O diabetes é uma doença crônica que afeta mais de 8% da população mundial. As alterações vasculares estão relacionadas às principais complicações do diabetes. A aldosterona contribui para a disfunção endotelial após a ativação do receptor mineralocorticóide (MR). Recentemente, foi demonstrado que a aldosterona ativa o receptor de estrógeno acoplado à proteína G (GPER). A ativação de GPER está relacionada a efeitos benéficos na vasculatura. Entretanto, ainda não existem estudos em artérias de resistência relacionando aldosterona e GPER e essa interação no diabetes. Dessa forma, o presente estudo testou a hipótese de que a aldosterona ativando receptores GPER promove efeitos benéficos na vasculatura, mas esses efeitos estão diminuídos no diabetes. Os objetivos foram investigar os níveis de expressão de GPER nos animais controle e db/db [camundongos com mutação no receptor de leptina que desenvolvem obesidade e diabetes tipo 2], quais efeitos da aldosterona são mediados por ativação de GPER e quais mecanismos envolvidos nessa ativação e verificar se estão alterados no diabetes. O grupo diabético apresentou maior expressão de GPER, mas não de MR. A aldosterona promoveu aumento da resposta máxima contrátil à fenilefrina (PE) somente no grupo controle, que foi revertido pelo uso do antagonista de GPER, G15. No grupo diabético, a resposta à PE já é aumentada, o uso dos antagonistas de MR e GPER reduziram a resposta da PE. A aldosterona ainda reduziu a potência de relaxamento da acetilcolina (ACh) em ambos os grupos, por ativação de MR. O antagonismo de GPER por G15 promoveu um redução adicional na potência do relaxamento no grupo controle, mas não afetou a resposta do grupo diabético. Esses achados confirmam a hipótese de que GPER exerce um papel benéfico na vasculatura e esse efeito é perdido no diabetes. Nossos resultados contribuem para a compreensão dos mecanismos que a aldosterona influencia os danos vasculares no diabetes através da ativação de receptores MR e GPER. / Diabetes is a chronic disease that affects more than 8 % of the world population. Vascular changes are related to the major complications of diabetes. Aldosterone contributes to endothelial dysfunction after activation of the mineralocorticoid receptor (MR). It was recently shown that aldosterone also activates the G protein-coupled estrogen receptor (GPER) and induces non genomic effects. The activation of GPER by estrogen or G1 is related to beneficial effects on the vasculature. However, there are no studies demonstrating the relationship between aldosterone and GPER in diabetes mellitus. Therefore, we hypothesized that the beneficial effects of aldosterone mediated by the activation of GPER receptors on vascular reactivity are decreased in diabetes mellitus. Female control and diabetic (db/db) mice [leptin receptor knockout mice that develop obesity and type 2 diabetes] were used. We determined the expression of GPER and the effect of aldosterone in the presence of MR and GPER antagonists in arteries from control and db/db mice and the major signaling pathways involved. The diabetic group showed increased GPER expression, but not MR. In the presence of aldosterone the control increased the maximal contractile response to phenylephrine (PE), and this increase was reversed by the use of GPER antagonist, G15. The response to PE is already increased in the diabetic group. Although aldosterone did not cause further increase the use of MR and GPER antagonists reduced the maximum response to PE at the same level of control. Aldosterone also reduced the potency of acetylcholine (ACh)-induced relaxation in both groups by the activation of MR. GPER antagonism caused further decrease in the potency of ACh-induced relaxation in the control group, while not affecting the response of the diabetic group. These findings confirm the hypothesis that the beneficial effects of aldosterone mediated by the activation of GPER receptors are decreased in diabetes mellitus. Our results contribute to understanding the mechanisms that aldosterone influences the vascular damage in diabetes through activation of MR and GPER receptors.

O diabetes é uma doença crônica que afeta mais de 8% da população mundial. As alterações vasculares estão relacionadas às principais complicações do diabetes. A aldosterona contribui para a disfunção endotelial após a ativação do receptor mineralocorticóide (MR). Recentemente, foi demonstrado que a aldosterona ativa o receptor de estrógeno acoplado à proteína G (GPER). A ativação de GPER está relacionada a efeitos benéficos na vasculatura. Entretanto, ainda não existem estudos em artérias de resistência relacionando aldosterona e GPER e essa interação no diabetes. Dessa forma, o presente estudo testou a hipótese de que a aldosterona ativando receptores GPER promove efeitos benéficos na vasculatura, mas esses efeitos estão diminuídos no diabetes. Os objetivos foram investigar os níveis de expressão de GPER nos animais controle e db/db [camundongos com mutação no receptor de leptina que desenvolvem obesidade e diabetes tipo 2], quais efeitos da aldosterona são mediados por ativação de GPER e quais mecanismos envolvidos nessa ativação e verificar se estão alterados no diabetes. O grupo diabético apresentou maior expressão de GPER, mas não de MR. A aldosterona promoveu aumento da resposta máxima contrátil à fenilefrina (PE) somente no grupo controle, que foi revertido pelo uso do antagonista de GPER, G15. No grupo diabético, a resposta à PE já é aumentada, o uso dos antagonistas de MR e GPER reduziram a resposta da PE. A aldosterona ainda reduziu a potência de relaxamento da acetilcolina (ACh) em ambos os grupos, por ativação de MR. O antagonismo de GPER por G15 promoveu um redução adicional na potência do relaxamento no grupo controle, mas não afetou a resposta do grupo diabético. Esses achados confirmam a hipótese de que GPER exerce um papel benéfico na vasculatura e esse efeito é perdido no diabetes. Nossos resultados contribuem para a compreensão dos mecanismos que a aldosterona influencia os danos vasculares no diabetes através da ativação de receptores MR e GPER. / Diabetes is a chronic disease that affects more than 8 % of the world population. Vascular changes are related to the major complications of diabetes. Aldosterone contributes to endothelial dysfunction after activation of the mineralocorticoid receptor (MR). It was recently shown that aldosterone also activates the G protein-coupled estrogen receptor (GPER) and induces non genomic effects. The activation of GPER by estrogen or G1 is related to beneficial effects on the vasculature. However, there are no studies demonstrating the relationship between aldosterone and GPER in diabetes mellitus. Therefore, we hypothesized that the beneficial effects of aldosterone mediated by the activation of GPER receptors on vascular reactivity are decreased in diabetes mellitus. Female control and diabetic (db/db) mice [leptin receptor knockout mice that develop obesity and type 2 diabetes] were used. We determined the expression of GPER and the effect of aldosterone in the presence of MR and GPER antagonists in arteries from control and db/db mice and the major signaling pathways involved. The diabetic group showed increased GPER expression, but not MR. In the presence of aldosterone the control increased the maximal contractile response to phenylephrine (PE), and this increase was reversed by the use of GPER antagonist, G15. The response to PE is already increased in the diabetic group. Although aldosterone did not cause further increase the use of MR and GPER antagonists reduced the maximum response to PE at the same level of control. Aldosterone also reduced the potency of acetylcholine (ACh)-induced relaxation in both groups by the activation of MR. GPER antagonism caused further decrease in the potency of ACh-induced relaxation in the control group, while not affecting the response of the diabetic group. These findings confirm the hypothesis that the beneficial effects of aldosterone mediated by the activation of GPER receptors are decreased in diabetes mellitus. Our results contribute to understanding the mechanisms that aldosterone influences the vascular damage in diabetes through activation of MR and GPER receptors.

O diabetes mellitus tipo 2 (DM2), uma doença que afeta milhões de pessoas em todo o mundo, é marcado pela presença de complicações micro e macrovasculares, as quais estão associadas à disfunção endotelial, inflamação e fibrose. A aldosterona, cujos níveis plasmáticos estão elevados em pacientes e modelos experimentais de DM2, aumenta a geração de espécies reativas de oxigênio (ERO) e a expressão de marcadores inflamatórios. As citocinas IL-1? e IL-18 são liberadas principalmente após ativação de plataformas moleculares denominadas inflamassomas, as quais incluem os receptores NLRP3. Recentemente, demonstramos que o receptor NLRP3 contribui para a disfunção vascular induzida pela aldosterona. Considerando a existência de evidências que a aldosterona, via receptor mineralocorticoide (MR) e NLRP3, induz a produção de mediadores inflamatórios e, consequentemente, ativação do inflamassoma, podendo assim contribuir para o processo inflamatório no diabetes, nós hipotetizamos que o bloqueio de receptores MR e NLRP3 previne a ativação do inflamassoma e reduz o desenvolvimento das alterações vasculares funcionais associadas ao DM2. Observamos que artérias mesentéricas de animais diabéticos apresentam aumento da expressão/ativação de caspase-1 e IL-11?, aumento dos níveis plasmáticos de IL-1?, aumento da atividade da caspase- 1 em macrófagos do lavado peritoneal e prejuízo no relaxamento dependente de endotélio, comparativamente a artérias do grupo controle. Os tratamentos com espironolactona (antagonista MR) e MCC950 (inibidor de receptor NLRP3) atenuam a disfunção vascular, reduzem a expressão e a atividade da caspase-1 e diminuem os níveis plasmáticos de IL-1?. Células de músculo liso vascular e macrófagos derivados da medula estimulados com aldosterona também apresentam aumento da expressão dos componentes do inflamassoma, o que poderia contribuir para as alterações observadas em animais diabéticos. Pacientes com DM2 apresentam correlação positiva entre os níveis de aldosterona e de IL-1? e/ou glicemia. Em conclusão, nosso estudo demonstra que a aldosterona induz disfunção vascular e processo inflamatório no diabetes tipo 2 através da ativação de MR e do inflamassoma NLRP3. / Type 2 diabetes mellitus (T2DM), a disease that affects millions of people around the world, is marked by the presence of micro and macrovascular complications, which are associated with endothelial dysfunction, inflammation and fibrosis. Aldosterone excess aggravates endothelial dysfunction in diabetes by promoting insulin resistance, fibrosis, oxidative stress and inflammation. Aldosterone activates the molecular platform inflammasome in cells of the immune system, an event that contributes to vascular dysfunction induced by the mineralocorticoid hormone. However, it is unclear whether activation of the inflammasome contributes to the effects of aldosterone in diabetes-associated vascular abnormalities. In the present study we tested the hypothesis that aldosterone induces vascular dysfunction in T2DM via activation of mineralocorticoid receptors (MR) and assembly of the NLRP3 inflammasome. To determine whether aldosterone activates the NLRP3 inflammasome and NLRP3 activation contributes to diabetes-associated vascular dysfunction, mesenteric arteries from control mice (db/m) and mice with type 2 diabetes (db/db), treated with vehicle, spironolactone (MR antagonist) or the NLRP3 antagonist MCC950, were used. Db/db mice exhibited increased vascular expression/activation of caspase-1 and IL-1?, increased plasma IL-1? levels, increased number of caspase-1-positive macrophages in the peritoneal lavage as well as reduced acetylcholine (ACh) vasodilation, compared to control db/m mice. Treatment of db/db mice with spironolactone and MCC950 reduced vascular caspase-1, decreased plasma IL-1? levels and partly restored ACh responses. Spironolactone treatment also reduced the number of caspase-1-positive-macrophages in db/db mice. Vascular smooth muscle cells and bone marrow-derived macrophages stimulated with aldosterone also exhibited increased expression of inflammatory components, which may contribute to diabetes-associated vascular changes. Patients with T2DM exhibited a correlation between aldosterone and IL-1? levels and/or glycemia. In conclusion, our study demonstrates that aldosterone induces vascular dysfunction and inflammatory process in type 2 diabetes through MR receptor activation and NLRP3 inflammation.

A ouabaína (OUA) promoveu hipertensão arterial (HA) após 5, 10 e 20 semanas de tratamento e modificou a função vascular de artérias mesentéricas de resistência (AMR). O tratamento por 5 semanas com OUA aumentou o óxido nítrico (NO) e a expressão protéica da isoforma neuronal de óxido nítrico (nNOS), ao passo que diminuiu os prostanóides vasoconstritores. Além disso, reduziu a expressão protéica da Cu-Zn superóxido dismutase (SOD) e aumentou a atividade funcional da Na+K+-ATPase. Já o tratamento por 10 semanas com OUA aumentou NO e prostanóides vasodilatadores, enquanto diminuiu a expressão protéica da nNOS e da COX-2. O tratamento por 20 semanas reduziu o NO e a expressão protéica da nNOS. Porém, aumentou o ânion superóxido, o tromboxano A2 e a expressão protéica de ambas: a SOD e a COX-2. Em conclusão, o tratamento com OUA promoveu HA e alterações funcionais em AMR, sendo estas dependentes do tempo analisado, pois no tratamento durante 5 e 10 semanas estas alterações não contribuem para a manutenção da HA, enquanto que o tratamento durante 20 semanas contribui. / Ouabain treatment (OUA) developed hypertension after 5, 10 and 20 weeks and modified the vascular function in mesenteric resistance arteries (MRA). 5-weeks treatment with OUA increased nitric oxide (NO) and neuronal isoform of nitric oxide (nNOS) protein expression. On the other side, this treatment reduced vasoconstrictors prostanoids. Besides decreased Cu-Zn superoxide dismutase (SOD) protein expression and increased functional activity of Na+K+-ATPase. 10-weeks treatment enhance NO and vasodilators prostanoids but reduced both nNOS and COX-2 protein expression. 20-weeks treatment reduced NO and nNOS protein expression. Nevertheless increased anion superoxide, tromboxan A2 and both SOD and COX-2 protein expression. In conclusion, OUA treatment induced HA and functional alterations in MRA that are time-dependents, because in 5 and 10 weeks of treatment these alterations are not likely to maintenance of HA, but the changes observed in the treatment during 20 weeks contributes.

A ouabaína (OUA) promoveu hipertensão arterial (HA) após 5, 10 e 20 semanas de tratamento e modificou a função vascular de artérias mesentéricas de resistência (AMR). O tratamento por 5 semanas com OUA aumentou o óxido nítrico (NO) e a expressão protéica da isoforma neuronal de óxido nítrico (nNOS), ao passo que diminuiu os prostanóides vasoconstritores. Além disso, reduziu a expressão protéica da Cu-Zn superóxido dismutase (SOD) e aumentou a atividade funcional da Na+K+-ATPase. Já o tratamento por 10 semanas com OUA aumentou NO e prostanóides vasodilatadores, enquanto diminuiu a expressão protéica da nNOS e da COX-2. O tratamento por 20 semanas reduziu o NO e a expressão protéica da nNOS. Porém, aumentou o ânion superóxido, o tromboxano A2 e a expressão protéica de ambas: a SOD e a COX-2. Em conclusão, o tratamento com OUA promoveu HA e alterações funcionais em AMR, sendo estas dependentes do tempo analisado, pois no tratamento durante 5 e 10 semanas estas alterações não contribuem para a manutenção da HA, enquanto que o tratamento durante 20 semanas contribui. / Ouabain treatment (OUA) developed hypertension after 5, 10 and 20 weeks and modified the vascular function in mesenteric resistance arteries (MRA). 5-weeks treatment with OUA increased nitric oxide (NO) and neuronal isoform of nitric oxide (nNOS) protein expression. On the other side, this treatment reduced vasoconstrictors prostanoids. Besides decreased Cu-Zn superoxide dismutase (SOD) protein expression and increased functional activity of Na+K+-ATPase. 10-weeks treatment enhance NO and vasodilators prostanoids but reduced both nNOS and COX-2 protein expression. 20-weeks treatment reduced NO and nNOS protein expression. Nevertheless increased anion superoxide, tromboxan A2 and both SOD and COX-2 protein expression. In conclusion, OUA treatment induced HA and functional alterations in MRA that are time-dependents, because in 5 and 10 weeks of treatment these alterations are not likely to maintenance of HA, but the changes observed in the treatment during 20 weeks contributes.