INTRODUCCIÓ:La inflamació és una reacció defensiva de l'organisme contra tot tipus de lesió. Si la inflamació aguda persisteix s'arriba a un estat d'inflamació crònica generant-se una neoformació de teixit connectiu que pot arribar a derivar a teixit fibrós. Els eicosanoids constitueixen els mediadors d'inflamació més importants ja que modulen la iniciació, progressió i resolució de la resposta inflamatòria. L'acid araquidonic (AA) és el precursor més important dels eicosanoids. L'oxidació de l'AA es pot donar de manera enzimàtica a través de l'acció la ciclooxigenasa (COX) que catalitza la síntesi de prostaglandines (PG). L'aspirina (ASA) inhibeix la producció de PG al bloquejar l'activitat de la COX. Interessantment, l'ASA desencadena la biosíntesi de compostos antiinflamatoris endògens (anomenats 15-epi-lipoxines, 15-epi-LXs), que actuen com a senyals de reclutament de leucòcits i juguen un paper important en la resolució de la inflamació. Així doncs, en el primer estudi vam examinar els efectes de l'ASA en les vies de la COX i la 5-lipooxigenasa i el seu impacte en els nivells del receptor activat per proliferadors peroxisomals  (PPAR) i CINC-1 (citoquina pro-inflamatoria homòloga de la IL-8 humana) en cèl·lules hepàtiques de rata. La inflamació és un dels factors determinants de la patogènesi de la fibrosi hepàtica ja que precedeix o coexisteix amb el desenvolupament d'alteracions de la matriu extracel·lular. La COX-2 és l'enzim clau en el procés inflamatori i la seva inhibició selectiva constitueix una diana farmacològica interessant en el tractament de la inflamació i la fibrosi hepàtica. En el moment actual no es coneix en precisió la via de la COX en el fetge i les conseqüències de la seva inhibició a nivell de reducció de la inflamació i fibrosi hepàtica. Ja que les cèl·lules de Kupffer (KC) són el tipus cel·lular majoritàriament responsable de l'increment de la COX-2 i de la síntesi de PGs en el fetge i perquè la població d'aquestes cèl·lules incrementa durant la progressió de la inflamació hepàtica, el segon estudi es va basar en l'efecte d'un inhibidor selectiu de COX-2 sobre aquest tipus cel·lular.OBJECTIUS: 1. Avaluar els efectes de l'ASA sobre la síntesi d'eicosanoids i de productes proinflamatoris en cèl·lules hepàtiques en cultiu. 2. Estudiar els efectes d'un inhibidor selectiu de la COX-2, l'SC-236, i el seu possible paper en la resolució de la fibrosi hepàtica.RESULTATS I CONCLUSIONS:En el primer estudi observàrem que l'ASA produïa en KC un redireccionament del metabolisme dels eicosanoids, de la producció de PGE2 cap a la formació de leucotriè B4 i 15-epi-LXA4. Al mateix temps l'ASA i LXA4 i 15-epi-LXA4, a mes d'inhibir l'activitat de la 5-LO, reduiren els nivells de PPAR i CINC-1 en hepatòcilts. En conjunt, i degut a que els productes derivats de l'AA, els nivells de PPAR, i la secreció de CINC-1 estan involucrats en la duració de la resposta inflamatòria, aquests resultats proporcionen mecanismes moleculars addicionals a les propietats farmacològiques de l'ASA.Els resultats del segon estudi ens indicaren que l'expressió de COX-2 es trobava augmentada en fetges de rates tractades amb CCl4. L'administració d'SC-236 disminuïa els nivells incrementats de 15d-PGJ2, el grau de fibrosi hepàtica, el contingut d'hidroxiprolina, l'activitat de les metaloproteinases 2 i 9, i l'expressió de l'alfa-SMA en els fetges de les rates tractades amb CCl4. Addicionalment, l'SC-236 inhibia el creixement i induia apoptosi en cèl·lules hepàtiques estrellades (HSCs) i KC, augmentava l'expressió del PPAR-gamma en HSCs i actuava com a agonista d'aquest receptor nuclear. Així doncs, tots aquests resultats ens indiquen que l'inhibidor selectiu de COX-2, SC-236, mitjançant mecanismes que involucren l'apoptosi de cèl·lules no parenquimals i l'activació del PPAR-gamma, pot tenir un potencial terapèutic en la prevenció de la fibrosi hepàtica. / The mechanism of action of aspirin (ASA) is related to cyclooxygenase (COX) inhibition, but additional actions cannot be excluded for their antiinflammatory and antithrombotic properties. We examined the effects of ASA on COX and 5-lipoxygenase (5-LO) pathways and its impact on peroxisome proliferator-activated receptor alpha (PPAR) and cytokine-induced neutrophil chemoattractant-1 (CINC-1) levels in rat liver cells. In Kupffer cells (KC), the liver resident macrophages, ASA switched eicosanoid biosynthesis from prostaglandin (PG) E2 to leukotriene B4 and 15-epi-lipoxin A4 (15-epi-LXA4) formation. In hepatocytes, ASA significantly inhibited PPAR-alpha protein expression and CINC-1 secretion. Interestingly, the endogenous antiinflammatory eicosanoids LXA4 and 15-epi-LXA4, in addition to inhibiting macrophage 5-LO activity, reduced PPAR levels and CINC-1 secretion in hepatocytes. Taken together and because arachidonic acid-derived products, PPAR expression and CINC-1 levels are involved in the extent and duration of an inflammatory response, these findings provide additional molecular mechanisms for the pharmacological properties of ASA.The importance of inflammation in initiating the sequence of events that lead to liver fibrosis is increasingly recognized. For this reason, we tested the effects of SC-236, a selective COX-2 inhibitor, in rats with carbon tetrachloride (CCl4)-induced liver fibrosis. Livers from CCl4-treated rats showed increased COX-2 expression and 15d-PGJ2 formation. In these animals, SC-236 reduced liver fibrosis as revealed by histological analysis and by a reduction in hepatic hydroxyproline levels, metalloproteinase-2 activity, and alpha-smooth muscle actin expression. Interestingly, SC-236 normalized 15d-PGJ2 levels and restored PPAR-alpha expression in the liver of CCl4-treated rats. In isolated hepatic stellate cells (HSC)--the major player in liver fibrogenesis--and KC--the cell type primarily responsible for increased hepatic COX-2-- SC-236 exhibited remarkable pro-apoptotic and growth inhibitory properties. Of interest, SC-236 decreased HSC viability to a similar extent than the PPAR-gamma ligand rosiglitazone. Moreover, SC-236 significantly induced PPAR-gamma expression in HSCs and acted as a potent PPAR-gamma agonist in a luciferase-reporter trans-activation assay. These data indicate that, by mechanisms involving non-parenchymal cell apoptosis and PPAR-gamma activation, the selective COX-2 inhibitor SC-236 might have therapeutic potential for prevention of liver fibrosis.

INTRODUCCIÓN:El síndrome antifosfolipídico catastrófico fue descrito por Asherson en el año 1992 como una variante del síndrome antifosfolipídico (SAF) que conduce a insuficiencia multiorgánica, caracteriza por la oclusión trombótica de los vasos de pequeño calibre, que se produce en un breve período de tiempo en presencia de anticuerpos antifosfolipídicos. Representa aproximadamente el 1% de los pacientes con SAF, pero la mortalidad es mayor del 50%. Las causas y los factores pronósticos que influyen es esta elevada mortalidad son desconocidos.HIPÓTESIS: El SAF catastrófico debería ser considerado en el diagnóstico diferencial de los pacientes con fallo multiorgánico (FMO), síndrome de distrés respiratorio agudo (SDRA) y anenia hemolítica microangiopática (AHM). El esquema terapéutico combinando glucorticoides (GC) junto a anticoagulación efectiva (AC) y recambio plasmático (RP), sería es el que consigue mayores tasas de supervivencia. Por tanto, la utilización de esta triple terapia podría mejorar la evolución de estos pacientes.OBJETIVOS: Analizar las características clínica y biológicas de los pacientes con SAF catastrófico, especialmente en aquellos que desarrollan SDRA y AHM. Determinar las causas y los factores pronósticos que condicionan su elevada mortalidad como así también la influencia del tratamiento en la evolución de estos enfermos.MATERIAL Y MÉTODOS:Debido a la baja prevalencia del síndrome es imposible que un solo centro reúna un número de pacientes suficientes para realizar estudios de investigación, por lo que se creó un registro internacional denominado "CAPS registry" con el fin de reunir todos los pacientes con SAF catastrófico. El servicio de enfermedades autoimmnes del Hospital Clínico de Barcelona es el centro coordinador para la recepción de la información y los directores y doctorando de esta tesis son los responsables del diseño, confección y actualización del mismo. El registro está patrocinado por el Europeam Forum on Antiphospholipid Antibodies y se diseñó como un portal abierto de libre acceso a través de la siguiente dirección: www.med.ub.es /MIMMUN/FORUM/CAPS. HTM. TRABAJOS PUBLICADOS:1. Espinosa G, Bucciarelli S, Cervera R et al. Thrombotic hemolitic microangiopathic anaemia and antiphospholipid antibodies. Ann Reum Dis 2004; 63: 730-736 (IF 6,96). 46 pacientes con AHM y anticuerpos antifosfolipídicos (aFL) fueron revisados. La presentación clínica fué: síndrome hemolítico urémico (26%), SAF catastrófico (23%), purpura trombótica trombocitopénica (13%) y síndrome HELLP (4%). El 70 % de los pacientes que recibieron recambio plasmático se recuperaron. La mortalidad fué del 22%.2. Bucciarelli S, Espinosa G, Cervera R. The acute respiratory distress syndrome in catastrophic antiphospholipid syndrome.Ann Rheum Dis 2006; 65:81-86 (IF : 6,96). El 68 % de los pacientes tuvieron afectación pulmonar y en el 31% se manifestó como SDRA. El 70% de los pacientes en los que se dispuso de anatomía patológica presentaron microtrombosis.3. Bucciarelli S, Espinosa G, Cervera R et al. Mortality in the catastrophic antiphospholipid syndrome. Prognostic factors in a series of 250 patients. Arthritis Rheum 2006 (en prensa) (IF: 7,42) La mortalidad global fue del 44%. La principal causa de muerte fue la afectación neurológica (27,9%) seguida por la afectación cardiaca y las infecciones en un 19,8%. La presencia de lupus eritematoso sistémico se asoció a una mayor mortalidad. La mayor tasa de recuperación estuvo se obtuvo con la utilización de GC+AC+RP. La mortalidad disminuyó un 20% después del 2001 asociada a una mayor utilización de la terapia combinada con GC+AC+RP.CONCLUSIONES:El SAF catastrófico debe ser considerado en el diagnóstico diferencial de los pacientes con FMO, SDRA y AHM. El tratamiento combinado con AC+GC+RP debe ser considerada como terapia de primera línea en los pacientes con SAF catastrófico. / "CATASTROPHIC ANTIPHOSPHOLIPID SYNDROME"BACKGROUND: The term catastrophic antiphospholipid syndrome (APS) was proposed by Asherson in 1992 for defining an accelerated form of APS resulting in multiorgan failure, developed in a very short period of time. Although patients with catastrophic APS represent less than 1% of patients with APS, the mortality rate is more than 50%. The causes of this high mortality are still unknown.HYPOTHESES: The catastrophic APS would be considered as differential diagnosis among multiorgan dysfunction, thrombotic haemolytic microangiopathic anaemia and acute respiratory distress syndrome. A higher recovery rate would be associated with combined treatment with anticoagulation + corticosteroids + plasma exchange (AC+CS+PE). OBJECTIVES: to analyse the clinical and laboratory features of patients with catastrophic APS mainly in those patients who develop thrombotic miroangiopathic anaemia (THMA) and acute respiratory distress syndrome (ARDS). To assess the main causes of death and the prognostic factors that can influence mortality in patients with catastrophic APS.METHOD: We analysed the patients with catastrophic APS included in the "CAPS registry" in order to achieve the objectives.RESULTS: FIRST STUDY: 46 patients were reviewed with AMTH and aPL. The clinical presentations were: hemolytic-uremic syndrome (26%), catastrophic APS (23%), thrombotic thrombocytopenic purpura (13%), and HELLP syndrome (4%). Recovery occurred in 70% of episodes treated with Plasm Exchange. SECOND STUDY: Pulmonary involvement was reported in 68% patients with catastrophic APS and 31% of them were diagnosed as having ARDS. Microthromboses was present in 70% patients. THIRD STUDY: Death occurred in 44%. Cerebral involvement was considered the main cause of death (27.2%) followed by cardiac involvement and infection (19.8% one each). The presence of systemic lupus erythematosus was associated with a higher mortality. A higher recovery rate was associated with combined treatment with anticoagulation + corticosteroids + plasma exchange (AC+CS+PE) (77.8%). The mortality decreased 20% from 2001 associated with the higher use rate of combined treatment with AC+CS+PE and/or IVIg.CONCLUSIONS: The catastrophic APS should be considered as differential diagnosis among multiorgan dysfunction, thrombotic haemolytic microangiopathic anaemia and acute respiratory distress syndrome. The combined therapy with AC+CS+PE should be the first line of therapy in patients with catastrophic APS.

DE LA TESIS:En la cirrosis descompensada, la síntesis renal de prostaglandinas (PGs), juega un papel clave en el mantenimiento de la función renal. En concreto, las PGs renales contrarrestan la exacerbada actividad vasoconstrictora asociada a la activación de los sistemas vasoactivos endógenos que tiene lugar en esta patología. De hecho, se ha podido observar que en pacientes cirróticos, la inhibición aguda de las PGs con AINEs se asocia a un empeoramiento significativo en la función renal, por lo que en la pr¨¢ctica clínica los pacientes con cirrosis y ascitis no pueden recibir tratamientos prolongados con AINEs, debido al elevado riesgo de desarrollar fallo renal y ascitis refractaria. A pesar de que el papel de las PGs en el mantenimiento de la función renal en la cirrosis está bien establecido, se desconoce cuál es la isoforma de la ciclooxigenasa (COX) responsable de la síntesis de PGs involucradas en la homeostasis renal en esta enfermedad. Con el propósito de esclarecer este aspecto, además de caracterizar el efecto de los nuevos inhibidores selectivos de la COX-2, y especialmente si su uso puede o no causar efectos deletéreos renales en la cirrosis con ascitis, se ha llevado a cabo el presente proyecto. Los objetivos del mismo fueron:I. Caracterizar la expresión y distribución renal de COX-1 y COX-2 en ratas control y cirróticas.II. Comparar los efectos producidos por la administración de un inhibidor selectivo COX-1 (SC-560), con los de un inhibidor selectivo COX-2 (celecoxib), sobre la función renal, respuesta diurética y natriurética a la furosemida y metabolismo del agua, en ratas con cirrosis y ascitis.III. Investigar, in vitro, los mecanismos de acción de celecoxib en células renales, evaluando los efectos de celecoxib sobre la biosíntesis de eicosanoides vasoactivos, la liberación de renina, la activación de PPARgamma y la expresión de alfa-SMA en células mesangiales de rata.IV. Establecer si la albúmina, utilizada en la clínica como expansor plasmático en esta patología, modula las acciones moleculares de celecoxib en esta línea celular. De manera global, de los resultados de esta tesis doctoral se puede concluir que, en la cirrosis experimental, y en concreto en la cirrosis con ascitis, el mantenimiento de la función renal es dependiente de las PGs derivadas de la COX-1, y que el uso de celecoxib, un inhibidor selectivo de la COX-2, en estos animales, no compromete su función renal. Asimismo, se demuestran nuevos mecanismos de acción de celecoxib, aparte de la inhibición de la COX-2, que sugieren que este compuesto puede inducir menores efectos renales adversos que los AINEs convencionales, en patologías como la cirrosis descompensada, en las que las PGs renales son de una importancia crítica en el mantenimiento de la función renal dentro de los límites normales. Estos resultados aportan información para futuras evaluaciones de este compuesto, con las que esclarecer si celecoxib puede ser considerado como opción antiinflamatoria en pacientes con enfermedad hepática crónica.

The antiphospholipid syndrome (APS) is an acquired prothrombotic syndrome characterized by venous or arterial thromboses and pregnancy morbidity. It can present as primary APS without any discernable underlying disease, or in association with systemic autoimmune disease [usually systemic lupus erythematosus (SLE)], infections (mainly chronic viral infections) and malignant process, among others. It may also occur rapidly over days or weeks, when it is known as "catastrophic" APS (CAPS).The first study described one of the largest known cohorts of patients with primary APS from 4 different referral centers. The final study sample included 128 patients with primary APS with a median age of 42 years and mean follow-up of 9 years. After a median disease duration of 8.2 years, 110 (86%) patients remained with primary APS; 11 (8%) patients developed SLE; 6 (5%), LLD; and 1 (1%), myasthenia gravis. At the end of the study, 113 (88%) patients were alive and 15 (12%) patients had died. Our study confirms that progression from primary APS to SLE or LLD is unusual, even after a long follow-up. In the second study, we evaluated 120 cases of antiphospholipid antibodies associated with malignancies with a mean age of 56 years, The main hematological malignancies found were B-cell lymphoma, spleen lymphoma and chronic myeloid leukemia. The main solid tumors were renal cell carcinoma, primary tumor of unknown origin, lung adenocarcinoma and breast carcinoma. Around one third of patients achieved aPL remission after treatment. In the third study, we analyzed 15 cases of CAPS that appeared during pregnancy or the puerperium with a mean age at the time of the CAPS event of 27 years. In 7 of the 14 (50%) cases, CAPS appeared during pregnancy, in 6 (43%) cases it presented during puerperium and in 1 (7%) after curettage for a fetal death. The main clinical and serological characteristics were similar to those of patients with CAPS triggered by other factors, however we found some particular features including placental infarctions, pelvic vein thrombosis and myometrial thrombotic microangiopathy and HELLP syndrome. Final conclusion: Primary APS is a widely recognized distinct entity which rarely progresses to SLE, even after long-term follow-up. APS may also be associated with other chronic disorders, such as solid tumors or hematological malignancies. In cases with the life-threatening variant of APS known as CAPS, pregnancy and the puerperium are periods of high susceptibility for the development of this often fatal form of presentation. / "SINDROME ANTIFOSFOLIPIDICO: EXPANDIENDO EL ESPECTRO CLÍNICA DE LA TROMBOSIS AUTOINMUNE"El síndrome antifosfolipídico (SAF) es un síndrome protrombótico adquirido caracterizado por trombosis venosas y arteriales y pérdidas fetales recurrentes. Puede estar presente como SAF "primario" cuando no esta asociado a ninguna enfermedad autoinmune [fundamentalmente el lupus eritematoso sistémico (LES)] o en asociación a otros procesos tales como infecciones y procesos neoplásicos, entre otros. También puede manifestarse de una forma acelerada en días o semanas, caracterizado por trombosis de pequeños órganos y fallo multiorgánico, lo que se conoce como SAF "catastrófico". En el primer estudio se analizó una de las series más amplia y con más largo seguimiento de pacientes con SAF primario. Se incluyeron 128 pacientes con un seguimiento medio de 9 años. Después de una duración media de la enfermedad de 8 años, 110 (86%) pacientes continúan con el diagnóstico de SAF primario, 11 (8%) pacientes desarrollaron un LES, 6 (5%) una forma incompleta de lupus ("lupus-like disease") y 1 (1%) paciente desarrolló una miastenia gravis. La presencia del test de Coombs positivo confiere un riesgo estadísticamente significativo para el desarrollo de LES. . Nuestro estudio confirma que es inusual que un SAF primario evolucione hacia un LES o una forma incompleta de lupus, incluso tras un período largo de seguimiento.En el segundo estudio se incluyeron un total de 120 casos con anticuerpos antifosfolipídicos (AAF) asociados a procesos neoplásicos. Las principales neoplasias hematológicas relacionadas a los AAF fueron el linfoma de células B, el linfoma esplénico y la leucemia mieloide crónica. Los principales tumores sólidos fueron el carcinoma de células renales, los tumores de primario desconocido, el adenocarcinoma de pulmón y el cáncer de mama. Alrededor de una tercera parte de los paciente negativizaron los AAF después del tratamiento de la neoplasia. En el tercer estudio se analizaron 15 pacientes con SAF catastrófico que ocurrieron durante el embarazo o el puerperio. Las características clínicas generales del SAF catastrófico durante el embarazo o el puerperio fueron similares a las del SAF catastrófico desencadenado por otros factores a excepción de una tasa mayor de abortos previos. Sin embargo se encontraron una serie de características particulares, como el síndrome de HELLP, la trombosis placentaria, la microangiopatía trombótica de miometrio o la trombosis de la vena pélvica.CONCLUSIÓN FINAL: El SAF primario es una entidad propia ampliamente reconocida que en raras ocasiones evoluciona a un LES, incluso tras un período largo de seguimiento. El SAF puede asociarse a una serie de procesos crónicos como lo son las neoplasias hematológicas y los tumores sólidos. En aquellos casos con la variante "catastrófica" del SAF, el embarazo y el puerperio, constituyen un período de alta susceptibilidad para el desarrollo de esta variante altamente letal del SAF.

Esta tesis tiene dos partes bien diferenciadas. Una primera, en la que investigan las bases moleculares por las que el tratamiento con tungstato de sodio es capaz de inducir una regeneración del páncreas en los animales diabéticos. Y una segunda, que se centra en el papel de la proteína Tmem27 sobre los islotes pancreáticos y su posible uso como biomarcador de masa beta pancreática.Cada parte ha dado lugar a una publicación en una revista:A) "Molecular mechanisms of tungstate-induced pancreatic plasticity: a transcriptomics approach". BMC Genomics. 2009;10:406.ANTECEDENTES: El tungstato de sodio es un reconocido agente anti-diabético, capaz de incrementar la masa de células beta en modelos animales de diabetes. En la actualidad, los mecanismos moleculares por los que actúa y los genes que controlan la plasticidad pancreática son desconocidos. A través de una aproximación transcriptómica, nos proponemos descubrir lo mecanismos moleculares que participan en la recuperación de la función exocrina y endocrina de las ratas diabéticas-(STZ) tratadas con tungstato de sodio, determinando la contribución sobre este proceso del estado de hiperglicemia y el efecto directo/indirecto del tungstato. RESULTADOS: Las ratas diabéticas-(STZ) tratadas con tungstato presentaron una recuperación parcial de la función pancreática exocrina y endocrina, junto con un incremento en la masa de células beta. El análisis por microarrays del páncreas total definió tres grupos de genes: alterados por la diabetes, recuperados por el tratamiento e inducidos específicamente en los animales diabéticos tratados con tungstato. La contribución de la normalización de la hiperglicemia a estos cambios se estudió en animales diabéticos tratados con fluoricina, concluyendo que son independientes de la glicemia. Además, se estudió el efecto directo/indirecto del tungstato en células INS-1E tratadas con tungstato de sodio y con el suero de los diferentes animales, observándose que los cambios detectados eran debidos a efectos directos e indirectos del propio tratamiento. Por último, se examinó la vía de las MAPK, concluyéndose que era responsable del aumento de la proliferación observado sobre las células beta, a través de un mecanismo de modulación directo e indirecto.CONCLUSIONES: El tratamiento con tungstato mejora la función pancreática de forma directa e indirecta, a través de una combinación de vías independientes de la glicemia, donde la vía de las MAPK juega un papel clave sobre el incremento de la proliferación de las células beta.B) "The role of transmembrane protein 27 (TMEM27) in islet physiology and its potential use as a beta cell mass biomarker". Diabetologia.2010;53:1406-14.ANTECEDENTES: La proteína Transmembrana 27 (TMEM27) ha sido descrita en las células beta, donde estaría implicada en procesos de secreción de insulina y/o de proliferación. Además, ha sido propuesta como un marcador de masa de células beta. RESULTADOS: Los islotes provinentes de donantes pancreáticos con diabetes presentan niveles de ARNm de TMEM27 inferiores de los donantes sin patología, observándose una correlación significativa con el gen ESNAPINA en islotes humanos sin patología. En las ratas no-diabéticas tratadas con tungstato de sodio, que presentan un incremento en la proliferación de las células beta y una disminución en la secreción de insulina, la expresión de Tmem27 se haya disminuida. En células INS-1 832/13 e islotes, la sobrexpresión de Tmem27 da lugar a un incremento significativo de la secreción de glucosa inducida por glucosa con un incremento nulo o muy pequeño en la proliferación. Finalmente, Tmem27 puede ser escindido por células beta y células renales proximales tubulares.CONCLUSIONES: Los datos presentados apoyan la idea que Tmem27 está implicado en procesos de secreción de insulina inducidos por glucosa, pero no en procesos de proliferación. Además, el hecho que pueda ser escindido en células renales, invalida su posible uso como biomarcador de masa de células beta. / The content of this thesis is summarised in the articles:a) Molecular mechanisms of tungstate-induced pancreatic plasticity: a transcriptomics approach. BMC Genomics. 2009;10:406.BACKGROUND: Molecular mechanisms which recover the pancreatic function of (STZ)-diabetic rats treated with tungstate are unknown. RESULTS: Tungstate treated (STZ)-diabetic rats showed a partial recovery of exocrine and endocrine function and increased beta-cell. Microarray analysis of the pancreases identified genes altered due to diabetes, restored by the treatment, and specifically induced by tungstate in diabetic animals. Hyperglycemia contribution was studied in STZ-diabetic rats treated with phloridzin, and direct effect of tungstate was determined in INS-1E cells treated with tungstate or serum from untreated or treated STZ-rats, observing that tungstate action in the pancreas takes places via hyperglycemia-independent pathways and a combination of tungstate direct and indirect effects. Finally, MAPK pathway was evaluated, observing that it has a key role in the tungstate-induced increase of beta-cell proliferation.CONCLUSIONS: Tungstate improves pancreatic function through a combination of hyperglycemia-independent pathways and through its own direct and indirect effects, with MAPK pathway playing a key role in the tungstate-induced increase of beta-cell proliferation.b) The role of transmembrane protein 27 (TMEM27) in islet physiology and its potential use as a beta cell mass biomarker. Diabetologia. 2010;53:1406-14.BACKGROUND: Transmembrane protein 27 (TMEM27) is a membrane protein cleaved with possible roles in insulin exocytosis and cell proliferation, although its function in beta-cells remains controversial. RESULTS: TMEM27 mRNA levels in islets are lower in human diabetic donors than in controls. Its gene expression correlates with that of insulin and SNAPIN in human islets. TMEM27 expression is downregulated in islets of tungstate-treated rats, which exhibit decreased insulin secretion and increased proliferation. TMEM27 overproduction in a beta-cell line and islets significantly enhanced glucose-induced insulin secretion, with modest or no effects on proliferation. Finally, TMEM27 is cleaved and shed by renal proximal tubular cells and pancreatic islets.CONCLUSIONS: Our data support a role for TMEM27 in glucose-induced insulin secretion but not in cell proliferation. The finding that its cleavage is not specific to beta-cells challenges the current support for its use as a potential beta-cell mass biomarker.

La fibrosis hepática es el exceso de tejido conectivo fibroso en el hígado consecuencia de la inflamación crónica de éste. En estados muy avanzados (cirrosis) puede llevar consigo descompensaciones que pueden causar la muerte del paciente. La atorvastatina es un fármaco utilizado para inhibir la síntesis de colesterol. Además, tiene otros efectos (anti-inflamatorio, antioxidante). La ghrelina es una hormona implicada en el control del apetito. Además, tiene otros efectos (vasodilatador, anti-inflamatorio). El objetivo de esta tesis es investigar si la atorvastatina y la ghrelina tienen un efecto hepatoprotector y/o antifibrogénico con el fin de abrir nuevas estrategias terapéuticas en este campo.Para ello se han realizado experimentos in vitro sobre células estrelladas hepáticas así como in vivo en varios modelos animales de inflamación y fibrosis hepática. Además, en el estudio de la ghrelina se han analizado muestras de pacientes con diferentes hepatopatías (sangre, biopsia hepática).Los principales resultados obtenidos son los siguientes: La atorvastatina fue capaz de disminuir la inflamación hepática inducida por angiotensina II y tetracloruro de carbono en ratas. Redujo la respuesta a angiotensina II de las células estrelladas hepáticas (proliferación, secreción de interleuquina 8 y TGF-beta y expresión génica). El tratamiento con ghrelina disminuyó parámetros de daño hepático inducidos por tetracloruro de carbono (inflamación, estrés oxidativo, muerte celular). Además disminuyó la fibrosis hepática en el modelo de ligadura de conducto biliar. Los ratones deficientes en ghrelina fueron más susceptibles a desarrollar fibrosis hepática que los ratones salvajes. Algunos de estos resultados fueron reproducidos en células estrelladas hepáticas en cultivo. Los niveles séricos de ghrelina se encontraron disminuidos en pacientes con hepatopatías. La expresión hepática de ghrelina correlacionó con la de otros genes pro-fibrogénicos. Dos polimrofismos del gen de la ghrelina se correlacionaron con una mayor progresión de la fibrosis en pacientes con hepatitis crónica por virus C.Estos resultados, en conjunto, indican que la atorvastatina podría ser beneficiosa en el tratamiento de la inflamación hepática y la ghrelina podría ser beneficiosa en el tratamiento de la inflamación y la fibrosis hepática.

El lupus eritematós sistèmic (LES) és una entitat sistèmica, de límits mal definits i d'etologia poc coneguda, que es caracteritza per la formació d'anticossos dirigits contra nombrosos antígens cel.lulars, com a conseqüència de la disregulació del sistema immunitari, a causa de la influència de diversos factors. D'entre els diversos autoanticossos descrits al LES, els anticossos antifosfolípids (AAF) destaquen per l'interès creixent que durant els últims anys està prenent el seu estudi. Són un grup heterogenia d'autoanticossos adquirits de forma espontània, de tipus IgG, IgM o IgA, que es caracteritzen per anar dirigits contra estructures fosfolipídiques de càrrega negativa de les membranes cel.lulars.Recentment s'ha observat que els malalts amb LES i AAF presenten una alta incidència de fenómens trombòtics, avortaments i morts fetals de repetición i trombocitopenia. Tanmateix, alguns autors han observat una correlació significativa entre els nivells d'AAF i l'activitat clínica del LES, de forma que la seva determinació podria introduir un nou element per a millorar la monitorització del LES. De tots ells, els anticossos anticardiolipina(AAC) han estat els han merescut un major interès per part dels investigadors. Així, actualment es considera que la detecció d'aquests autoanticossos per latècnica d'ELISA aporta molts avantatges en el camp d'investigació deIs AAF. No obstant això, fins el moment actual no han estat efectuats estudis prospectius en poblacions àmplies de malalts afectes de LES determinant els AAC mitjancant aquesta tècnica i persistiesen encara moltes incógnites respecte a la seva metodologia de realització i valoració dels resultats, així com sobre la seva incidència i relació amb les diverses manifestacions clíniques i biològiques del LES.Amb la base de les observacions anteriors, els objectius de la present Tesi van ser els següents: D'una banda, posar a punt i desenvolupar la tècnica d'ELISA de detecció dels AAC, assignar als resultats unes unitats de càlcul senzill i determinar els valors de normalitat; en segon lloc, conèixer la incidència dels AAC en el LES i la seva reIació amb la presència de fenómens trombótics, avortaments de repetició, trombocitopenia i altres manifestacions clíniques i biològiques del LES, amb la finalitat de comprovar si defineixen algun subgrupo clínic; en tercer lloc, valorar l'interès deIs AAC com a paràmetre d'activitat del LES; i, finalment, comparar la presència d'AAC amb la de l'AL i la SLPP. Per a portar a terme aquest estudi, han estat valorats de forma prospectiva durant dos anys (1986-1987) 100 malalts diagnosticats de LES en base als criteris de l'ARA. Com a grups control han estat utilitzats, d'una banda, 107 malalts amb altres patologies autoinmunes (esclerosis sistèmica progressiva, dermatofitosis-polimiositis, artritis reumatoïde, arteritis de Horton, cirrosi biliar primària i púrpura trombocitopènica idiopàtica) i, per altra part, 100 persones sanes donants voluntaris de sang amb serologia luètica negativa. Dels resultats obtinguts en el present estudi es desprenen les conclusions següents:1) Anàlisi clínica de la sèrie.1 .1 La distribució per sexes, edat d'inici de la malaltia, manifestacions clíniques i incidència de nefropatia van ser similars a les descrites a la literatura. 2) Estudi dels anticossos anticardiolipina2.1. Estandarització de la tècnica d'ELISA2.1.1. La tècnica d'ELISA en fase sòlida que utilitza cardiolipina com a antigen i dos pisos d'anticossos, l'últim deIs quals conjugat amb fosfatasa alcalina, permet detectar AAC dels isotipus IgG i IgM de forma estandaritzada i reproductible.2.1.2. Amb la introducción d'alguna modificació respecte a la descripción original de Loizou et al ., com és la utilització de 1,5 micrograms de cardiolipina a cada pouet de la placa s'ha obtingut al nostre laboratorio una millor capacitat de la tècnica per a distingir entre la presència de diverses quantitats d'anticossos.2.1.3. La utilització de l'índex d'unió (IU) permet assignar als resultats unes unitats de càlcul senzill. La unitat (1 U.) equival a una densitat òptica (DO) del sèrum problema igual a la DO del grup control sa.2.1.4. Els valors dels AAC a la població sana segueixen una distribución log-normal, amb diferència segons l'isotipus (IgG o IgM).2.1.5. Per a computar els valors patològics és necessari considerar només aquells superiors a 2,8 U. (3,76 DE) en el cas dels AAC-IgG i a 4,07 U. (3,89 DE) en el dels AAC-IgM.2.2. Incidència dels anticossos anticardiolipina2.2.1. La incidència deIs AAC al LES és relativamente alta (36% a la nostra sèrie).2.2.2. La incidència a altres malalties sistèmiques immunològiques com l'esclerosi sistèmica progressiva, la dermatofitosis-polimiositis, l'arteritis de Horton o la púrpura trombocitopènica idiopàtica és escassa. La incidència a l' artritis reumatoïde i a la cirrosi biliar primària és més elevada, cosa que suggereix una possible reacció creuada amb el factor reumatoïde i els anticossos antimitocondrials.2.3. Associació dels anticossos anticardiolipina amb manifestacions clíniques i biològiques del LES.2.3.1. Els AAC presenten una associació estadísticament significativa amb la presència de trombocitopenia. Els malalts amb una major incidència d'aquesta alteració són aquells amb un títol més elevat d'AAC de l'isotipus IgG.2.3.2. Cap malaltia de la nostra sèrie no va presentar un avortament durant el període d'estudi. Per altra part, no s'ha observat associació entre els AAC i l'antecedent d'avortaments o morts fetal recurrents.2.3.3. Els AAC presenten també una associació significativa amb la presència de trombocitopenia. Els malalts amb una major incidència d'aquesta alteració són aquells amb un títol més elevat d'AAC de l'isotipus IgG.2.3.4. Els AAC de l'isotipus IgM presenten una associació significativa amb la presència d'anemia hemolítica autoinmune i neutropènia. La major incidència d'aquestes alteracions és també en aquells malalts amb un títol més elevat d'aquests anticossos.2.3.5. Els AAC tenen una sensibilitat en la detecció d'activitat clínica del LES del 52%, una especificitat del 75%, un valor de predicció positiva del 58% i de predicció negativa del 70% i una eficàcia del 66%. No obstant, són marcadors de trombocitopènia i d'anemia hemolítica, per la qual cosa no s'haurien de fer server com a marcadors generals d'activitat clínica del LES.2.3.6. La detecció d'un títol positiu d'AAC s'associa de forma estadísticamente significativa amb la detecció d'AL. No obstant, alguns malalts presenten positivitat en només un d'ells.2.3.7. La detecció de SLPP és freqüent en el LES i en moltes ocasions s'associa a un títol positiu d'AAC.2.3.8. els títols deIs AAC presenten una correlació significativa amb els dels anticossos anti-ADNn, el que suggereix que un subgrupo d'aquests anticossos podria tenir activitat antifosfolipídica.2.3.9. No ha estat trobada en aquest estudi cap associació significativa entre els AAC i els anticossos anti-ENA o els factors del complement. / Several recent studies have shown that patients with anticadriolipin antibodies (ACA) are prone to repeated episodes of venous and/o arterial thrombosis, thrombocytopenia, and haemolytic anaemia. Systemic lupus erythematosus (SLE) is the autoimmune disorder where ACA were first reported. Nevertheless, prospective studies in large series of SLE to assess the incidence and relationship with these clinical manifestations are infrequent. OBJECTIVES: a) To analyze the incidence of ACA isotypes in SLE; b) To assess its relationship with ACA related clinical manifestations. METHODS: Clinical and laboratory features of 100 patients with SLE (ARA criteria) were prospectively studied with a special emphasis on venous and/or arterial thrombosis, thrombocytopenia (100.000/nm3), haemolytic anaemia (positive Coombs' test) and neutropenia. IgG and IgM ACA were determined using an ELISA technique. Positive IgG ACA samples were considered when 3,77 SD and IgM ACA 3,9 SD (prob. =98%). Statistical analysus: BMPD, EPlSTAT.RESULTS: a) ACA were positive in 35 patients: IgG ACA in 24, and IgM ACA in 19 (both IgG and IgM ACA in 8); b) Thrombosis appeared in 10 patients, and its incidence was related with the presence of IgG ACA (p=0,001); c) Thrombocytopenia appeared in 16 patients, and it was also related with IgG ACA (p=0,01); d) Haemolytic anaemia in patients and, by contrast , it was related with IgM ACA (p=0,01); e) Neutropenia in 5 patients and it was also related with IgM ACA (p=0,004).CONCLUSIONS: a) Incidence of ACA in SLE is raised; b) Thrombosis and thrombocytopenia in SLE related with the presence of IgG ACA; C) Haemolytic anaemia and neutropenia in SLE are related with IgM ACA.

La isquèmia renal és una de les principals causes del Fracas Renal Agut i en el context del trasplantament renal predisposa l’òrgan a un dany crònic i a una possible pèrdua de l’empelt. La cèl•lula epitelial tubular representa una de la unitats renals principalment afectades en el dany per isquèmia reperfusió. Al mateix temps, és una de les principals efectores del dany mitjançant la secreció de citoquines inflamatòries, reclutament de cèl•lulas inflamatòries infiltrants (que contribueixen a la generació d’inflamació i fribrosi). El factor de creixement dels hepatòcits (HGF) és una citoquina multifactorial que ha estat estudiat, des del seu descubriment fa 25 anys, per les seves propietats anti-apoptòtiques anti-inflamatòries, anti-fibròtiques i regeneratives. L’expressió d’aquest factor es veu augmentat immediatament després d’un insult (tòxic, isquèmic o inflamatori) però és ràpidament desplaçat per la generació de factors inflamatoris i fibròtics. Per pal•liar aquest desequilibri, l’ús terapèutic de la proteïna recombinant d’HGF com a suplement, és efectiva tot i que la seva curta vida mitja resulta problemàtica. La teràpia gènica in vivo mitjançant electroporació permet aconseguir elevats nivells de proteïna circulants i evitar els problemes de citotoxicitat, oncogenicitat, immunogenicitat o baixa eficiència asociats a altres mètodes de transferència gènica (virals, liposomes, xoc osmòtic). La transferència gènica in vivo d’HGF mitjançant electroporació intramuscular o intrarenal és altament efectiva per l’obtención de nivells sostinguts de la proteïna circulant i en el teixit. En models experimentals de dany per isquèmia/reperfusió i trasplantament renal l’electrotransferència amb HGF ha resultat en una disminució de l’apoptosi, disminució de l’expresió de citoquines inflamatòries i fibròtiques i menor infiltració de cèl•lules inflamatòries i per tant en una millor funció renal i una major conservació del parènquima renal. Mitjançant la modelització d’aquest dany in vitro mitjançant un cultiu de cèl•lules tubulars epiteliales transfectades amb HGF i sotmeses a hipòxia s’ha observat l’efecte inflamatori de la deprivació d’oxígen sobre la cèl•lula tubular i l’efecte antiinflamatori d’HGF. En conclusió, la teràpia gènica amb HGF es demostra efectiva en el tractament de diferents insults o danys renals en el context del transplantament mitjançant el seu efecte anti-apoptòtic i anti-fibròtic. / Kidney ischemia/reperfusion injury is one of the main causes of Acute Renal Failure, and in the transplant setting leads the organ to a chronic disease and a probable graft lost. Tubular epithelial cell is one of the kidney compartments mainly affected in the ischemia/reperfusion injury. On the other hand it is also one of the injury effectors by the secretion of inflammatory cytokines, mobilization of infiltrating inflammatory cells (contributing to the inflammation and fibrosis). Hepatocyte Growth Factor (HGF) is a multifactorial cytokine studied, since its discovery 25 years ago, for its anti-apoptotic, anti-inflammatory, anti-fibrotic and regenerative properties. The expression of this factor is up-regulated immediately after the insult (toxic, ischemic or inflammatory) but it is quickly displaced by the generation of inflammatory and fibrotic factors. To solve this desequilibrium the suplemmentation with recombinant HGF protein is effective but has a very short half life in circulation. In vivo gene therapy by electroporation allows high and sustained levels of circulating protein, and avoids the cytotoxicity, oncogenicity and immunogenicity or low efficiency associated to other gene transfer methods (viral, liposomes, osmotic shock) In experimental models of ischemia /reperfusion injury and renal transplantation, HGF electrotransfer results in a lowered apoptosis, lowered expression of inflammatory and fibrotic cytokines, lower number of infiltrating cells and therefore a better renal function and a better preserved renal parenchyma. An in vitro model of the renal disease using rat tubular epithelial cells stably transfected with HGF and under hypoxia shows how the oxigen deprivation can transform the epithelial cells in an inflammatory cytokine secretor and how the HGF overexpression can revert this effect. Altogether these results show a beneficial efect of gene therapy with HGF in renal diseases mainly though its anti-inflammatory and anti-fibrotic actions.

La presente tesis incluye dos trabajos: PRIMER TRABAJO High microvessel density determines a poor outcome in patients with diffuse large B-cell lymphoma treated with rituximab plus chemotherapy Cardesa-Salzmann et al. Haematologica. 2011; 96(7):996-1001. RESUMEN: Introducción: El linfoma difuso de células grandes (LDCG) es una enfermedad heterogénea a nivel clínico y a nivel molecular. Estudios de expresión génica han demostrado que el microambiente tumoral afecta la supervivencia y que la “signatura” relacionada con angiogénesis es desfavorable. La contribución histopatológica de la densidad microvascular a la supervivencia de los pacientes con LDCG tratados con inmunoquimioterapia es desconocida. El propósito de este estudio fue evaluar el impacto pronóstico de la densidad microvascular tisular en dos series independientes de LDCG tratados con inmunoquimioterapia. Material y métodos: 147 pacientes del proyecto internacional Leukemia Lymphoma Molecular Profiling Project ((LLMPP) (cohorte de “entrenamiento”) y 118 pacientes del grupo catalán de estudio de linfomas (GELCAB) (cohorte de validación) fueron incluídos en el estudio. Las tinciones inmunohistoquímicas para la microvasculatura tisular fueron realizadas con CD31 y cuantificadas con un sistema de análisis de imagen computarizado. El score estromal previamente definido en 110 pacientes del LLMP mediante estudios de expresión génica fue utilizado para analizar correlaciones con los datos obtenidos de microvasculatura tisular. Resultados: La densidad microvascular correlaciona significativamente con el score estromal. (r=0.3209; P<0.001). Los pacientes con una alta densidad microvascular demuestran una supervivencia global significativamente inferior tanto en la “cohorte de entrenamiento” (4-year OS 54% vs. 78%; P=0.004) como en la “cohorte de validación” (57% vs. 81%; P=0.006). En el análisis multivariante en ambos grupos la densidad microvascular fue un factor pronóstico desfavorable independiente del IPI [cohorte de entrenamiento: IPI (riesgo relativo 2.7; p=0.003); densidad microvascular (riesgo relativo 1.96; P=0.002); cohorte de validación: IPI (riesgo relativo 4.74; p<0.001); densidad microvascular (riesgo relativo 2.4; p=0.016)]. Conclusiones: Estos hallazgos realzan el impacto de la angiogénesis en la supervivencia de los pacientes con LDCG así como el interés de evaluar tratamientos antiangiogénicos en ensayos clínicos. SEGUNDO TRABAJO A new biologic prognostic model based on immunohistochemistry predicts survival in patients with diffuse large B-cell lymphoma. Blood 2012; 120(11):2290-6. Perry AM, Cardesa-Salzmann et al RESUMEN Los factores biológicos que predicen supervivencia en pacientes con LDCG como célula de origen y “signaturas” estromales fueron descubiertos por estudios de expresión génica. El objetivo del estudio fue intentar simular estos hallazgos y crear un nuevo modelo pronóstico biológico basado en inmunohistoquímica. 199 pacientes con LDCG de novo tratados con R-CHOP u otras combinaciones de inmunoquimioterapia (125 en una cohorte de entrenamiento, 74 en una cohorte de validación) fueron incluídos en el estudio. A partir de tejido parafinado se construyeron arrays de tejidos y a cada factor pronóstico adverso se le concedió un punto (subtipo no-GCB, SPARC <5%, densidad microvascular elevada). Este modelo usando los tres marcadores biológicos demostró ser altamente predictivo de supervivencia global y de supervivencia libre de enfermedad tanto en la cohorte de entrenamiento como en la cohorte de validación tras ajustar para el IPI. Este nuevo modelo identifica a dos grupos de pacientes, uno con una puntuación biológica baja (0-1) y un pronóstico favorable y otro con una puntuación biológica elevada (2-3) y pronóstico desfavorable. Este modelo pronóstico biológico puede usarse conjuntamente con el IPI para estratificar a pacientes para tratamientos ajustados a su riesgo biológico. / this doctoral dissertation contains two studies: A) High microvessel density determines a poor outcome in patients with diffuse large B-cell lymphoma treated with rituximab plus chemotherapy Cardesa-Salzmann et al. Haematologica. 2011; 96(7):996-1001. Diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) is a clinically and molecularly heterogeneous disease. Gene expression profiling studies have shown that the tumor microenvironment affects survival and that the angiogenesis-related signature is prognostically unfavorable. The contribution of histopathological microvessel density (MVD) to survival in DLBCL remains unknown. The purpose was to assess the prognostic impact of histopathological MVD in two independent series of patients with DLBCL treated with immunochemotherapy. 147 patients from the LLMPP (training series) and 118 patients from the GELCAB (validation cohort) were included in the study. Microvessels were immunostained with CD31 and quantified with a computerized image analysis system. The stromal scores defined in 110 LLMPP cases were used to analyze correlations with MVD. MVD significantly correlated with the stromal score. Patients with high MVD showed significantly poorer overall survival (OS) than those with low MVD both in both cohorts. In multivariate analysis, in both groups high MVD was a statistically significant unfavorable prognostic factor independent of international prognostic index (IPI).These findings highlight the impact of angiogenesis in the outcome of patients with DLBCL and the interest of evaluating antiangiogenic drugs in clinical trials. b) A new biologic prognostic model based on immunohistochemistry predicts survival in patients with diffuse large B-cell lymphoma. Perry AM, Cardesa-Salzmann et al. Blood 2012; 120(11):2290-6. Biologic factors that predict the survival in DLBCL, such as cell of origin and stromal signatures, have been discovered by gene expression profiling. We attempted to simulate these findings and create a new biologic prognostic model based on immunohistochemistry. We studied 199 patients (125 in the training set, 74 in the validation set) with de novo DLBCL treated with rituximab and chemotherapy. 1 point was awarded for each adverse prognostic factor: nongerminal center B cell-like, SPARC < 5%, and MVD quartile 4. The model was highly predictive of OS and EFS in multivariate analysis in both cohorts. This new biologic prognostic model could be used with the IPI to stratify patients for risk-adapted therapies.

Tesi realitzada a l'Institut Català d'Oncologia de l'Institut d'Investigació Biomèdica de Bellvitge (ICO-IDIBELL) / • L’anàlisi de la hipermetilació del promotor d’MLH1 utilitzant el mètode de l’MS-MLPA ha demostrat ser un mètode de selecció precís, i més rendible que l’estudi de la mutació BRAF en la selecció dels pacients que són candidats a ser estudiats a nivell germinal en el gen MLH1, quan hi ha sospita de ser síndrome de Lynch i quan no hi ha expressió de la proteïna MLH1 en el tumor. • Alguns casos de síndrome de Lynch poden no ser detectats amb aquesta estratègia, el que posa de relleu la importància del criteri clínic en l’estudi de casos par tal de minimitzar els falsos negatius. • La PCR digital proporciona una mesura robusta i quantitativa de la proporció d’al·lels de KRAS mutats en mostres de tumors sent capaç de detectar al·lels mutats minoritaris. L’ús d’aquesta metodologia dóna una nova visió de l’heterogeneïtat intratumoral en hotspots seleccionats durant la tumorogènesi. • L’estudi de la dinàmica de les metapoblacions mostra com el càncer és un procés evolutiu on la càrrega mutacional sembla estar augmentada en les primeres etapes de la tumorogènesi, tot i que, en general, aquesta variabilitat no es tradueix en selecció d’aquestes mutacions. • L’anàlisi de l’heterogeneïtat basada en el doble enfoc de l’estudi de criptes amb tècniques d'alta sensibilitat analítica contribueix a comprendre els mecanismes mutacionals, destacant l'augment de la càrrega mutacional present en etapes primerenques de la tumorogènesi. • L'heterogeneïtat observada reflecteix els antecedents genètics de predisposició al càncer. • L’estudi de les metapoblacions tumorals basat en l'aparició de mutacions i la seva comparació, ens pot ajudar a entendre millor el procés d'expansió en les primeres etapes de la tumorogènesi. / • Somatic hypermethylation of MLH1 is an accurate and cost-effective pre-screening method in the selection of patients that are candidates for MLH1 germline analysis when LS is suspected and MLH1 protein expression is absent. • Analysis of MLH1 hypermethylation using MS-MLPA has very few false negative results, making this technique a reasonable option in the diagnostic algorithm of LS. In any case, clinicians must be aware that some LS cases may not be identified. • Digital PCR provides a robust, quantitative measure of the proportion of KRAS mutant alleles in routinely obtained samples. • Digital PCR has allowed the identification of multiple alleles in a substantial proportion of the analyzed samples. The use of techniques of increased sensitivity provides new insights into the intratumoral heterogenity. • Study of mutational dynamics has shown that there is a striking degree of heterogeneity of cell populations in early stages of colorectal tumorigenesis that is nonrandom and depends on the genetic background. • The vast majority of mutated subpopulations identified are not selected during tumor progression. • The study of metapopulations based on highly sensitive mutation detection methods using was likely to offer novel insights into the dynamics of tumor cell populations in early and advanced tumorigenesis.