Visando contribuir para o conhecimento da dinâmica do estresse celular por agentes químicos e físicos e suas possíveis implicações sobre a mobilização de elementos transponíveis presentes em Drosophila, foram realizadas diferentes abordagens experimentais utilizando a espécie cosmopolita Drosophila melanogaster, e as espécies neotropicais do subgrupo willistoni, D. willistoni (três linhagens) D. equinoxialis, D. paulistorum, D. insularis e D. tropicalis. Foi verificado o efeito tóxico de disseleneto de difenila ((PhSe)2) durante diferentes estágios do ciclo de vida da Drosophila melanogaster e das espécies do subgrupo willistoni. Em D. melanogaster, as moscas adultas foram mais resistentes a intoxicação por (PhSe)2 do que larvas e pupas. De uma maneira geral as espécies do subgrupo willistoni são mais sensíveis à intoxicação por selênio do que a D. melanogaster, possivelmente explicado e de acordo com a recentemente demonstrada ausência de homologia de genes para selenoproteínas no genoma de D. willistoni com todas as onze outras espécies sequenciadas. O potencial do selênio para promover estresse celular em D. melanogaster foi evidenciado através da transcrição do gene hsp83 por Northern blot. Nas espécies do subgrupo willistoni a expressão deste gene e do hsp70 foi abordada através de Real Time PCR em resposta ao selênio e ao paraquat, que igualmente foi mais tóxico nos estágios iniciais de desenvolvimento. Os resultados da expressão dos genes de estresse, entretanto, não foram conclusivos, bem como a procura da transposase do elemento P em resposta aos tratamentos. Apesar disso foram estabelecidas às condições experimentais para a realização de experimentos futuros. / Aiming to contribute to the knowledge of the dynamics of cell stress caused by chemical and physical agents and the likely implications thereof in the mobilization of transposable elements present in Drosophila, different experimental approaches were adopted using the cosmopolitan species Drosophila melanogaster and the Neotropical species of the willistoni subgroup, D. willistoni (three strains), D. equinoxialis, D. willistoni, D. paulistorum, D. insularis and D. tropicalis. The toxic effect of diphenyl diselenide [(PhSe)2] was observed in the different life cycles of Drosophila melanogaster and of the species of the willistoni subgroup. D. melanogaster adult flies were more resistant to intoxication by (PhSe)2 as compared to larvae and pupae. Generally speaking the species belonging to the willistoni subgroup are more sensitive to intoxication by selenium as compared to D. melanogaster, which is possibly explained and in accordance to the recently demonstrated absence of gene homology of selenoproteins in the D. willistoni genome with all that of the other eleven species sequenced. The evidence of the potential exhibited by selenium to promote cell stress in D. melanogaster is shown by the hsp83 gene transcription analyzed by Northern blot. In the species of the willistoni subgroup, the expression of the hsp83 and of the hsp70 genes was analyzed by Real Time PCR in response to selenium and paraquat, which was equally more toxic in the early development stages. Nevertheless, the results of the stress gene expression were inconclusive, as well as the search for P element transposase in response to treatments. In spite of that, the experimental conditions required for future research have been established.

Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4615.pdf: 2688296 bytes, checksum: 18c8fbe6fb83004856a32c02827d70f5 (MD5) Previous issue date: 2011-11-22 / Universidade Federal de Sao Carlos / Rabies is a zoonotic viral disease caused by a virus of the genus Lyssavirus that affects several species of mammals. Rabies remains a global public health threat that kills more than 55,000 people per year mainly in developing countries, this disease once established do not have a specific treatment. The RV envelope is composed of a glycoprotein, known as a unique antigen capable of conferring immune response against the rabies, and therefore, is the focus of research for development an efficient and safe recombinant vaccine based on this viral antigen. Cell line stably transfected S2 Drosophila melanogaster have been used in the production of many heterologous proteins and has been studied for the production of the rabies virus glycoprotein (RVGP) in our laboratory. This approach involves the selection of high producing cell populations; procedure that requires considerable periods of time (months), increasing management and costs of production. In this sense, in recent decades, many systems focused on the expression of heterologous proteins by transient expression of genes, were analyzed because they allow obtaining significant quantities of recombinant protein in a short period of time (weeks). For the use of transient transfection technology can be found a variety of methods and available agents, such as electroporation, cationic lipids, cationic polymers and calcium phosphate precipitated. The choice and optimization of each of them depends mainly on the cell type and protein being expressed. Thus, the objective of this study was to evaluate the transient expression of the glycoprotein gene of rabies virus (RVGP) in insect cells of Drosophila melanogaster S2 lineage, evaluating the vehicles transfection: calcium phosphate, cationic lipid (Cellfectin) and cationic polymer (ExGen500 and JetPEI). In order to determine the most efficient transfection agent, experiments were performed in 6 well plate and bottle of 100 mL of culture, which analyzed the influence of cell density, the concentration of DNA and transfection reagent volume on the expression of RVGP assessed by ELISA and fluorescence microscopy. Yields ranging from 50-90 ng/107cel were obtained in different experiments on multiwell plate, suggesting strong effect of ratio DNA: transfection agent used. Comparison of transfection agents showed no significant differences. In transfections made in suspension culture was analyzed the effect of the plasmid (whether or not the signal of BiP cell secretion) on the expression RVGP. When we used the plasmid containing the signal BiP (pMTiRVGP) were obtained 160 ng/107cel of RVGP production, and 200 ng/mL of volumetric production without significant differences between the different transfection agents. However, significant differences were found when we used the plasmid not containing the signal BiP (pMTRVGP), with the RVGP production was 60 ng/107cells in cells transfected with Cellfectin, ExGen500 and calcium phosphate, except in cells transfected with JetPEI was reached a production of 120 ng/107cells. In preliminary experiment bottle type "spinner" with a working volume of 60 mL were achieved expressions of 140 ng/107cel of RVGP in cells transfected with JetPEI and calcium phosphate. This suggests that optimization of culture conditions and transfection are possible to increase recombinant protein expression in cultured on a large scale. / A raiva é uma enfermidade causada por um vírus do gênero Lyssavirus que afeta várias espécies de mamíferos. Esta doença apresenta um alto custo social e econômico principalmente em países em desenvolvimento. Na superfície do vírus da raiva está localizada a glicoproteína do vírus, reconhecida como antígeno capaz de conferir resposta imunológica contra a raiva, sendo, o foco de pesquisas no desenvolvimento de uma vacina recombinante. Células da linhagem Drosophila melanogaster S2 estavelmente transfectadas têm sido usadas na produção de muitas proteínas heterólogas e tem sido estudada para a produção da glicoproteína do vírus da raiva (RVGP) em nosso laboratório. A abordagem para a obtenção de linhagens recombinantes estáveis envolve a seleção de populações celulares altamente produtoras; sendo um processo que requer consideráveis períodos de tempo (meses), uma elevada manipulação e altos custos de produção. Neste sentido, nas últimas décadas, muitos sistemas focados na expressão de proteínas heterólogas através da expressão transiente de genes foram analisados, porque eles permitem a obtenção de quantidades consideráveis de proteína recombinante em um curto período de tempo (semanas). Para o uso da tecnologia de transfecção transiente pode ser encontrada uma variedade de métodos e agentes disponíveis, tais como eletroporação, lipídeos catiônicos, polímeros catiônicos e fosfato de cálcio. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a expressão transiente do gene da glicoproteína do vírus da raiva (RVGP) em células de inseto da linhagem Drosophila melanogaster S2, avaliando os veículos de transfecção fosfato de cálcio, lipídeo catiônico (Cellfectin) e polímero catiônico (ExGen500 e JetPEI). A fim de determinar o agente de transfecção mais eficiente, foram feitos experimentos em placa de 6 poços e frasco de cultivo de 100mL, onde foram analisados a influência da densidade celular; a concentração de DNA, o volume do reagente de transfecção sobre a expressão da RVGP analisada através do método de ELISA. Quantidades de RVGP que variaram entre 50-90 ng/107cel foram obtidas nos diferentes experimentos feitos em placa, sugerindo um efeito da relação DNA: agente de transfecção. A comparação entre os agentes de transfecção não mostrou diferenças significativas. Nas transfecções feitas em cultura em suspensão foi analisado o efeito de transfectar o plasmídeo para expressão de RVGP contendo ou não o sinal de secreção celular BiP. Quando foi usado o plasmídeo contendo o sinal BiP (pMTiRVGP) foram atingidas valores de RVGP de 160 ng/107cel e produções volumétricas de 200 ng/mL, porém sem diferenças significativas entre os diferentes agentes de transfecção. Entretanto, foram encontradas diferenças quando foi usado o plasmídeo não contendo o sinal BiP (pMTRVGP), onde a produção de RVGP foi de 60 ng/107cells nas células transfectadas com Cellfectin, ExGen500 e fosfato de cálcio, porém as células transfectadas com JetPEI obtiveram uma produção de 120 ng/107cels de RVGP. Em experimento em frasco de cultivo tipo spinner com volume de trabalho de 60 mL, foram atingidas expressões de RVGP de 140 ng/107cel para células transfectadas com JetPEI e fosfato de cálcio, sugerindo que otimizações nas condições de cultivo e transfecção ainda podem ser testadas visando aumentar a expressão da proteína recombinante em cultivos em larga escala.

Estudos funcionais anteriores identificaram um módulo cis-regulador (MCR) de 67 pb (-253/- 187) na região promotora do gene de pufe de DNA BhC4-1 que dirige a expressão do gene repórter na glândula anelar de Drosophila melanogaster. Uma análise bioinformática identificou 67 sequências de D. melanogaster que são similares a sequências contidas no MCR de glândula anelar. Uma das sequências identificadas reside em um fragmento genômico de 657 pb localizado aproximadamente 2500 pb à montante do CG13711, 400 pb à montante do CG12493, em uma região genômica que constitui um dos íntrons do CG32239 (Gef64C). A caracterização preliminar de três linhagens transformadas com a construção 657 pb-lacZ mostrou expressão do gene repórter no sistema traqueal de larvas e prépupas e no tórax de adultos. Baseado padrão de expressão promovido por este MCR, o mesmo foi denominado Traqueia-Tórax (TT). O principal objetivo do presente trabalho constituiu estender a caracterização molecular das linhagens da série TT-lacZ. Inicialmente embriões, larvas de primeiro, segundo e terceiro estádio, prépupas 0 h, 1 h e 2 h, pupas 24 h e adultos com 1, 3 e 5 dias foram investigados quanto ao padrão de expressão do repórter utilizando ensaio histoquímico que detecta atividade de ?-galactosidase. A expressão do gene repórter é inicialmente detectada no sistema traqueal durante o terceiro estádio larval e continua a ser detectada neste tecido em prépupas 0 h, 1 h e 2 h e pupas 24 h. Em adultos, a expressão do gene repórter é verificada nos músculos longitudinais dorsais em adultos de 3 e 5 dias. Uma vez que o MCR TT reside em uma região intergênica e a informação disponível sobre os CGs próximos ainda é escassa, não foi possível inferir qual dos CGs é regulado pelo MCR TT. Neste contexto, o padrão de expressão do RNAm do gene repórter lacZ e do CG13711, CG12493 e CG32239 foi investigado no sistema traqueal de larvas e prépupas e no tórax de adultos de uma das linhagens da série TT-lacZ utilizando RT-qPCR. Os níveis de expressão do RNAm lacZ aumentam cerca de 3 vezes em prépupas 0 horas, quando comparados com os níveis de expressão do RNAm lacZ presentes no sistema traqueal de larvas de terceiro estádio. Um padrão de expressão similar foi observado no caso do CG32239 e do CG13711. Nos tóraxes de adultos de 3 e 5 dias de idade os níveis de expressão do RNAm lacZ aumentam cerca de 37 vezes e 11 vezes, respectivamente, quando comparados aos níveis de expressão iv do RNAm lacZ presentes nos tóraxes de adultos de 1 dia. No tórax de adultos, o único CG que apresenta um padrão de expressão similar ao padrão de expressão de lacZ constitui o CG12493. Em conjunto, nós concluímos que o MCR TT promove um padrão dinâmico de expressão durante o desenvolvimento. Além disso, com base nos resultados de RT-qPCR, nós sugerimos que o MCR TT regula a expressão do RNAm do CG32239 no sistema traqueal durante a transição larva-prépupa e também a expressão do RNAm do CG12493 no tórax de adultos de 3 e 5 dias de idade. Além de estender a caracterização funcional de um novo MCR, nossos resultados também contribuem com novas informações acerca dos padrões de expressão no desenvolvimento de três CGs de D. melanogaster. / Previous functional studies identified in the DNA puff BhC4-1 promoter region a 67 bp (- 253/-187) cis-regulatory module (CRM) that drives reporter gene expression in the ring gland of D. melanogaster. A bioinformatics analysis identified 67 Drosophila melanogaster sequences that are similar to sequences contained in the ring gland CRM. One of the identified sequences resides in a 657 bp genomic fragment located about 2500 bp upstream CG13711, about 400 bp upstream CG12493, in a genomic region that constitutes one of the introns of CG32239 (Gef64C). The preliminary characterization of three transgenic lines transformed with a 657 bp-lacZ construct revealed reporter gene expression in the larval/prepupal tracheal system and in adult thorax. Based on the pattern of expression driven by this CRM we named it Trachea-Thorax (TT). The main goal of this work was to extend the molecular characterization of the lines of the TT-lacZ series. Initially ?-galactosidase histochemical assays were performed in embryos, first, second and third instar larvae, 0h, 1h and 2h prepupae, 24 h pupae and 1, 3 and 5 days old adults. Reporter gene expression is initially detected during the third larval instar in the tracheal system and continues to be detected in this tissue at 0 h, 1h and 2 h prepupa and, 24 h pupa. During the adult stage, reporter gene expression is verified in the dorsal longitudinal muscles of 3 and 5 days old adults. Since the TT CRM lies in an intergenic region and the available information about the nearby CGs is still scarce it was not possible to infer which of the CGs is regulated by the TT CRM. In this context, the mRNA pattern of expression of the lacZ reporter gene and of CG13711, CG12493 and CG32239 was investigated in the tracheal system of both larvae and prepupae and in adult thoraxes of one of the transgenic lines of the TT-lacZ series using RTqPCR. The lacZ mRNA expression levels increase about 3 times in 0 h prepupae when compared to the lacZ mRNA expression levels present in the tracheal system of third instar larvae. A similar pattern of expression was observed for both CG32239 and CG13711. In three and five days old adult thoraxes lacZ mRNA expression levels increase about 37 times and 11 times, respectively, when compared to lacZ mRNA expression levels present in one day old thoraxes. In the adult thorax, the only CG that presents a similar pattern of expression constitutes CG12493. Overall, we conclude that the TT CRM drives a dynamic pattern of ii expression throughout development. Additionally, based on RT-qPCR results, we suggest that the TT CRM regulates the expression of CG32239 mRNA in the tracheal system during the larvae to prepupae transition, as well as the expression of CG12493 mRNA in the thorax of 3 and 5 days old adults. Besides extending the functional characterization of a novel CRM our results also contribute new information about the developmental patterns of expression of three Drosophila melanogaster CGs.

Visando contribuir para o conhecimento da dinâmica do estresse celular por agentes químicos e físicos e suas possíveis implicações sobre a mobilização de elementos transponíveis presentes em Drosophila, foram realizadas diferentes abordagens experimentais utilizando a espécie cosmopolita Drosophila melanogaster, e as espécies neotropicais do subgrupo willistoni, D. willistoni (três linhagens) D. equinoxialis, D. paulistorum, D. insularis e D. tropicalis. Foi verificado o efeito tóxico de disseleneto de difenila ((PhSe)2) durante diferentes estágios do ciclo de vida da Drosophila melanogaster e das espécies do subgrupo willistoni. Em D. melanogaster, as moscas adultas foram mais resistentes a intoxicação por (PhSe)2 do que larvas e pupas. De uma maneira geral as espécies do subgrupo willistoni são mais sensíveis à intoxicação por selênio do que a D. melanogaster, possivelmente explicado e de acordo com a recentemente demonstrada ausência de homologia de genes para selenoproteínas no genoma de D. willistoni com todas as onze outras espécies sequenciadas. O potencial do selênio para promover estresse celular em D. melanogaster foi evidenciado através da transcrição do gene hsp83 por Northern blot. Nas espécies do subgrupo willistoni a expressão deste gene e do hsp70 foi abordada através de Real Time PCR em resposta ao selênio e ao paraquat, que igualmente foi mais tóxico nos estágios iniciais de desenvolvimento. Os resultados da expressão dos genes de estresse, entretanto, não foram conclusivos, bem como a procura da transposase do elemento P em resposta aos tratamentos. Apesar disso foram estabelecidas às condições experimentais para a realização de experimentos futuros. / Aiming to contribute to the knowledge of the dynamics of cell stress caused by chemical and physical agents and the likely implications thereof in the mobilization of transposable elements present in Drosophila, different experimental approaches were adopted using the cosmopolitan species Drosophila melanogaster and the Neotropical species of the willistoni subgroup, D. willistoni (three strains), D. equinoxialis, D. willistoni, D. paulistorum, D. insularis and D. tropicalis. The toxic effect of diphenyl diselenide [(PhSe)2] was observed in the different life cycles of Drosophila melanogaster and of the species of the willistoni subgroup. D. melanogaster adult flies were more resistant to intoxication by (PhSe)2 as compared to larvae and pupae. Generally speaking the species belonging to the willistoni subgroup are more sensitive to intoxication by selenium as compared to D. melanogaster, which is possibly explained and in accordance to the recently demonstrated absence of gene homology of selenoproteins in the D. willistoni genome with all that of the other eleven species sequenced. The evidence of the potential exhibited by selenium to promote cell stress in D. melanogaster is shown by the hsp83 gene transcription analyzed by Northern blot. In the species of the willistoni subgroup, the expression of the hsp83 and of the hsp70 genes was analyzed by Real Time PCR in response to selenium and paraquat, which was equally more toxic in the early development stages. Nevertheless, the results of the stress gene expression were inconclusive, as well as the search for P element transposase in response to treatments. In spite of that, the experimental conditions required for future research have been established.

As células de Drosophila melanogaster (S2) têm sido utilizadas como sistemas de expressão de proteínas recombinantes. Neste trabalho foi utilizada uma linhagem S2 geneticamente modificada com vetores de expressão para a produção da glicoproteína do vírus da raiva (GPV). O principal objetivo deste trabalho foi avaliar o comportamento destas células cultivadas em processo contínuo, visando-se manter elevadas concentrações celulares. Para os ensaios contínuos, utilizou-se meio livre de soro fetal bovino SF 900 II em um reator Biostat B, com 500 mL de volume útil e controle de temperatura (28ºC), oxigênio dissolvido (30% da saturação com ar), frequência de agitação (90 rpm) e monitoramento do pH. Verificou-se o comportamento do metabolismo celular em diferentes vazões específicas de alimentação (0,8 dia-1, 0,5 dia-1 e 0,2 dia-1) através parâmetros como fatores de conversão e variáveis como concentração celular máxima, concentração residual de glicose e glutamina, dentre outras. Ainda, avaliou-se a influência de aminoácidos, tais como, glutamina, asparagina, prolina, serina e cisteína suplementados no meio de alimentação, sob a concentração celular alcançada no estado estacionário. Diferentes vazões específicas de alimentação - em estado estacionário - resultaram em concentrações celulares próximas entre si. A adição de glutamina (1,7 g/L) no meio de alimentação não contribuiu para o aumento na concentração celular, indicando que este aminoácido não limitou o processo de crescimento celular. Uma observação similar ocorreu quando o meio SF 900 II foi suplementado com asparagina, prolina, serina e cisteína. Porém, a adição de cisteína (0,3 g/L) isoladamente no meio de alimentação resultou em um aumento de 12% na concentração celular quando comparada ao meio SF 900 II puro. Assim, pode-se concluir que a cisteína limitava o crescimento celular. Verificou-se ainda que a célula não apresentou grande variabilidade nos diferentes ensaios, sob mesma vazão específica de alimentação. Isso indica que processo contínuo constituiria um método viável para a compreensão do metabolismo desta célula. / Drosophila melanogasters cells (S2) have been used as expression systems for recombinant proteins. This study uses a genetically modified S2 line with expression vectors for production of rabies virus glycoprotein (RVPG). The main objective was to evaluate the growth trend of S2 cells in a continuous process, aiming to maintain high cell concentrations. In order to set the continuous culture, the experiments used serum-free medium SF 900 II in a Biostat B reactor, with working volume of 500 mL and temperature controlled at 28 º C, dissolved oxygen at 30% air saturation, agitation speed at 90 rpm, and pH monitoring. Cellular metabolism behavior was observed under different dilution rates (0.8 day-1, 0.5 day-1, and 0.2 day-1) through parameters such as yield factors, in addition to variables such as maximum cell concentration, residual concentration of glucose and glutamine, among others. Yet, this work evaluates the influence of amino acids such as glutamine, asparagine, proline, serine and cysteine supplemented in the feed, over cellular concentration value reached in the steady state. Different dilution rates decreasing (under steady state) resulted in cell concentrations quite simillar. The addition of glutamine (1.7 g/L) in the feed did not contribute to the increase of cell concentration, which indicates that this amino acid did not limit cell growth process. A similar observation occurred when SF 900 II medium was supplemented with asparagine, proline, serine and cysteine. However, the cysteine addition (0.3 g/L) alone in the feed resulted in a 12% increase in cell concentration, compared to pure SF 900 II. Thus, it is possible to conclude that cysteine limited cell growth. It was also found that the cell did not show great variability in the various tests under the same dilution rate. This indicates that chemostat culture would be a viable method for understanding the metabolism of this cell.

Células animais são alvo de pesquisas visando sua utilização como plataforma para a expressão de proteínas recombinantes, desde vacinas veterinárias até fatores de coagulação para hemofílicos. Exemplos incluem células de inseto Drosophila melanogaster S2 e células de mamífero BHK-21, que vêm sendo estudadas visando a sua utilização para a produção da glicoproteína do vírus da raiva. Independentemente da estratégia de cultivo utilizada, altas concentrações celulares são em geral associadas a uma maior produção da proteína de interesse. O objetivo deste trabalho foi o de investigar estratégias que possibilitariam o cultivo de células animais em altas concentrações celulares. Células de inseto Drosophila melanogaster S2 produtoras da glicoproteína do vírus da raiva foram cultivadas em frascos agitados a 100 rpm e 28, em meio livre de soro SF 900 II suplementado com os aminoácidos asparagina, cisteína, prolina e serina. A adição dos quatro aminoácidos no meio de cultura refletiu em um aumento da concentração celular máxima (XV MÁX) em 16%. Cisteína, quando adicionada isoladamente no meio de cultura, refletiu em uma velocidade específica máxima de crescimento celular (MÁX) 56% maior. Nessa condição, o fator de conversão glicose a célula (YX/GLC) foi 47% maior, indicando um metabolismo de glicose mais eficiente na geração de células. Esses resultados indicam que cisteína é provavelmente substrato limitante do cultivo de células S2AcGPV em meio SF 900 II. Já células de mamífero BHK-21 (C13), adaptadas ao crescimento em suspensão, foram cultivadas em processo de perfusão, processo contínuo em que há retenção celular, o que permite alcançar concentrações celulares mais altas que processos em batelada ou em modo contínuo sem retenção celular. Foi utilizado um biorreator do tipo tanque agitado com 1,5 L de volume de trabalho e spin-filter interno, com poro de diâmetro igual a 10 m, acoplado ao eixo do impelidor. Durante o cultivo, o pH foi controlado em 7,2, a agitação em 80 rpm, a temperatura em 37 e o oxigênio dissolvido em 50% da saturação com o ar. A concentração celular máxima alcançou 15,7 x 106 céls mL-1, muito superior à do cultivo em batelada (aproximadamente 5 x 106 céls mL-1). A viabilidade celular foi superior a 90% durante os 48 dias de cultivo. Na fase batelada do cultivo em perfusão, as velocidades de consumo de glicose (qGLC) e de glutamina (qGLN) foram 84% e 32% maiores, respectivamente, em relação às velocidades observadas no cultivo em batelada. Analogamente, as velocidades de produção de lactato (qLAC) e de amônio (qNH4) foram 78% e 102% maiores, respectivamente. Ainda, o coeficiente de manutenção celular não foi desprezível, e o consumo de glicose associado à manutenção celular foi de 83%. Esses dados indicam que a presença do spin-filter interno pode estar associada a estresse celular. Na perfusão, a concentração celular foi cerca de 3 vezes maior do que no cultivo contínuo sem reciclo de células. Provou-se que é possível cultivar células BHK-21 adaptadas a crescimento em suspensão em altas concentrações celulares em escala laboratorial, utilizando biorreator de bancada e spin-filter interno como sistema de retenção celular. / Animal cells have been under research as a platform for the expression of recombinant proteins, ranging from veterinary vaccines to blood coagulation factors for treating hemophilia. Examples include insect Drosophila melanogaster S2 and hamster BHK-21 cells, currently being studied for the production of rabies virus glycoprotein. Regardless of the cultivation strategy, high cell concentrations are usually associated to a higher protein production. Thus, the aim of this research was to investigate animal cell cultivation strategies that would allow higher cell concentrations than those previously reported. Cells of Drosophila melanogaster S2 expressing the rabies virus glycoprotein (S2AcGPV) were cultivated in shake flasks at 100 rpm and 28 , in SF 900 II serum-free medium supplemented with the following amino acids: asparagine, cysteine, proline, and serine. The addition of the four amino acids to the medium increased the maximum cell concentration (XV MAX) in 16%. When only cysteine was added to the medium, the maximum specific growth rate (ÊMAX) was 56% higher. In this condition, the cell yield on glucose (YX/GLC) was 47% higher, indicating a more efficient glucose metabolism. These results show that cysteine is likely a limiting substrate of S2AcGPV cells growing in SF 900 II medium. In turn, baby hamster kidney cells (BHK-21/C13), adapted to growth in suspension culture, were cultivated in perfusion, a continuous process with cell retention that allows higher cell concentration than batch or continuous cultures without cell retention. A stirred tank bioreactor with a working volume of 1.5 L was used, with an internal spin-filter with 10 µm diameter pores attached to the impeller shaft. Temperature was controlled at 37 , pH at 7.2, agitation at 80 rpm and dissolved oxygen at 50% of air saturation. The maximum cell concentration reached 15.7 x 106 cells mL-1, much higher than the cell concentration achieved in a standard batch cultivation (5 x 106 cells mL-1). Cell viability was above 90% during the 48-day cultivation period. During the batch phase of the perfusion cultivation, specific rates of glucose (qGLC) and glutamine (qGLN) consumption were 84% and 32% higher, respectively, when compared to the batch cultivation. Similarly, the specific rates of lactate (qLAC) and ammonium (qNH4) formation were 78% and 102% higher, respectively. During perfusion, the cell maintenance coefficient was not negligible and represented 83% of total glucose consumption. These data indicate that the presence of an internal spin-filter may be associated to cell stress. In perfusion, cell concentration was about 3 times higher than that in continuous culture without cell recycle. In conclusion, it was proved that suspension-adapted BHK-21 cells can be cultivated in a laboratory-scale bioreactor with an internal spin-filter, in order to achieve high cell concentrations.

Orientador: Mário Tyago Murakami / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-20T10:58:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Polo_CarlaCristina_M.pdf: 4286137 bytes, checksum: cf12a2b67d90255468d1906d719759a3 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: As miosinas pertencem a uma família de proteínas motoras que através da hidrólise de ATP são capazes de se movimentarem pelas fibras de actina. Sua estrutura é dividida em três domínios principais: motor, responsável pela hidrólise do ATP; regulador, envolvido na ligação de cadeias leves de calmodulina e a cauda, que tem papel essencial na mediação de interações com cargas celulares, como organelas, ácidos nucleicos e outras proteínas. O organismo modelo para insetos, Drosophila melanogaster, possui 11 miosinas pertencentes a 8 classes sendo que informações funcionais e bioquímicas são escassas, e estruturais, inexistentes. Apesar dos grandes avanços obtidos nos estudos de miosinas humanas, as miosinas de inseto ainda são pouco caracterizadas não havendo estudos comparativos, como por exemplo, para a determinação de conservação de parceiros moleculares entre os diferentes filos da classificação de Lineu. Neste contexto, foram selecionados os seguintes domínios de inseto para caracterização molecular: quinase da miosina III, cauda globular da miosina V e FERM da miosina XV. A partir do cDNA da pupa e adulto do inseto foram amplificados os fragmentos de genes de interesse e clonados em vetor de clonagem, pGEM T-easy, e posteriormente de expressão, pET28a e pET28aSUMO. Após testes em diversas condições no sistema bacteriano, as construções cauda globular da miosina V (GLOB_2 e GT-f) e domínio FERM-f da miosina XV foram obtidos na fração solúvel e com rendimento suficiente para estudos estruturais. O protocolo de expressão em larga escala assim como de purificação foram estabelecidos para cada uma dessas construções. Estudos biofísicos por aSEC, DLS, CD e SAXS foram realizados para a proteína GT-f da miosina V, mostrando a proteína monomérica com alto conteúdo de hélices-alfa corroborando as análises in silico e com as caudas globulares de miosinas ortólogas já descritas. Além disso, sua termoestabilidade foi avaliada com Tm de 46 ºC e que sua estabilidade é alterada pela adição de alguns ligantes, mas não pela força iônica como verificado para a cauda globular da miosina Va humana. A estrutura a baixa resolução da GT-f foi determinada pelos experimentos de SAXS, mostrou uma proteína monomérica com forma alongada (Dmax =100 Å). Para a construção FERM-f, apesar do sucesso alcançado no protocolo de expressão e purificação, a amostra permaneceu polidispersa e com uma estrutura random coil, inviabilizado futuros experimentos. Acredita-se que a ausência do domínio MyTH4, gerou a perda de estabilidade do domínio FERM-f e será necessária a clonagem dos dois domínios fusionados para garantir a estabilidade estrutural e funcional / Abstract: Myosins belong to a motor protein superfamily that uses the ATP hydrolysis to move along actin filaments. Its structural architecture comprises three main domains: motor, responsible for ATP hydrolysis; regulator, which binds calmodulin light chains; and tail, responsible for cellular cargoes binding. Drosophila melanogaster, an insect model, has 11 myosins belonging to 8 different myosin classes; however functional and biochemical data are scanty, and, structural, absent. Although the great advances on investigating human and yeast myosins with the elucidation of molecular partners and molecular mechanisms involved in signaling, there are no comparative studies among different phyla. Therefore, in order to gain insights into insect myosins, in silico analysis were performed and some domains like kinase (myosin III), globular tail (myosin V), and FERM (myosin XV) were selected for biophysical and structural studies. From pupa and adult cDNAs, the target genes were amplified and cloned into pGEM- T-easy, pET28a and pET28aSUMO vectors. After expressions tests, the myosin V globular tail constructs, GLOB_2 and GT-f, and myosin XV FERM-f were obtained in soluble fraction and in sufficient amounts for structural studies. aSEC, DLS, CD e SAXS biophysical studies were performed to myosin V GT-f, showing that the protein is monomeric with predominance of alpha-helix in accordance with the in silico atomic model. The stability of GT-f was assessed with a Tm of 46 ºC and some molecules are able to increase the stability, while the ionic strength has no difference like was observed for the human globular tail of myosin Va. The low resolution structure determined by SAXS experiments confirmed the monomeric state and its elongated molecular shape (Dmax = 100 Å). The FERM-f construct, although the purification and expression protocol were standardized, the sample remained polydisperse with a random coil structure, disabling other biophysical experiments. It is supposed that the absence of the MyTH4 domain in the FERM-f domain results in loss of stability, and cloning and expression of fused domains will be necessary to guarantee structural and functional stability / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

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L’expression des gènes chez les organismes eucaryotes est un processus hautement régulé dans l’espace et dans le temps. Les ARN messagers, premièrement décrits comme simples intermédiaires entre l’ADN et les protéines, s’avèrent être des éléments centraux de la régulation de l’expression génique :les régulations post-transcriptionnelles vont influencer la stabilité, la traductibilité et la localisation des ARN messagers (ARNm). Le contrôle de la dégradation des ARNm est un moyen efficace d’adapter rapidement la production des protéines en fonction des besoins de la cellule. La dégradation des ARNm est un processus actif qui nécessite soit l’élimination de la coiffe en 5’ ou de la queue polyA en 3’, soit un clivage endonucléolytique. Dans la plupart des cas, le messager est premièrement déadénylé, puis décoiffé avant d’être dégradé dans le sens 5’-3’ ou dans le sens 3’-5’. De plus, les ARNm en cours de dégradation sont relocalisés dans des granules cytoplasmiques appelés Processing Bodies où les facteurs de la dégradation sont concentrés. On trouve dans les messagers codant pour des protéines dont la production doit être finement régulée, une variété importante d’éléments régulateurs (éléments cis) le plus souvent au sein de leur région 3’ non traduite. La régulation de la stabilité d’ARNm porteurs d’éléments riches en adénine et uridine (ARE) dans leur région 3’ non traduite (3’UTR) par les protéines capables de reconnaitre et lier ces éléments (ARE-BP) constitue un des exemples les plus documentés de régulations post-transcriptionnelles de l’expression des gène, mais le mécanisme moléculaire de cette régulation est encore mal compris.<p>Nous avons utilisé le messager codant pour le peptide antimicrobien CécropineA1 lié par l’ARE-BP dTIS11 comme modèle pour étudier les régulations post-transcriptionnelles dépendantes des ARE chez la drosophile. Au cours de ce travail, nous avons démontré que le messager CecA1 subit une déadénylation biphasique. En effet, une déadénylation initiale racourcie la queue polyA sans diminuer la quantité de messager, puis une seconde déadénylation, prise en charge par le complexe de déadénylation CCR-NOT nécessite la présence de la protéine dTIS11 et conduit à la dégradation totale du transcrit. L’observation des intermédiaires de la dégradation nous montre que, après sa déadénylation totale, le messager est décoiffé, puis dégradé dans les deux directions: 3’-5’ et 5’-3’. Contrairement à ce qui a été montré pour ces homologues mammifères, la protéine dTIS11 n’induit pas l’accumulation du messager CecA1 dans les Processing Bodies mais favorise la deuxième phase de déadénylation alors que le messager CecA1 est associé à la machinerie de traduction afin d’induire une dégradation rapide et efficace du transcrit.<p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Choisir un partenaire est une décision importante pour les organismes à reproduction sexuée. Une possibilité est de copier le choix d'autres individus, c'est ce que l'on appelle l'imitation du choix du partenaire, phénomène bien étudié chez les vertébrés, mais peu connu chez les invertébrés. Cette thèse porte sur l'imitation du choix du partenaire chez la drosophile (Drosophila melanogaster). J'ai tout d'abord montré que les femelles pouvaient être influencées dans leur choix par l'observation d'une seule autre femelle et que ceci était corrélé avec la pression atmosphérique. J'ai ensuite étudié si la préférence pour un type de mâle pouvait être transmise au sein de la population. Enfin j'ai commencé un travail exploratoire pour identifier les molécules impliquées dans ce processus d'imitation. Ces résultats montrent que les drosophiles peuvent exprimer des comportements complexes conduisant potentiellement à la transmission culturelle, l'isolement reproductif et la spéciation. / Mate choice is a major fitness-affecting decision in sexually reproducing organisms. A form of mate choice is mate copying, in which females choose potential mates by copying the mate choice of conspecifics. While many studies documented mate copying in vertebrates, little is known about this behaviour in invertebrates. In this thesis, I studied mate copying in Drosophila melanogaster females. I showed that female flies can build a sexual preference for one male characteristic after witnessing a single mate choice event and that the efficiency of mate copying correlates with air pressure and its variations. Then I studied the characteristics of mate copying to see whether a preference for one type of male can be transmitted into the population. Finally I tried to find some molecules that could be involved in this behaviour. These results indicate that fruit flies can express complex behaviour, which can potentially lead to cultural transmission, reproductive isolation and speciation.