Els xenobiòtics són compostos exògens als éssers vius, i encara que no formen part de la seva bioquímica normal, s´incorporen a les seves vies metabòliques. Els xenobiòtics entren a l´organisme per diferents vies: oral (p.o.), intravenosa (i.v.) subcutània (s.c.), intramuscular (i.m.), respiratòria, etc. Els xenobiòtics es poden classificar segons el seu origen i segons els seus efectes. Els organismes, per la seva part, han desenvolupat sistemes de detoxificaxió per eliminar-los. En aquest treball, s´estudien xenobiòtics que tenen o estan desenvolupats per tenir una activitat terapèutica (fàrmacs). Aquests compostos són normalment de naturalesa lipofílica, de forma majoritària amb capacitat de difondre per les membranes cel.lulars, encara que alguns interaccionen amb transportadors específics. Un cop dins de la cèl.lula són normalment difícils d´eliminar. Per aquest motiu, els organismes transformen els xenobiòtics mitjançant processos metabòlics, i així faciliten la seva eliminació. En aquest procés de detoxificació intervenen un conjunt d´enzims poc específics que reconeixen una àmplia gamma de compostos. Les reaccions de metabolisme d´aquests enzims s´anomenen reaccions de biotransformació de fase I, i reaccions de conjugació o de fase II. En el present treball s´estudien les reaccions de fase I, que són processos d´oxidació, reducció i hidròlisi que es donen a temperatura fisiològica. El Citocrom P450, CYP450, és el principal complexe enzimàtic encarregat de les reaccions de fase I, i es caracteritza per la gran varietat de processos que poden catalitzar així com la quantitat de substractes diferents que poden metabolitzar. L´estudi es porta a terme mitjançant experiments in vitro en un sistema d´incubacions en microsomes de fetge de rata. Les isoformes on s´estudien les possibles interaccions en la seva activitat són: CYP1A1/2, CYP2A1/2, CYP2B1/2, CYP2C, CYP2C11, CYP2D1, CYP2E1 i CYP3A1/2. Per assolir aquest objectiu global, es va obtenir i caracteritzar el sistema experimental (microsomes de fetge de rata), es van posar a punt sistemes analítics per avaluar les cinètiques enzimàtiques, i es van desenvolupar models cinètics pel tractament de les dades experimentals.

No description available.

Aquest treball està centrat en l'estudi i caracterització del gen SA de ratolí. Inicialment, en el nostre laboratori, es va identificar com un gen regulat per andrògens d'expressió exclusivament renal. Analitzant la distribució tissular del gen SA s'ha observat que s'expressa en altres teixits com el fetge, l'estómac o el testicle. S'ha aprofundit en l'estudi de la regulació del gen SA per part de les hormones sexuals, andrògens i estrògens, en el ronyó i el fetge de ratolí, òrgans a on s'expressa de forma abundant, especialment al ronyó.S'ha clonat el gen SA de ratolí complert, determinant l'organització genòmica i els límits exò/intrò; s'han obtingut diferents transcrits resultat de la transcripció del gen, la diferència entre ells es troba en la regió 5' gràcies a les diverses combinacions que es donen entre els tres primers exons no codificants del gen. S'han clonat 2 Kb del promotor pròxim del gen SA. Diferents fragments d'aquesta regió s'han fusionat al gen reportador luciferasa i les construccions obtingudes s'han utilitzat per determinar l'activitat promotora, en assajos de transfecció transitòria. Aquests assajos han permés definir i posteriorment analitzar possibles elements reguladors presents en el promotor SA, implicats tant en l'expressió basal com en la resposta andrògenica del gen, en vaires línies cel.lulars renals i una línia cel.lular hepàtica. S'han produït anticossos policlonals contra pèptids sintètics específics de la proteïna SA que han permés idenficar-la en extractes proteics de ronyó de ratolí. S'ha comprovat que la seva regulació androgènica és paral.lela a la del corresponent mRNA. La SA s'ha identificat com una medium-chain acyl-CoA synthetase mitocondrial, en aquest treball hem demostrat la seva localització mitocondrial en una línia cel.lular renal, així com, la seva activitat enzimàtica en front a un substracte hidrocarbonat com l'àcid octanoic. L'elevada homologia a nivell de seqüència aminoacídica que presenta la SA amb altres enzims acil-CoA sintetasa ens ha permés identificar un domini d'unió a l'àcid gras en la proteïna molt conservat en tots aquests enzims. Mitjançant tècniques de mutagènesi hem observat que algun dels aminoàcids que formen aquest domini podrien ésser essencials en l'activitat enzimàtica de la SA.Donat que la proteïna SA participa en el metabolisme dels àcids grassos, en aquest treball hem estudiat la possible implicació dels receptor nuclears PPAR sobre l'expressió del gen SA, realitzant estudis in vitro a nivell d'activitat promotora en assajos de transfecció transitòria i, realitzant estudis in vivo amb ratolins mascle que s'han sotmés al tractament farmacològic d'agonistes específics per aquests receptors. / This work is based in the study and characterization of the mouse SA gene. We had first identified the mouse SA gene on the basis of its strong androgenic regulation in mouse kidney. Analyzing the tissue distribution of the gene it has been observed that is expressed in other tissues like the liver, the stomach or the testicle. It has been study the regulation of the gene by sexual hormones, androgens and estrogens, in the kidney and the liver of mouse, organs where it are expressed of abundant form, specially in the kidney. The complete mouse gene has been cloned, determining the genomic organization and the exon/intron boundaries; they have been obtained different transcripts result from the transcription of the gene, the difference among them is in the region 5' thanks to the diverse combinations that occur between the three first untranslated exons of the gene. We have cloned 2 Kb of the SA gene promoter. Different fragments from this region have cloned to the reporter gene luciferasa vector and the obtained constructions have been used to determine the transcriptional activity, by transitory transfection. These tests have allowed to define and later to analyze some regulating elements in SA promoter, implied so much in the basal expression as in the androgenic regulation of the gene, in several kidney and liver cellular lines. Polyclonal antibodies raised against SA-specific peptides revealed it in mouse kidney extracts. The protein androgenic regulation is parallel that of the mRNA. The SA protein has been identified like a medium-chain acyl-CoA synthetase located in the mitochondria, in this work we have demonstrated its mitochondrial location in a renal cellular line, as well as, its enzymatic activity forehead to a hydrocarbon substratum like octanoic acid. The SA present elevated homology with other enzymes acyl-CoA synthetase has allowed us to identify a binding domain to fatty acid in the protein very conserved in all these enzymes. By means of mutagenic techniques we have observed that some of the amino acids that form this binding domain be able essential in the SA enzymatic activity. Since SA protein participates in the metabolism of fatty acids, in this work we have analised the possible implication of the PPAR's on the SA expression gene, having made studies in vitro of transcriptional activity by transitory transfection and, doing studies in vivo with mice male that have been put under the farmacologycal treatment of specific agonists for these PPAR's.

El treball consisteix en la realització del balanç energètic global i també del balanç nitrogenat, en diferents models d'obesitat. En relació al balanç de nitrogen s'ha utilitzat un enfoc nou, de manera que s'han analitzat tots els components, és a dir, la ingesta, les excretes, per orina i femta, i també el dipositat en l'animal. També s'ha realitzat, utilitzant el mateix plantejament, un balanç detallat de cada un dels diferents aminoàcids. Aquests balanços s'han portat a terme en dos models d'obesitat, per un costat s'estudiat l'obesitat induïda per la dieta, mitjançant la administració d'una dieta hipercalòrica, com és la dieta anomenada "de cafeteria" i que consisteix en oferir a l'animal una varietat d'aliments atraients (dels consumits normalment per l'home), que són en general rics en greixos i glúcids. Per altra banda, s'estudiat l'obesitat de tipus genètic, utilitzant-se la rata de la soca Zucker (fa/fa), caracteritzada per presentar una obesitat que es transmet per herència autosòmica receciva, i a més és una obesitat amb caracteristiques metabòliques similars a l'obesitat humana. També s'ha utilitzat la rata Wistar com a referència atès que ha estat ampliament descrita.Pel que fa a l'estudi del balanç energètic, s'observa que l'administració de una dieta "de cafeteria" comporta un increment en l'acumulació de lípids i també, encara que menys important, de proteïnes. Aquesta alta eficiència en la deposició de greix és predominant en la rata obesa fa/fa i màxima quan està sotmesa a dieta "de cafeteria", mostrant un efecte aditiu. Pel que fa a la eficiència de deposició de proteïnes s'observa que és més alta per aquells grups de rates tractades amb dieta "de cafeteria". Cal destacar, que en cap cas la rata obesa fa/fa mostra una menor eficiència de deposició de proteïnes, contrariament al descrit.En l'estudi del balanç de nitrogen, s'observa que en l'obesitat induïda per la dieta "de cafeteria", en la soca Wistar i també en el fenotip prim de la soca Zucker, la ingesta de nitrogen és més baixa, però en canvi la retenció és similar. Això sembla donar-se gràcies a una absorció de N a nivell intestinal més eficient, perquè es recupera menys N en femta que en els animals amb dieta control (pinso per a rates). També es troba una disminució de l'utilització del N que ha estat absorbit, excretan-se menys nitrogen i menys urea per orina. Aquest comportament no s'observa pel que fa a l'obesitat de la rata fa/fa, ja que aquest animal mostra una menor eficiència en la retenció del N, de manera que presenta una ingesta i unes pèrdues de N, tant en femta com en orina, més elevades que els animals prims, tot i que en valor absoluts el N retingut en el cos es igual al dels animals prims. Quan la rata fa/fa es sotmet a dieta "de cafeteria" mostra uncomportament similar a les rates primes, es a dir, redueix la ingesta de nitrogen, però incrementa l'eficiència d'absorció intestinal, excretan-se menys proporció de N en femta, alhora que també redueix el catabolisme nitrogenat, excretant menys N i urea en orina, augmentant doncs la proporció de N ingerit que és retingut en el cos de l'animal.Cal destacar de l'estudi del balanç de N que en tots els casos es troba una proporció de N ingerit que no és recuperat en cap de les fraccions estudiades. Errors metodològics (sobre-estimació de la ingesta, pèrdues de pel, pèrdues de NH+(4) pels pulmons) no poden explicar la quantitat de N no trobat, que representa d'un 10% a un 27% del N ingerit en controls i "cafeteria" respectivament. En diverses ocasions s'ha plantejat la possibilitat de producció de nitrogen gas, en aquest sentit, es descriu que en l'home i el ratolí es produeix un alliberament de N(2) que pot representar fins un 10% del N de la ingesta, i a més, sembla que la producció estigui correlacionada amb la quantitat de proteïna present a la dieta.Quant a l'estudi del balanç d'aminoàcids, es ratifiquen els trets generals observats en el balanç global de N, de manera que les rates sotmeses a dieta "de cafeteria" tenen una més gran eficiència d'absorció, eliminant-se menys aminoàcids per la femta i mostrant una retenció més elevada. Aquest és un fet que s'observa en general per tots els aminoàcids, tant essencials com no essencials, tot i que les taxes d'absorció dels diferents aminoàcids no és uniforme, fet que pot estar relacionat per canvis en els sistemes de transport intestinals induïts per la dieta.Amb l'estudi del balanç detallat de cada aminoàcids s'ha pogut observar que les rates alimentades amb dieta "de cafeteria" seleccionen una dieta que finalment mostra el mateix patró d'aminoàcids que la dieta control, fet que evidencia la capacitat d'aquest animal per controlar d'una manera molt precisa la seva ingesta proteica. Això s'observa en els tres tipus de rates estudiades, incloent-hi la rata Zucker obesa (fa/fa), malgrat presentar un control energètic global alterat. També es pot afirmar que la dieta "de cafeteria" aporta una proporció d'aminoàcids adequada, i no és deficient en aquest sentit, tal i com s'ha suggerit en algunes ocasions. Per la composición de la dieta consumida pels animals, comparant control i "cafeteria", suggerim que el millor aprofitament de la proteïna que es dóna en la dieta "de cafeteria" pot ser causat per la més gran proporció de greix que aquesta conté.Fent referència a la deposició dels diferents aminoàcids en el cos de l'animal, s'observa que la dieta de cafeteria no afecta a una acreció diferencial d'aminoàcids, però sí que afecta a la velocitat de creixement, promovent un increment d'aquest en tots els tipus de rates. Per altra banda, s'observen diferencies de soca, de manera que la rata Zucker prima para de créixer abans que la rata Wistar. Pel que fa a la rata obesa, segueix creixent durant més temps que les rates controls primes, mantenint durant tot el periode estudiat una taxa d'acreció proteica elevada, fet que pot indicar una alteració en el senyal d'atur del creixement.També s'ha estudiat els nivells dels aminoàcids plasmàtics, aixr com d'altres paràmetres plasmàtics com urea, glucosa, proteïnes i N(o)-amínic, per tal de copsar quina és la disponibilitat dels aminoàcids pels diferents teixits, així com la seva metabolització. En aquest sentit es troba que la dieta "de cafeteria" incrementa en general el nivell dels aminoàcids plasmàtics en la rata prima, però contrariament disminueixen en la rata obesa sotmesa a aquesta dieta, fet que es podria relacionar amb unes pèrdues per orina d'aminoàcids més elevades, indicant una possible alteración de la filtració a nivell renal. En els grups de rates tractades amb dieta control no s'obseven en general diferencies entre els nivells plasmàtics dels diferents aminoàcids entre rates primes i obeses, a excepció dels aminoàcids de cadena ramificada que mostren uns nivells significativamente més elevats en les rates obeses, tret possiblement relacionat amb la resistència a la insulina present en aquests animals. En tots els casos l'urea plasmàtica disminueix amb la dieta "de cafeteria", mentre que els nivells de glucosa incrementen.S'observa també un comportament diferent pel que fa a l'excreció d'aminoàcids per orina, de manera que en les rates de la soca Zucker els nivells d'aminoàcids en orina són més elevats per la dieta "de cafeteria", contrariament al que passa amb la soca Wistar. El patró d'aminoàcids en orina no és diferent en els casos de la rata prima i obesa, excepte per la Hyp que no es troba en l'orina de la rata obesa amb dieta control. / The carcass accretion of lipid, protein and carbohydrate was measured in Wistar, Zuckerlean and Zucker obese rats fed a controlled standard or "cafeteria" diets from days 30 to 60 after birth. In all, groups the cafeteria· diet induced a higher carcass energy deposition than the reference diet. Obese Zucker rats deposited larger amounts of lipids than other animals studied, the effect of cafeteria-diet in these animals were partly' additive. In all groups, cafeteria-feeding induced a relative increase in fat deposition as well as increases in gross weight and protein.The nitrogen balance of Wistar and Zucker rats (Iean and obese) fed reference and cafeteria diets also has been determined by measuring the intake, fecal and urinary excretion and nitrogen deposition in the body. Obese Zucker rats showed a lower proportion of dietary nitrogen absorption and body nitrogen retention than lean rats. Cafeteria-diet increased the retention of dietary nitrogen and lowered urinary nitrogen losses in both obese and lean rats. The accurate measurement of nitrogen intake, excretion and deposition showed a consistent proportion of nitrogen unaccounted for (10-26% of net intake) in the studied fractions, which proportion was higher in the cafeteria diet-fed rats.The individual amino acid balance also has been determined with the same experimentalset up. All rats cafeteria-feeding had a higher dietary protein digestion/absorption efficiency for all amino acids in general and had a grew faster than reference diet-feeding rats. The obese rats wasted a high proportion of dietary amino acids when given reference-diet, but not on the cafeteria-diet. Cafeteria feeding results in an essentially equal amino acid intake to that from the reference diet. In general the urinary losses of amino acids were small. Cafeteria-diet induced an increase of plasma amino acids levels in lean rats, but not effect was found in obese rats.

En este trabajo se han realizado estudios sobre el transporte de aminoácidos en vesículas de membrana plasmática de hígado de rata, intentando correlacionar las alteraciones observadas en la captación hepática de aminoácidos "in vivo" con cambios estables en las propiedades cinéticas de los sistemas de transporte estudiadas "in vitro". Se han estudiado tres situaciones experimentales diferentes: ayuno, gestación y lactancia. Posteriormente se han realizado estudios sobre el posible efecto a corto plazo de diversas hormonas (Glucagón, Insulina y Factor de Crecimiento Epidermal "EGF") sobre el transporte de aminoácidos en vesículas de membrana plasmática de hígado de rata.En los resultados expuestos en esta memoria sobre la modulación "in vivo" e "in vitro" de la captación de L-alanina por vesículas de membrana plasmática de hígado de rata, se han observado los siguientes puntos:1. - En la rata, la privación de alimento produce un aumento de la afinidad (Km) y un descenso de la capacidad (Vmax) de los sistemas de transporte de L-alanina. Estos cambios en los parámetros cinéticos están altamente correlacionados con un descenso gradual en la asequibilidad portal de alanina.2. - Durante el ayuno, se producen cambios importantes en la inhibición de la función transportadora por otros aminoácidos naturales. La estrategia utilizada para discernir entre la proporción relativa de los sistemas de transporte en la captación de L-alanina, mediante pruebas con MeAIB y Litio, revelan que estos cambios no parecen ser atribuibles a una modificación en la participación de los sistemas A y ASC en el transporte total de alanina.3. - La fuerte correlación existente entre los cambios de Km y las K(1/2) del efecto inhibidor sobre el transporte de agentes modificadores de grupos -SH, como el NEM o el PCMBS, revelan cambios conformacionales en la(s) molécula(s) transportadora(s). Esta posibilidad es compatible con la presencia de grupos -SH en el centro activo de la proteína o, alternativamente, en dominios muy directamente implicados con la función transportadora.4. - En la gestación y la lactancia, situaciones fisiológicas caracterizadas por un aumento en la captación hepática de aminoácidos "in vivo", se comprueba que los índices de captación de L-a1anina calculados a partir de las medidas de transporte en preparaciones de vesículas de membrana plasmática de hígado, están incrementados en el rango de concentraciones fisiológicas de substrato. No obstante, las adaptaciones realizadas mediante cambios en los parámetros cinéticos en ambas situaciones fisiológicas son diferentes; mientras que en la gestación se detecta un incremento de Vmax, durante la lactancia se observa un descenso de Km, que creemos atribuible a un cambio en la participación relativa de los sistemas A y ASC en el transporte total de este aminoácido a nivel hepático. 5. - El glucagón y el factor de crecimiento epidermal (EGF) ejercen acciones inhibidoras, a muy corto plazo, sobre el transporte de aminoácidos en vesículas de membrana plasmática de hígado de rata. Su acción parece ser específica sobre aquellos transportadores que utilizan al ión sodio como co-substrato del aminoácido, puesto que no se detecta ningún efecto al estudiarse el transporte de L-leucina. El efecto inhibidor de estos péptidos parece realizarse acelerando la disipación del gradiente de sodio a través del "antiporter" Na(+)-H(+), ya que dicho efecto se revierte al ser estudiado en presencia de HMA, un derivado de la amilorida que actúa como inhibidor específico del "antiporter".6. - Dado que en las preparaciones vesiculares utilizadas no existe actividad Na-K ATPasa funcional, podemos concluir que los efectos hormonales observados en nuestras vesículas de membrana plasmática son compatibles con la hipótesis que sugiere que los efectos estimuladores de glucagón y EGF sobre el transporte dependiente de sodio de aminoácidos a nivel hepático, se realizarían mediante la hiperpolarización de la membrana.Debido a los anteriores resultados los factores que determinarían las tasas de captación hepática de aminoácidos "in vivo" serían producto de, al menos, las siguientes adaptaciones: En primer lugar, cambios en los parámetros cinéticos de sistemas transportadores. Estos cambios pueden implicar tanto modificaciones de capacidad total (Vmax) como de afinidad (Km). En este último caso, parece que esta adaptación pueda llevarse a cabo, tanto modificándose la proporción relativa de transporte de los sistemas implicados en la captación de L-alanina, como induciéndose, de forma todavía no conocida, la presencia de formas moleculares que, si bien obedecen a las características bioquímicas descritas para sistemas ya conocidos, actúan con una afinidad distinta hacia el substrato.Por otra parte, en los casos en que se detectan cambios de afinidad hacia el substrato, es esperable y así se comprueba que existan modificaciones en la eficacia inhibidora del transporte dependiente de sodio de L-alanina por parte de otros aminoácidos naturales. Si a este hecho le añadimos la evidencia de que en cada situación fisiológica el patrón de concentraciones de aminoácidos en la vena porta varía, es fácil imaginar que ambos factores, cambio de concentración y de eficacia inhibidora, jugarán un papel importante a la hora de determinar la captación neta "in vivo".Finalmente el contexto hormonal existente en la vena porta juega un papel decisivo en la modulación de la captación neta de aminoácidos "in vivo". Obviamente, este factor no está presente en las preparaciones vesiculares y debe considerarse a la hora de determinar hasta que punto los cambios observados, en los balances hepáticos de aminoácidos "in vivo", pueden ser explicados por modificaciones estables de la cinética de los sistemas responsables de su transporte. / It has been studied the alanine transport in plasma membrane vesicles from rat livers. The studies have been focused on to correlate the changes in hepatic amino acid metabolism "in vivo" with the changes in kinetic values "in vitro". It has been chosen three experimental models: food deprivation, pregnancy and 1actation. Starvation induced a decrease in Km (2.32, 1.60, 1.10 mM) and Vmax (1.86, 1.69, 1.10 pmol Ala/l0s per microgr. protein) for control, fasted 24h and 48h respectively. The Km va1ues have a good relation with the decrease in hepatic availability and with a decrease in the K(l/2) values from sensitivity to sulfhydryl specific reagents such as NEM and PCMBS. Studies with Li and MeAIB show that the proportion of A and ASC systems not change during starvation. This results suggest that it can exist changes in conformational status of transport proteins. In the studies with late pregnant rats, it has been found a light increase in Vmax values (1.7 vs 2.0 pmol Ala/l0s per microg. protein) without changes in Km (2.3 vs 1.8 mM) for virgin and pregnant rats respective1y. The alanine utilization rates, as calculated from plasma membrane enzyme marker recoveries, were enhanced in the physiological range of alanine concentration in blood.Kinetic parameters of alanine transport were measured in plasma membrane vesicles from livers of 15 days lactating rats. Lactation induced 10w Vmax and Km va1ues of the sodium dependent alanine component of transport (1.8 vs 1.3 pmol A1a/10s per microgr. protein and 2.3 vs 1.2 mM, respectively). At the same way than late pregnant rats the alanine utilization rates were enhanced. The decrease of Km values seen to be atributable to a greater contribution of system A to the total Na+-dependent alanine transport as deduced from less tolerance to lithium substitution instead Na, a greater inhibition of alanine transport by saturating amounts of MeAIB y proline, and higher sensitivity to NEM and PCMBS. Finally, it has been studied the hormonal short-term effects of glucagon and EGF on sodium dependent alanine transport in plasma membrane vesicles from rat liver. The resu1ts suggest that the hormone action on Na+ dependent amino acid transport is modifying the sodium electrochemical flux through the Na+-H+ antiporter. This hipothesis is based from studies on selective inhibition of antiporter activity.

Aquesta Tesi doctoral aprofundeix en el coneixement del metabolisme cel·lular, concretament en el metabolisme central del carboni de cèl·lules no tumorals transfectades amb un oncogen (HRas) amb una mutació puntual (G12V), de cèl·lules no tumorals amb delecions puntuals en els enzims clau que controlen la progressió a través del cicle cel·lular (CDK4 i CDK6) o de cèl·lules tumorals tractades amb agents antitumorals. El metabolisme, vist com un nivell integrador de moltes de les vies de transducció de senyals, pot servir no només per entendre com es produeixen les alteracions que porten a l'adquisició d'un fenotip tumoral maligne, sinó que pot oferir una sèrie de dianes terapèutiques basades en impedir l'adaptació específica de la cèl·lula tumoral als canvis durant el procés de malignitat o davant tractaments antitumorals. Amb aquesta finalitat, en aquesta Tesi Doctoral se li ha donat especial importància a la síntesi i desenvolupament de nous compostos amb potencial antitumoral dels que s'ha fet un estudi molecular i metabòlic detallat per poder observar la resposta de la cèl·lula tumoral front de les pertorbacions provocades. El coneixement detallat dels efectes a nivell molecular i metabòlic de potencials fàrmacs és d'esperar que sigui de gran utilitat a l'hora de dissenyar teràpies combinades per potenciar sinergies entre fàrmacs i evitar els possibles efectes secundaris no desitjats. S'han utilitzat models in vitro i s'han estudiat les seves alteracions moleculars i metabòliques: en el primer capítol s'ha posat de manifest, mitjançant l'ús de fibroblasts embriogènics de ratolí deficients en CDK4, CDK6 i CDK2, que la inhibició de la transició G1 / S del cicle cel·lular reverteix l'ús de les branques oxidativa i no oxidativa de la ruta de les pentoses fosfat característica de tumors. A continuació, s'han caracteritzat nous inhibidors de CDK4 i CDK6 identificats amb eines bioinformàtiques en diferents línies cel·lulars per així millorar el disseny racional de noves teràpies dirigides a tumors deficients en el supressor tumoral p16INK4a i que mantinguin el pRB inalterat. En el tercer capítol es caracteritza una nova família de lactones sintètiques disubstituidas per validar els seus efectes antitumorals i inhibitoris de les proteïnes clau de la fase G1 del cicle cel·lular, CDK4 i CDK6. Els efectes moleculars o activitat dels compostos i la relació amb la seva estructura proporcionen informació valuosa per al disseny racional de noves teràpies. En el quart capítol s'analitzen els efectes moleculars de l'àcid metilselenínic. El compost és capaç de translocar FOXO al nucli i en cèl·lules de carcinoma humà de pulmó A-549 indueix efectes moleculars que són explicats pel nou mecanisme d'acció descrit. Finalment, en el capítol 5 s'aprofundeix sobre el perfil metabòlic associat a la transfecció de l'oncogen HRas amb una mutació puntual en el codó 12. / There are numerous experimental evidences showing that a large number of tumours are associated with deregulation of cyclin D-CDK4/6-INK4a-pRb pathway, and in particular the reduction of normal levels of p16INK4a, a natural inhibitor of CDK4/6 protein. Therefore, obtaining inhibitors of these proteins can be extremely useful in selective therapeutic treatments against cancer. Currently there are molecules, some of them already in clinical phase, which inhibit CDK4/CDK6 competing with ATP. However, given the large number of kinase proteins that exist in the body, these molecules could cause numerous side effects. It is therefore of great interest to design specific inhibitors CDK4/CDK6 using a different strategy and eliminate these side effects.It is therefore expected that CDK4/CDK6 inhibitors developed in this work will have high practical applicability and usefulness in cancer treatment. The designed inhibitors mimic the binding site of p16 and not the binding ATP as most CDK inhibitors currently available and in consequence they will be highly specific to CDK4/6 kinases.Moreover, in this thesis we elucidated the mechanism of action of metilselenínic acid (MSeA). The treatment of MSeA on human lung carcinoma cell line A-549 provokes a cell cycle arrest in G1 phase of the cell cycle, apoptosis, reactive oxygen species detoxification at 24, 48 and 72h as well as metabolic effects at 24h that could be explained by the FOXO translocation to the nucleus.Furthermore, phenotypic specificity shown by different KRas transfectants raises the question whether metabolic adaptation of this mutated gene causes is specific from the mutated isoform, and thus is maintained by introducing mutated isoform of H-ras in mouse fibroblast cells. Thus, in this section of the work, we considered doing a metabolomic characterization of NIH-3T3 cells transfected with copies of HRas oncogene containing a substitution similar to those already tested in K-ras: replacement of glycine at position 12 by a valine. This would open the possibility of using a sensitivity analysis similar to that in KRas, which allows the specific design of therapies depending on the metabolic profile observed.

En l'entramat metabòlic cel·lular, milers de substrats estan interconnectats mitjançant reaccions bioquímiques. Tot i que aquest alt grau d'interrelació podria conduir al flux de substrats en múltiples direccions simultàniament, a la pràctica els fluxos metabòlics passen a través de rutes específiques. Els nostres estudis evolutius sobre el metabolisme del glicogen mostren que els isoenzims que catalitzen les diverses etapes d'aquesta ruta contribueixen a definir i a aïllar els mòduls funcionals, un punt clau per entendre la organització metabòlica en els vertebrats. Aquests isoenzims específics de teixit sorgeixen per duplicació gènica a l'origen dels vertebrats i que les seves propietats bioquímiques co-evolucionen per adaptar-se a les necessitats metabòliques específiques dels teixits on s'expressen. La retroinhibició de les hexoquinases d'alta afinitat o l'activació al·lostèrica de les glicogen sintases, ambdós efectes mediats per la glucosa-6-fosfat, són clars exemples de que les característiques cinètiques dels isoenzims es modulen al llarg de l'evolució dels vertebrats per satisfer les diferents funcions del metabolisme del glicogen. A més, els nostres resultats ajuden a entendre la única situació descrita on, paradoxalment, els isoenzims del metabolisme del glicogen majoritaris en cervell, múscul i fetge es barregen i es co-expressen en el mateix teixit: el fetge embrionari de mamífer. Els resultats presentats en aquesta memòria indiquen que la síntesi de glicogen en el fetge embrionari, essencial per assegurar la supervivència del nounat, requereix la re-organització de l'expressió dels isoenzims que hi participen, a fi d'estabilitzar el contingut de glicogen embrionari en front de les variables condicions fisiològiques maternes.Estudis previs indicaven que els ratolins defectius per la isoforma muscular de la glicogen sintasa mostren greus defectes en el desenvolupament cardíac. Per aprofundir en les bases moleculars d'aquesta alteració, hem caracteritzat la translocació nucleo-citoplàsmica de la glicogen sintasa muscular humana i hem analitzat la seva funció en el nucli. Els nostres resultats mostren com aquest enzim transloca vers al nucli i forma agregats nuclears quan es deplecionen les reserves de glicogen de la cèl·lula. A més, els resultats obtinguts amb els mutants de deleció de l'enzim indiquen que el domini implicat en l'activació al·lostèrica de l'enzim per G6P, la regió rica en arginines, és crucial per a la seva acumulació nuclear. En conjunt, aquestes observacions suggereixen que, a part de la funció metabòlica, la glicogen sintasa podria participar en processos nuclears on es requerís un sensor de l'estat energètic de la cèl·lula. / In the metabolic network of the cell, hundreds of substrates are interconnected through biochemical reactions. Although such interconnection could lead to the simultaneous flow of substrates in numerous directions, in practice metabolic fluxes pass through specific pathways. Our metabolic and evolutionary studies on glycogen metabolism showed that isoenzymes contribute to define and isolate separate functional modules, a key issue to understand metabolic organisation in vertebrates. These tissue-specific isoenzymes are generated by gene duplication at the dawn of vertebrates and their biochemical properties co-evolved to suit specific metabolic roles of the tissues where they are expressed. The retro inhibition of high-affinity hexokinases, or glycogen synthase allosteric activation, both effects mediated by G6P, are clear examples of kinetic features that are modulated through vertebrate evolution to satisfy different roles of glycogen metabolism. Furthermore, our results help to understand the only reported situation where, paradoxally, isoenzymes of glycogen metabolism enzymes from liver, muscle and brain are merged and co-expressed in the same tissue: the mammalian embryonic liver. Our results indicate that embryonic glycogen synthesis in liver, essential for newborn survival, requires the re-design of isoenzyme distribution in order to buffer the embryonic glycogen content in front of changing maternal metabolic conditions. In addition, it has been described that muscle glycogen synthase isoenzyme (MGS) knockout mice show severe developmental heart defects. In order to adress the molecular basis of this growth alteration, we characterised the nucleo-cytoplasmic translocation of MGS and analyzed its nuclear function. We showed that this enzyme translocate into the nucleus and form nuclear aggregates when cells are depleted of glucose and glycogen deposits. Moreover, the results that we obtained with the deletion mutants indicate that the domain involved in the allosteric activation of the enzyme by G6P, the arginine-rich cluster, is crucial for its nuclear acumulation. Taken together, these observations suggest that, in addition to its metabolic function, MGS may participate in nuclear processes which would require a sensor of the cellular enregy state.

1) INTRODUCCIÓUna característica fonamental del múscul esquelètic és la gran diversitat que presenta. No hi ha cap múscul idèntic a un altre, músculs homòlegs de diferents espècies i fins i tot dins del mateix animal presenten diferències en la composició fibril.lar. Aquesta heterogeneïtat reflecteix l'alt grau d'especialització i a més, és la base de la seva plasticitat funcional.El múscul esquelètic té una gran capacitat d'adaptació. És d'esperar que músculs que estan predominantment involucrats en el manteniment de la posició corporal siguin diferents dels que intervenen en moviments espontanis. Així, músculs que podem dir que estan tot el dia en contracció (músculs posturals), reben molta quantitat d'estímuls i són músculs de contracció lenta que es caracteritzen per l'alta capacitat oxidativa i estan formats principalment per fibres de tipus I. (Per exemple el múscul "Soleus", en el conill).En canvi els músculs que s'utilitzen de forma espontània, només reben impulsos de tant en tant. Són músculs de contracció ràpida i es caracteritzen per la gran capacitat glucolítica, formats majoritàriament per fibres de tipus II (Per exemple el múscul "Tibialis anterior" en el conill).Les fibres musculars estan en un estat dinàmic, la qual cosa explica l'habilitat que tenen de respondre específicament, amb canvis en l'expressió fenotípica, a una demanda funcional diferent.Tant amb l'exercici com amb l'estimulació elèctrica es provoca un augment de l'activitat contràctil. Així, les característiques fenotípiques dels músculs que intervinguin a l'exercici o que siguin sotmesos a l'estimulaci6 elèctrica es modificaran com a resposta adaptativa a la nova demanda funcional.Tots els canvis que es donen en aquesta resposta adaptativa ho fan de forma seqüencial i ordenada, per tant és d'esperar que hi hagi algun tipus de senyal que els iniciï i que es produeixi a les primeres fases del procés adaptatiu. Aquesta hipòtesi ens ha portat a estudiar les modificacions de les concentracions musculars de diferents metabòlits durant períodes curts d'activitat contràctil, amb l'objectiu d'estudiar quins metabòlits podrien actuar com a senyal iniciador dels canvis que es donen en la transformació del múscul esquelètic i el comportament d'aquest durant l'exercici.2) MÈTODESPer poder assolir l'objectiu proposat es varen utilitzar diferents models experimentals. Una part d'aquests es realitzà amb conills ("Oricfolagus cuniculus"). El model consistí a sotmetre el múscul "Tibialis anterior" (TA) a una estimulació crònica a baixa freqüència (l0 Hz) durant un període aproximat de dos mesos.A tots els animals la pota contralateral va ser utilitzada com a control, implantant-hi els elèctrodes però sense estimular-la.Es van obtenir mostres als temps d'estimulaci6: 15 minuts, 1, 3, 12 i 24 hores; 2, 4, 10 i 50 dies. Per cada punt es van utilitzar entre 3 i 4 animals.Després de tenir ben caracteritzats els canvis metabòlics, durant el procés d'estimulació, ens centràrem en una altra situació experimental. Una de les potes posteriors es sotmetia a un període de 24 hores d'estimulació contínua a 10 Hz (pota entrenada), mentre que la contralateral (pota control) es mantenia en repòs. Quan els músculs estaven aïllats aplicàvem un estímul de 10 Hz a les dues potes i extrèiem el TA a diferents temps 0, 1, 3, 10 i 300 segons.Posteriorment ens vàrem plantejar una sèrie d'experiments en humans. Els voluntaris varen ser dividits en dos grups que es diferenciaven en la durada del període d'entrenament i en el tipus d'exercici a realitzar. L'entrenament en els dos grups consistí a efectuar un esforç a un 65% de la VO(2) màx durant dues hores, el període va ser de tres dies en un dels grups i de sis dies a l'altre.L'exercici després de tres dies d'entrenament es caracteritzava principalment pel fet que la intensitat de l'esforç es mantenia constant a un 65% de V02 màx. S'obtenien biòpsies al repòs, als 3 i 15 minuts i a la fatiga abans i després de l'entrenament.En canvi, l'exercici després de sis dies d'entrenament es caracteritzava pel fet que cada vint minuts s'incrementava la intensitat de l'esforç. L'augment va començar en un 60%, després va continuar a un 79% i finalment a un 90% de la VO(2) màx. S'obtenien biòpsies al repòs i cada vint minuts coincidint amb el canvi d'intensitat i a la fatiga.3) RESULTATS I CONCLUSIONSDurant el període de 50 dies d'estimulació s'observà un increment significatiu i transitori de Glucosa l ,6-P(2) i de Fructosa 2,6-P(2) a les 24h d'iniciar-se l'estimulació. Aquesta pujada podria suggerir una activació de la via glucolítica aeròbica a través de l'enzim fosfofructoquinasa, ja que ambdós metabòlits estan descrits com a uns dels més importants efectors al.lostèrics d'aquest enzim.Degut als resultats anteriors, ens plantejàrem estudiar quin efecte podria tenir l'exercici en unes condicions en què els dos sucres anteriorment esmentats estaven per sobre dels nivells normals. En el múscul estimulat 24 hores a 10 Hz, quan és sotmès a un exercici, es produeix un estalvi de glicogen degut a una major velocitat de resíntesi, l'activitat glicogen sintasa després del període d'estimulaci6 ha augmentat significativament, o a que s'utilitza un altre substrat energètic. L'augment de l'activitat hexoquinasa ens fa pensar que la glucosa podria ser aquest nou substrat. A més, l'acúmul de sucres bisfosforilats activa la PFK, mentre que la no aparició de lactat suggereix que la glucòlisi aeròbica està activada.L'efecte de l'entrenament en humans, ja sigui de tres o de sis dies, millora la resposta a l'esforç ja que tots els atletes han augmentat el temps de durada de l'exercici. Després de l'entrenament s'observa un menor acúmul de lactat intramuscular i sanguini i un estalvi de glicogen durant els dos tipus d'exercici. A més, les variacions dels metabòlits intermediaris durant l'exercici després de l'entrenament no s6n tan accentuades.Amb els resultats que hem obtingut podem concloure que l'exercici muscular de curta durada aplicat tant en forma d'estimulació elèctrica com d'entrenament, produeix una adaptación metabòlica que consisteix en un estalvi de creatinafosfat i de glicogen, i en una disminució de la producció de lactat. Aquesta situació podria ser compatible amb una adaptació a l'augment de la utilització de glucosa sanguínia i de la capacitat de la glucòlisi aeròbica. Les modificacions en les concentracions dels sucres bisfosforilats GJu 1,6-P(2) i Fru 2,6-P(2) durant les fases d'entrenament i/lo exercici jugarien un paper fonamental en el manteniment de la capacitat glucolítica. / This study investigates early adaptative responses of skeletal muscle to increased contractile activity.Two experimental approaches have been used. One of them consists of putting rabbit's tibialis anterior muscle under chronic low-frequency stimulation (10 Hz). The other one was done by untrained male subjects who had carried out an aerobic short term training (3 to 6 days).Changes in metabolite levels and activities of regulatory enzymes of carbohydrate metabolism were investigated.Most of the metabolic enzymes investigated (creatine kinase, glycogen phosphorylase, phosphofructokinase l, pyruvate kinase, lactate dehydrogenase) showed no differences in total cellular activities between control and l-day-prestimulated TA rabbit muscles. However, significant increases were found in the 24h-stimulated muscle for glycogen synthase (1.5-fold), hexoquinase (3-fold) and phosphofructokinase 2 (3.5-fold). These metabolic enzymes have not been studied in human samples, except glycogen phosphorylase and glycogen synthase which modify their active forms in response to exercise.As expected, muscular contraction resulted in a pronounced reduction in PCr and glycogen concentration in non pre-stimulated or non trained muscle, while lactate concentration increased severa1 times. Intermediate metabolites modify their concentration in different ways.Any changes in metabolites concentration after pre-stimulation or training haven 't been observed during exercise.Metabolic concentration of glucose 1,6-P(2) and fructose 2,6-P(2) in control muscle showed a transient elevation, while these metabolites in pre-stimulated muscle were permanently elevated.In humans, only fructose 2,6-P(2) was affected by exercise and training. During exercise, prior to training, fructose 2,6-P(2) was reduced. The effect of training was to eliminate the exercise reduced change in this bisphosphate. Although glucose J,6-P(2) appeared to be persistently reduced with training, the magnitude was not sufficient to result in a significant change.As a consequence of a short term training, by electrical stimulation or exercise, skeletal muscle adapts its metabolism. Adaptative metabolic changes consist of glycogen and PCr sparing effect and the use of glucose as the main fuel through aerobic glycolisis.

DE LA TESIS:INTRODUCCIÓN: La formación de ascitis es el trastorno más importante que presentan los pacientes cirróticos. Dicho proceso constituye un fenómeno extraordinariamente complejo en el que se ha implicado a diversos sistemas neurohormonales y sustancias endógenas capaces de regular el metabolismo renal de sodio y agua, o la reactividad vascular. Actualmente, se considera que la disfunción renal y el desarrollo de ascitis es el resultado de la vasodilatación arterial en el territorio esplácnico, promovida por la hipertensión portal. Esto da lugar a dos secuencias de acontecimientos bien diferenciados. En primer lugar, la vasodilatación esplácnica aumenta el aflujo sanguíneo en este territorio produciendo un incremento de la presión capilar y de la permeabilidad vascular, así como una mayor formación de linfa. En segundo lugar, la disminución de la presión arterial, como respuesta homeostática compensatoria, activa los sistemas vasoconstrictores endógenos. Estos sistemas, sin embargo, tienen propiedades antidiuréticas y antinatriuréticas, por lo que la activación de los mismos también produce retención renal de sodio y agua. La concurrencia simultánea de estas dos perturbaciones estimula el acumulo de líquido intraperitoneal. Sin embargo, todavía se desconocen los territorios vasculares implicados en la formación de ascitis ni los mecanismos moleculares que regulan la fisiopatología de ese desorden. OBJETIVOS: La presente tesis doctoral tuvo como objetivos investigar cuáles son las áreas vasculares que presentan una permeabilidad vascular alterada en las ratas cirróticas con ascitis y, por otra parte, analizar el impacto de vías de señalización proangiogéncias en los procesos que conducen al aumento de la permeabilidad vascular que origina la ascitis en la cirrosis experimental. RESULTADOS: El hígado y el mesenterio son los tejidos que presentan una permeabilidad vascular aumentada en las ratas cirróticas con ascitis. Los factores vascular endothelial growth factor A (VEGF-A) y la angiopoyetina-2 se encuentran sobreexpresados en el hígado y el mesenterio de las ratas cirróticas con ascitis. El bloqueo agudo del receptor 2 de VEGF reduce drásticamente la permeabilidad vascular en el hígado y el mesenterio de las ratas cirróticas con ascitis. Por otra parte, la apelina, un péptido proangiogénico de reciente descubrimiento, se encuentra aumentada en el suero de los pacientes y las ratas con cirrosis. La expresión de dicho péptido y de su receptor se encuentra hiperactivada específicamente en el hígado de las ratas cirróticas con ascitis. Más concretamente, la apelina se sobreexpresa en las células estrelladas hepáticas (CEH), y su receptor, en dichas células y en el parénquima del hígado cirrótico. El bloqueo crónico del receptor de la apelina reduce la angiogénesis y la fibrosis hepática, mejora la hemodinámica sistémica y la función renal en las ratas cirróticas con ascitis. Esos efectos beneficiosos en la hemodinámica y la angiogénesis hepática se vieron asociados con la disminución drástica de la producción de ascitis o incluso la desaparación total de la misma. Para averiguar los agentes que regulan la expresión hepática de este péptido se utilizó una línea de CEH (LX-2). La angiotensina-II y la endotelina-1 (dos factores profibrogénicos) son los principales agentes que estimulan la expresión de apelina en las células LX-2. Precisamente, la apelina actúa de mediador en la estimulación de colágeno-I y de receptor beta de PDGF que realizan angiotensina-II y endotelina-1 en las CEHs. CONCLUSIÓN: El intenso proceso de angiogénesis hepática y mesentérica contribuye de manera significativa al desarrollo de la ascitis en la cirrosis hepática. Por tanto, estos datos apoyan la hipótesis de que el bloqueo de dianas terapéuticas implicadas en angiogénesis puede constituir un avance en el tratamiento de las alteraciones de la permeabilidad vascular que dan lugar a la formación de ascitis en esta enfermedad.

1.IntroducciónEl Síndrome de Down (SD) es una trisomía del cromosoma 21, hallazgo indispensable para su diagnóstico. Presenta una variablilidad fenotípica ampliamente descrita. Respecto a la actividad física, no hay que considerarle como una enfermedad, sino como una condición. Las personas con SD pueden practicar diversos tipos de actividad, siempre y cuando éstas se realicen en óptimas condiciones de salud y sin riesgo para el individuo.La valoración funcional consiste en unas pruebas específicas para valorar la adaptación del organismo al esfuerzo físico. Los individuos con SD son fisiológicamente diferentes a los sujetos sin discapacidad. Presentan unos valores de metabolismo aeróbico (VO2) menores junto a unos bajos valores de frecuencia cardíaca (FC) máxima. También presentan menores niveles de fuerza. La obesidad es prevalente en esta población. Poco se conoce sobre el efecto que produce la participación en actividades deportivas.2. Planteamiento y ObjetivosObtener valores de referencia en población catalana con SD, diseñar y validar un protocolo sobre cinta ergométrica para esta población, y comparar fisiológicamente un subgrupo activo con otro sedentario. Finalmente, estudiar una posible incompetencia cronotrópica. 3.Material y MétodoLa muestra quedó establecida en 20 personas con SD de 24.3+/-3.5 años de edad, con una DP leve o moderada, sin alteraciones que impidieran el esfuerzo. Siete individuos eran sedentarios y 13 entrenaban 4.9+/-1.9hrs semanales. Se realizó una adaptación previa al entorno. Se realizó una anamnesis y una exploración médica general por aparatos, incluyendo ECG, ecocardiografía, espirometría. Se obtuvo el Índice de Masa Corporal (IMC), Índice Cintura/Cadera (C/C) y el porcentaje de grasa. Se valoró fuerza isométrica, calculando el Índice de Morehouse (IM). También se estudió el Test de Bosco. Fue validado el protocolo utilizado para prueba de esfuerzo, y se obtuvo FCmáx, VO2máx, VEmáx y RERmáx. También se estudió el Índice de Respuesta Cronotrópica (IRC).4.ResultadosLas características generales de la muestra fueron: talla baja y sobrepeso, siendo el %graso y el IMC menor en los activos (22.3+/-7.1 y 25.7+/-4) respecto a sedentarios (25.1+/-8.2 y 28.1+/-4.3), aunque no significativamente.El IM fue significativamente mayor (p<.05) en los activos que en los sedentarios (3.5+/-0.8 vs 2.6+/-1.1). Los valores del Test de Bosco fueron también mayores en activos que sedentarios, pero sin significancia estadística.En la prueba de esfuerzo se cumplieron todos los criterios de prueba maximal, y los parámetros de mayor interés presentaron un coeficiente alfa>0.91, lo que demuestra una alta fiabilidad del protocolo. Los valores de VO2max fueron significativamente mayores (p<.05) en los activos que sedentarios (34.3+/-5.7 vs 27.4+/-5.9 ml/kg/min), siendo éstos los valores más altos en población con SD hasta ahora encontrados en la literatura. Llama la atención el bajo valor de la FC máxima (165+/-15lpm)De la muestra estudiada, más de la mitad (13) presentó un IRC bajo (<0.95)6. Discusión y ConclusionesExiste una alta prevalencia de obesidad en esta muestra, mayor en mujeres que hombres. El %graso y el IMC fueron mayores en el subgrupo sedentario, aunque no significativamente. Tanto los valores de fuerza isométrica como los del Test de Bosco fueron bajos respecto a población general. Éstos fueron mayores en el subgrupo activo respecto al sedentario.Tanto los valores de VO2máx como los de FC máxima fueron bajos respecto a la población general y otros individuos con DP pero sin SD. Se desconoce la causa última.La prueba de esfuerzo mostró valores ergoespirométricos mayores en activos que sedentarios, lo cual sugiere un efecto beneficioso del ejercicio. El IRC fue bajo, que junto a la baja FC máxima, mostrarían una disfunción autonómica, refrendada por las bajas tensiones arteriales y la alteración de la variabilidad de FC presentes en SD. Son necesarios futuros estudios.