones en los contactos neurona-glía como la presencia de determinados factores solubles secretados por las neuronas dañadas pueden jugar un papel importante en este proceso. En este trabajo se profundizó en el conocimiento del papel de la glía en respuesta al daño neuronal y del proceso de activación glial desencadenado por dos modelos de muerte neuronal: la muerte neuronal por excitotoxicidad mediante concentraciones elevadas de glutamato y la muerte neuronal por apoptosis mediante la deprivación de K+ del medio de cultivo. Se ha comprobado que las células gliales de cultivos neurona-glía de cerebelo responden al daño neuronal con cambios funcionales asociados con una activación glial, tal como ocurre in vivo. Sin embargo, aunque en los dos modelos experimentales de daño neuronal utilizados (excitotoxicidad y apoptosis) se produce la muerte de la mayoría de las neuronas a las 24 h, hay diferencias en la respuesta de los distintos parámetros gliales evaluados en función del tipo de muerte neuronal inducida. En respuesta a la muerte neuronal por excitotoxicidad, en las células gliales hay producción o activación de factores relacionados con una respuesta proinflamatoria, incrementan su proliferación y su actividad fagocítica. En respuesta a la muerte neuronal por apoptosis las células gliales no producen moléculas proinflamatorias ni proliferan, pero su actividad fagocítica se induce de manera más rápida que en el modelo de excitotoxicidad. En este caso, la activación glial queda restringida a la detección y eliminación de las neuronas dañadas sin que haya producción de factores que puedan amplificar la activación glial y transformarla en nociva. Los resultados obtenidos muestran que el estado en que se encuentran las células gliales puede tener un papel importante en la respuesta neuronal a estímulos nocivos. Esto podría ser de gran importancia para el diseño de estrategias que permitan potenciar aquellas propiedades protectoras de las células gliales activadas o inhibir aquellas que son nocivas para las neuronas, con la finalidad de favorecer los mecanismos de neuroprotección ante un determinado estímulo nocivo. / In physiological conditions, glial cells play a key role in the normal function of the central nervous system (CNS) both during development and in the adult. Moreover, they are essential to the response of the CNS to pathological conditions. Astroglial and microglial cells respond to neuronal damage with morphological and functional changes and thus become reactive or activated glial cells. Given the complexity of studying glial activation in vivo, numerous authors have approached the subject using in vitro experimental models. However, most experimental approaches use glial cell cultures, and/or the stimulus used to induce glial activation is an in?ammatory agent or a mixture of cytokines that have a direct effect and cause signi?cant modi?cations of glial cells. In contrast, comparatively few studies have addressed glial activation in the presence of neurons employing neuronal damage as the inducing stimulus. The nature of the signal that induces glial activation in response to neuronal damage remains unknown, although direct contact between neuronal and glial cells as well as soluble factors delivered by the damaged neurons probably play an important role.In the present work, we have studied glial activation occurring in cerebellar neuronal-glial cell cultures in response to different forms of neuronal death. First, these neuronal-glial cultures were exposed to a high concentration of glutamate, which induces excitotoxic neuronal death. Second, we exposed cerebellar neuronal-glial cultures, which need to be cultured in a medium containing a high concentration of K+ (25 mM K+), to serum-free medium containing a normal concentration of K+ (5 mM K+), a well established and widely used model of apoptosis in cerebellar granule neurons.Our results show that glial cells in neuronal-glial cultures respond to neuronal damage with functional changes associated with glial activation, as occurs in vivo. However, the pattern of response differs depending on the kind of damage induced in the neurons. Although the two experimental models of neuronal damage used (excitotoxicity and apoptosis) resulted in the death of most neuronal cells after 24 h, differences were observed in the response of the various glial parameters evaluated.In the presence of excitotoxic neuronal death, glial cells increase their production of agents associated with an in?ammatory response, as well as proliferate and become phagocytic. This appears to be a drastic reactive response of glial cells that, on the one hand, clears the extracellular milieu of any neuronal debris or factors released by the dying neurons that may negatively affect the cellular homeostasis, and on the other, results in the production of factors that in turn can be deleterious for the remaining live cells. In contrast, glial cells do not produce pro-in?ammatory molecules in the presence of apoptotic neuronal death, but phagocytic activity is quickly induced. In this case, glial activation appears to constitute a preventative response resulting from a crosstalk between dying neuronal cells and glial cells, aimed at preventing alterations in the extracellular milieu through the release of injuring factors by dying neurons, as well as limiting the glial response as much as possible.Our results show that the response of neurons to a certain stimulus depends on the presence of glial cells. Our results also show that different aspects of glial activation are independently regulated in response to neuronal damage. It would be of interest to identify the different signal transduction pathways involved in each case. In this way, it may be possible to speci?cally interfere with individual aspects of glial activation in order to favour actions of reactive glial cells that could help neurons to overcome a negative stimulus and, likewise, to inhibit activities that enhance neuronal damage.

Ante el hallazgo de Rane et.al (1999) que la Cdk4 es esencial para la proliferación post-natal de la célula beta y de que su hiperactividad (modelo Cdk4R24C) causa hiperplasia de las células beta, las hipótesis de trabajo planteadas fueron: 1. A pesar del efecto de la molécula Cdk4 en la proliferación de la célula beta, la hiperactividad de la Cdk4 no debe alterar la fisiología del islote.2. La molécula Cdk4 puede estar implicada en la proliferación de las células beta de los islotes pancreáticos humanos, del mismo modo que ocurre en los ratones. Si éste es el caso, la Cdk4 constituiría una diana terapéutica potencial en el proceso de regeneración de la masa beta-celular, para el tratamiento de la diabetes mellitus tipo 1.3. La hiperplasia beta celular provocada por la molécula Cdk4R24C induce tolerancia inmunológica hacia los autoantígenos pancreáticos de la DMT1 en la cepa NOD, y al mismo tiempo, provee al organismo de una fuente de regeneración de la masa beta-celular ya destruida a partir de las células beta aún existentes. De esta forma, la hiperplasia de la masa beta-celular inhibe el proceso autoinmune y repara el daño ocasionado por el mismo.Los resultados obtenidos se resumen a continuación:1. La hiperplasia de la célula beta pancreática no provoca cambios ni en la glicemia ni en la insulinemia de los ratones Cdk4R24C CD1/129Sv. 2. La mutación Cdk4R24C en un background CD1/129Sv no provoca cambios fisiológicos destacables (biosíntesis y conversión de proinsulina a insulina y oxidación/utilización de glucosa) en la célula beta, a pesar de la hiperplasia pancreática que provoca. 3. Los ratones Cdk4R24C CD1/129 tienen un retorno más rápido a los niveles basales de glicemia después de un estímulo intraperitoneal de glucosa, debido a una mayor secreción de insulina. 4. Los islotes humanos infectados con vectores lentivirales portadores de la mutación Cdk4R24C tienen una mayor proliferación, y esta proliferación es debida al aumento de proliferación de la célula beta.5. La mutación Cdk4R24C en un fondo genético de susceptibilidad a padecer DMT1 (NOD), provoca una aceleración de la diabetes tanto en los machos como en las hembras Cdk4R24C NOD y un aumento de incidencia de la enfermedad en los machos.6. La aceleración y aumento de la incidencia en machos es debida a la mayor proliferación de los linfocitos procedentes de nódulos linfáticos frente al péptido de insulina B12-25, una mayor activación de los esplenocitos, un aumento de la proliferación basal de los esplenocitos y una disminución de la susceptibilidad a la apoptosis.7. La aceleración de la diabetes en hembras es debida a una proliferación superior de los esplenocitos frente al péptido GAD p65, unos niveles superior de CD3 en su superficie, un número superior de células CD4 activadas y un aumento de los niveles de la proteína GFAP en el páncreas de las hembras Cdk4R24C/R24C. 8. En el modelo Cdk4R24C NOD/SCID, con ausencia de linfocitos T y B, la mutación R24C disminuye la incidencia acumulativa de diabetes por transferencia adoptiva de linfocitos de animales pre-diabéticos WT, pero no retrasa su aparición.Ante estos resultados podemos concluir que:1. La expresión de la Cdk4R24C en un background CD1/129Sv no provoca cambios fisiológicos destacables en los islotes pancreáticos. 2. La forma mutada de la proteína Cdk4 (Cdk4R24C) induce una proliferación de la célula beta humana dependiente de glucosa. 3. La expresión ubicua de la Cdk4R24C en un fondo genético NOD, predispuesto genéticamente a padecer DMT1, exacerba el fenotipo diabético. Dicha exacerbación es debida a la hiperactividad del repertorio inmunológico ocasionada por la presencia de la mutación R24C.4. La expresión de la Cdk4R24C en la célula beta, con ausencia de linfocitos T y B mutados, protege del ataque autoinmune por transferencia de linfocitos WT.

La adiponectina es una adipocitoquina sintetizada y secretada exclusivamente por el tejido adiposo. Actúa en diversos órganos y tiene propiedades anti-diabéticas y anti-aterogénicas, además de ser una de las hormonas con mayores propiedades sensibilizadoras de la insulina. La adiponectina ejerce sus efectos en el metabolismo de la glucosa y los lípidos a través sus receptores, adipoR1 y adipoR2. En el primer trabajo se demostró que la expresión de adipoR1 en IAAT no estuvo alterada en obesidad ni diabetes en tejido adiposo intraabdominal humano y se correlacionó con los niveles plasmáticos de FFA, mientras que la expresión de adipoR2 en IAAT se encontró disminuida en obesidad y diabetes en tejido adiposo intraabdominal humano y se asoció con componentes metabólicos implicados en el desarrollo de la enfermedad cardiovascular en la obesidad. Dada la importancia de la expresión de adiponectina y sus receptores, así como también de otras adipocitoquinassecretadas por el adipocito maduro en la patogenia de la obesidad y la diabetes, entender los mecanismos epigenéticos de la activación transcripcional en la diferenciación fue el objetivo de nuestro segundo estudio. Para esto examinamos las modificaciones pos-traduccionales de la histona H3 en los promotores de genes adipogénicos claves tanto de expresión temprana como tardía durante todo el proceso de la adipogenesis.Mediante el uso de la técnica de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP), realizados en células 3T3-L1 en diversos días durante el proceso de diferenciación adipocitaria, demostramos que los promotores de adiponectina, glut4, gpd1 y leptina están enriquecidos en dimetilación de H3-K4 en el día 0 de diferenciación (D0), cuando ninguno de estos genes está aún expresado. Un estudio detallado del locus de adiponectina reveló que la dimetilación de H3K4 en estas células indiferenciadas está limitada en la región promotora, donde se encontró además asociada con ocupación de la RNA pol II. El inicio de la transcripción de adiponectina, coincide con la hiperacetilación de H3 (D3-4) y con la trimetilación de H3K4 en la región promotora de la misma (D2-3). Este mismo patrón de modificación de histonas se observó en células primarias de ratón pero no en fibroblastos de ratón 10T/2, que aún no está comprometida hacia la línea adipogénica. La inhibición parcial de la dimetilación en H3K4 mediante el tratamiento con el inhibidor resultó en una disminución de la expresión de apM1, así como también en una disminución en la adipogénesis, detectada por una disminución en la incorporación de lípidos. En resumen, el segundo trabajo de esta tesis, muestra que la dimetilación en H3K4 y el reclutamiento de la RNA polII en los promotores de genes adipogénicos claves son marcas distinguibles de células que están determinadas y se han comprometido hacia la línea celular adipogénica. Estas mismas marcas, están ausentes en las mismas regiones de los promotores, en células pluripotenciales que representan un paso previo en el proceso de diferenciación desde células totipotenciales a adipocitos maduros y en los promotores de genes que se encuentran silenciados y no se expresan en células determinadas hacia la línea adipogénica (3T3-L1). En adipocitos diferenciados, la transcripción activa de estos genes es acompañada por hiperacetilación en H3, di y trimetilación en H3K4, así como también la extensión de estas modificaciones hacia las regiones codificantes del gen. La dimetilación en H3K4 es necesaria para la expresión génica de adiponectina, así como también para el desarrollo de una normal diferenciación adipocitaria. No obstante, son necesarios más estudios para dilucidar cuales son los factores de transcripción y cofactores necesarios en el establecimiento de dicho patrón.

L'increment de la prevalença de l'obesitat durant les últimes dècades conjuntament amb el limitat efecte sobre la perduda de pes corporal, així com els diversos efectes adversos produïts pels tractaments actualment disponibles, impliquen la necessitat de trobar noves aproximacions terapèutiques al tractament d'aquesta malaltia. El tungstat sòdic s'ha mostrat com un nou i potencial agent per al tractament de l'obesitat, mitjançant l'increment de la despesa energètica i la reducció del guany ponderal com s'ha observat en rates amb obesitat induïdes per la dieta. A causa del paper clau de la leptina com citocina reguladora de l'homeòstasi energètica, l'objectiu d'aquest estudi ha estat la determinació de la implicació de la leptina en l'efecte reductor de guany ponderal del tungstat.El tractament amb tungstat en models deficients en la leptina o el receptor de la leptina, perd el seu efecte sobre la reducció del pes corporal i de la ingesta, i sobre l'increment de la despesa energètica. Els ratolins ob/ob trasplantats amb teixit adipós de ratolins control, recuperen parcialment els nivells circulants de leptina, el que provoca un reducció del pes corporal i la ingesta, a més d'un increment en la despesa energètica. Aquests efectes en els ratolins trasplantats es van veure magnificats com a conseqüència del tractament amb tungstat. Els animals sense deficiències en la sistema de senyalització de la leptina també redueixen la ingesta i el pes corporal i incrementen la despesa energètica en resposta al tungstat, i a quests efectes estan acompanyats de canvis en el perfil d'expressió gènica en el teixit adipós marró, contràriament al que s'observa en els animals amb deficiències en leptina, en els que no hi ha canvis en el teixit adipós marró.L'expressió hipotalàmica dels gens Npy, Agrp i Cart, involucrats en la regulació de l'homeòstasi energètica mitjançant la leptina, està modificada pel tractament amb tungstat d'una forma depenent a la leptina. Aquests resultats indiquen que el tungstat es comporta com un potenciador de l'acció de la leptina per a reduir la ingesta i incrementar la termogènesis mitjançada pel teixit adipós marró, promovent la reducció del guany ponderal i l'adipositat. A més l'acció del tungstato està mitjançada, com a mínim en part, per la potenciació dels efectes de la leptina en l'hipotàlem. / The worldwide increasing prevalence of obesity last decades and the limited effects on body weight (BW) loss as well as several adverse effects of current available treatments, implies the necessity to find new approaches to treat this disease. Sodium tungstate has been evidenced as a potential novel agent to treat obesity, by increasing energy expenditure and reducing BW gain in diet induced obese (DIO) rats. Since leptin is a key regulator of energy homeostasis, the aim of the current study was to determine the implication of this adipocytokine on tungstate antiobesity effects. Tungstate treated leptin deficient animals did not change BW, food intake (FI) or whole-body energy expenditure (EE). Wild-type adipose tissue transplanted ob/ob mice partially restored circulating leptin levels leading to a reduction of BW, FI, and an increase of EE. Magnified effects were recorder in these animals with tungstate treatment. Animals with no deficit in the leptin signaling system also reduced FI and BW and increased EE in response to tungstate, acompanied with gene expression changes in brown adipose tissue (BAT), in contrast to leptin deficient animals in which no BAT changes were detected. Hypothalamic Npy, Agrp and Cart gene expression, involved in leptin regulation of energy homeostasis, were modified by tungstate in a leptin-dependent manner. These results indicate that tungstate behaves as an enhancer of leptin actions to reduce FI and increase BAT mediated thermogenesis, promoting the reduction of BW gain and adiposity. Furthermore tungstate actions are partially mediated by enhancing the hypothalamic leptin effects.

La memoria titulada "Estudio de los mecanismos implicados en la neurodegeneración estriatal en modelos murinos de la enfermedad de Huntington" ha perseguido determinar la implicación de las neurotrofinas endógenas BDNF y la NT-3 en la susceptibilidad de las neuronas estriatales en modelos transgénicos y excitotóxicos de la enfermedad de Huntington, estudiar la implicación de los agregados intraneuronales y de la excitotoxicidad mediada por los receptores NMDA en modelos transgénicos de la enfermedad de huntington y analizar el potencial de dos aproximaciones terapéuticas para la enfermedad de Huntington basadas en la administración de BDNF intra-estriatal o en el silenciamiento del gen causante de la patología. En dicha memoria se han empleado modelos murinos de la enfermedad de Huntington, el modelo excitotóxico y diversos modelos transgénicos con alteraciones específicas de los niveles de BDNF o la NT-3, ratones condicionales de la huntingtina mutada, así como también cultivos primarios y de precursores neuronales estriatales. Los resultados se han presentado como 3 artículos científicos originales publicados en revistas indexadas ("The Journal of Neuroscience" y "Neuroscience") y un artículo original en fase de preparación. Además, se ha realizado una discusión conjunta de los resultados presentados en los diferentes artículos científicos cumpliendo completamente con lo objetivos planteados. En conjunto, los resultados aportan datos relevantes que ayudan a entender la fisiopatología de la enfermedad de Huntington y la fisiología de las neuronas estriatales. En esta tesis se ha determinado que la disminución de los niveles de neurotrofinas afecta diferencialmente la susceptibilidad de las neuronas estriatales en modelos murinos y excitotóxicos de la enfermedad de Huntington. Así, el BDNF es el factor que modula el inicio y la severidad de la alteraciones motoras asociados a la degeneración selectiva de las neuronas estriatales de proyección en el modelo transgénico R6/1. Por su parte es la NT-3 el factor neurortófco que modula la susceptibilidad excitotóxica de las neuronas estriatales al regular la expresión de los receptores de glutamato tipo NMDA. Además, se ha demostrado que la toxicidad de los agregados intraneuronales presentes en los modelos transgénicos de la enfermedad de Huntington podría depender de su ubicación y el grado de empaquetamiento de la huntingtina dentro del agregado, puesto que dos modelos con el mismo número de agregados estriatales difieren significativamente en el grado de neuropatología estriatal. Además, se logró la reversión total de la patología en un modelo transgénico condicional a pesar de la presencia de agregados de tipo amiloideo, sugiriendo que este tipo de agregados no constituyen la especie más tóxica de la huntingtina mutada. Por último, se ha demostrado que los tratamientos basados en la administración del BDNF o en el silenciamiento del gen de la huntingtina mutada son capaces de revertir ciertas alteraciones neuropatológicas y funcionales de las neuronas estriatales en modelos transgénicos de la enfermedad de Huntington, apoyando la hipótesis de que estas herramientas constituyen alternativas terapéuticas efectivos para la enfermedad de Huntington.

El pàncreas és una glàndula amb una porció tant endocrina com exocrina que regula l'absorció, emmagatzematge i utilització dels nutrients digerits. Concretament, les cèl·lules beta són les responsables del manteniment dels nivells de glucosa de l'organisme, i en el cas de malalties com la diabetis mellitus tipus 1 són destruïdes per mecanismes autoimmunes. Per substituir aquest tipus cel·lular seria interessant aillar cèl·lules troncals adultes i dirigir la seva diferenciació cap a un fenotip de cèl·lula productora d'insulina.Els transportadors de resistència a multidrogues ABCG2 s'han proposat recentment com a marcadors de cèl·lules troncals en diferents teixits adults. Concretament en el pàncreas, on encara hi ha controvèrsia sobre l'origen i localització de les cèl·lules troncals, aquest marcador podria identificar a la possible població cel·lular troncal amb implicacions en el procés de transdiferenciació endocrina. L'aproximació experimental d'aquesta tesi es basa en aillar la població ABCG2(+) de pàncreas de rata i realitzar una caracterització del seu fenotip i propietats.Els nostres resultats indiquen que les cèl·lules obtingudes corresponen al fenotip de cèl·lules pancreàtiques estrellades, tant en estat quiescent com en estat actiu. A més, hem detectat la presència de marcadors de diferents tipus de cèl·lules troncals adultes en el cultiu: nestina, NCAM, FGFR1-IIIb, Thy-1,1. Posteriorment hem evaluat la seva capacitat de transdiferenciació en fenotip endocrí, concretament de cèl·lula productora d'insulina, a través del cultiu en Matrigel (matriu extracel·lular comercial) i exendin-4 (anàleg de GLP-1). Aquest tractament indueix en les cèl·lules estrellades en estat quiescent l'expressió del transportador Glut2, les convertases d'insulina PC1/3, PC2, així com la presència de pèptid C i la secreció d'insulina en resposta a estimulació amb glucosa.La secreció de factors solubles per part de les cèl·lules estrellades amb fenotip actiu és un fet àmpliamente conegut, així que ens vam plantejar caracteritzar mitjançant proteòmica el secretoma d'aquestes cèl·lules, i estudiar possibles efectes paracrins de les molècules identificades sobre la població ductal. El medi condicionat provinent de cèl·lules estrellades pancreàtiques provoca una inhibició significativa de la proliferació de les cèl·lules ARIP tractades, així com canvis d'expressió gènica a les mateixes (disminució del marcador ductal CK19, i increment del factor de transcripció PDX1, crucial en la diferenciació endocrina). Els resultats suggereixen que TGF&#61538;1 secretat per les cèl·lules pancreàtiques estrellades inhibeix la proliferación de les cèl·lules ARIP ductals tractades amb medi condicionat. De l'estudi del secretoma destaquem la identificació de 37 proteïnes solubles i 24 proteïnes intracel·lulars. Algunes d'aquestes molècules identificades per primera vegada en el secretoma d'aquest tipus cel·lular com PEDF o LIF, podrien exercir els canvis d'expressió gènica observats en les cèl·lules ARIP tractades amb medi condicionat provinent de cèl·lules pancreàtiques estrellades.En resum, tant les cèl·lules pancreàtiques estrellades com el seu secretoma obren noves vies d'investigació amb implicacions en processos de regeneració pancreàtica. / Numerous studies have reported that certain stem cells are characterized by the expression of ABCG2 transporter. In the present study we aim to identify new ABCG2(+) pancreatic cell populations and to explore their properties. We isolated and expanded ABCG2(+) cells from pancreata of lactating rats. The expanded cell population demonstrated a phenotype of pancreatic stellate cells (PaSC). The cell culture in Matrigel plus exendin-4, led to an increase in PDX-1 expression and induction of CK19. Moreover, endocrine genes, such as insulin, IAPP, glucagon, GLUT2, chromograninA, and convertases PC1/3, and PC2 were also detected. Immunocytochemical analysis showed co-localization of insulin and C-peptide, while ultrastructural studies revealed the presence of endocrine granules. Insulin secretion of these cells was detected in the cell culture medium. Active pancreatic stellate cells secrete many soluble factors important in pancreas physiology. Most of them are associated with fibrosis and matrix turnover. However, other roles including paracrine effects on &#61538; cell progenitors have not been investigated. In pancreas, there is no consensus on the nature of the adult pancreatic stem cells or where these progenitors are located. Ductal cells with capacity of transdifferentiation into endocrine phenotype have been described, but the external and morphogenic signals that determine their differentiation are still unknown.Subsequently, we characterized for the first time the PaSC secretome, and we identified 61 proteins using two-dimensional electrophoresis (2D) coupled to mass spectrometry MALDI-TOF and peptide mass fingerprinting. The conditioned media from the obtained PaSC was used to culture ARIP ductal cell line for 24 or 72 hours, and we analysed possible changes in a proliferation and differentiation level. We concluded that this media can reduce by 40% ARIP proliferation without affecting their viability, and the molecule responsible of that effect is TGF&#61538;1 secreted by PaSC. This conditioned media also reduces 0,48-fold ductal marker CK19 mRNA expression, and can increase 5,4-fold PDX1 mRNA in this cell line, a transcription factor crucial in pancreatic endocrine differentiation. We localize in the PaSC secretome several novel proteins that could be involved in differentiation processes, such as PEDF, Wnt5b and LIF.