Orientador: Sergio Marangoni / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-22T17:42:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Huaco_FrankDenisTorres_D.pdf: 4738657 bytes, checksum: 14194646f90e694d6d1598ef9b7fc870 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Neste trabalho descrevemos a purificação, caracterização estrutural e os efeitos locais e sistêmicos de uma nova metaloprotease de baixa massa molecular, denominada BtaHF (Bothriopsis taeniata Hemorrhagic Factor). A proteína foi purificada a partir do veneno total da serpente Bothriopsis taeniata usando cromatografía exclusão molecular convencional (Sephadex G-75), seguida de uma cromatografia de alta eficiência de troca iônica (coluna DEAE 8HR APMinicolumn). A nova metaloprotease BtaHF apresenta um alto grau de pureza e homogeneidade molecular e possui uma massa molecular de 25968,16 Da. A BtaHF apresentou atividade caseinolítica com uma temperatura e pH ótimos de 37-40 oC e 8, respectivamente. A atividade caseinolítica da BtaHF foi inibida por EGTA, EDTA e DTT, mas os inibidores PMSF e SBTI não apresentaram efeito. O íon Ca+2 é importante para a estabilidade da metaloprotease BaHF, aumentando atividade caseinolítica da enzima, entretanto, os íons Zn+2 e Mn+2 inibem a atividade enzimática desta enzima. A BtaHF é uma enzima ?-fibrinogênolítica por degradar rapidamente à cadeia A do fibrinogênio após 15 minutos de incubação, enquanto a cadeia B? é completamente degradada após 6 horas. Por outro lado, a BtaHF não possui atividade fibrinolítica ou arginine amidase. A análise de composição de aminoácidos mostrou que a BtaHF possui caráter ácido e apresenta 6 resíduos de cisteína. No estudo de homologia a BtaHF apresentou maior identidade sequencial com metaloproteases com atividade hemorrágica da classe P-I como a BaP1 (Bothrops asper). A metaloprotease BtaHF possui atividade hemorrágica fraca com uma dose hemorrágica mínima de 20,14 ?g/animal. Esta metaloprotease mostrou atividade edematogênica que mostrou ser dose-dependente e teve um efeito permaneceu após 6 horas de injeção. Ambos os efeitos estão relacionados à atividade proteolítica e ao correto enovelamento da BtaHF, una vez que foram inibidas por agentes quelantes (EDTA e EGTA) e redutor (DTT). A metaloprotease BtaHF não possui atividade miotóxica, embora tenha atividade citotóxica em fibroblastos C2C12. A análise histológica do músculo gastrocnêmio de camundongo confirmou a atividade hemorrágica e edematogênica da metaloprotease, assim como, a ausência de atividade miotoxica. A metaloprotease BtaHF produz efeitos sistêmicos específicos quando injetado via endovenosa em camundongos. A nível do tecido pulmonar, a toxina produz alteração da estrutura alveolar com hemorragia significativa, engrossamento dos septos alveolares e inflamação. A BtaHF não produz hemorragia no tecido renal, mas alterou a estrutura glomerular, além de alterações no citoplasma das células dos túbulos proximal e distal. Contrariamente, esta toxina não produz efeito nenhum a nível hepático. A BtaHF consome o fibrinogênio plasmático de modo dose e tempo-dependente, produzindo incoagulabilidade sanguínea após uma hora. Estudos in vitro revelaram atividade pro-coagulante dose-dependente, ao reduzir os índices PT e APPT. A utilização de metodologias de purificação de alta eficiência permitram a purificação da metaloprotease BtaHF. Assim, esta abordagem pode ser aplicada nos estudos bioquímicos, estrutura-função, fisiológicos e farmacológicos, podendo deduzir o papel desenvolvido pela metaloprotease purificada nos efeitos biológicos produzidos pelo veneno total de Botriopsis taeniata. As informações produzidas no presente trabalho permitiram sugerir que as principais funções das metaloproteases de veneno de serpente da classe P-I são manter a hemorragia característica dos envenenamentos botrópicos e participar da imobilização da presa promovendo rápidos efeitos próinflamatórios / Abstract: In this work we described the purification, structural characterization and the local and systemic effects of a new low molecular weight snake venom metalloproteinase, named BtaHF. This protein was purified from the Bothriopsis taeniata crude venom combining conventional molecular exclusion (Sephadex G-75 column) followed by an ion exchange (DEAE 8HR APMinicolumn) chromatography on a HPLC system. The new metalloproteinase BtaHF showed a high degree of purity and molecular homogeneity with a molecular mass of 25968.16 Da. BtaHF showed caseinolytic activity with an optimum temperature and pH of 37-40 °C and 8, respectively. The caseinolytic activity was inhibited by EGTA, EDTA and DTT, but PMSF and SBT-I did not show inhibitory effect. The Ca+2 ion shown to be important for protein stability enhancing its caseinolytic activity, on the contrary, Z+2 and Mn+2 showed inhibitory effects upon the enzymatic activity of this protein. The metalloproteinase BtaHF is an ?-fibrigenolytic enzyme, rapidly degraded fibrinogen A? chain within 15 minutes, while fibrinogen B? chain is degraded after 6 hours. This enzyme did not show fibrinolytic or arginine amidase activities BtaHF is an acidic protein due the mayor proportion of acidic amino acid in its amino acid composition with 6 cysteinyl residues. By the homology study BtaHF share a high sequence identity other weakly hemorrhagic P-I class SVMP such BaP1 isolated from Bothrops asper snake venom This new metalloproteinase, BtaHF, have a weak hemorrhagic with a minimum hemorrhagic dose of 20.14 ?g. Also, this metalloproteinase showed dose-dependent paw edemaforming activity, this effect remain six hours after inoculation. Both hemorrhage and edemaforming activities were related to the enzymatic activity and correct fold of BtaHF, since chelating (EDTA and EGTA) and reducing (DTT) agents inhibited these activities. On the other hand, this enzyme did not show miotoxic activity, although, showed citotoxic activity on C2C12 fibroblast. Histological analysis of mice gastrocnemius muscle confirmed that the metalloproteinase produce local hemorrhage and pro-inflammatory effects, as well as, the absence of miotoxic activity. This metalloproteinase, BtaHF, produce specific systemic effects when injected endovenously in mice. On lung tissue level these toxin produce alteration of alveolus structure with significant hemorrhage, thickness of alveolus septum and inflammation. On renal tissue BtaHF did not produce hemorrhage, but, was observe alteration of glomerulus structure, along with cytoplasmatic alterations of distal and proximal tubulus cells. On the other hand, were not observed any alterations on hepatic tissue. BtaHF deplete completely plasma fibrinogen levels in a time and dose-depended manner, reaching blood incoagulability after one hour. BtaHF shown dose-dependent pro-coagulant activity "ex vivo" reducing PT and APPT index. The metalloproteinase BtaHF was purified using a high efficient system. Thus, this approach can be applied to biochemical, structure-function, physiologic and pharmacologyc studies which allow infer the role of this enzyme in the biological effects produce by Bothriopsis taeniata crude venom. The information here presented suggest that the mainly functions of P-I class snake venom metalloproteinases are the maintenance of the characteristic hemorrhagic effect of the botropic venoms and participate of prey immobilization by promoting rapid inflammatory effects / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:30:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_ Fabricio_Aulo_Ogliari.pdf: 587095 bytes, checksum: 8bb56a09354ea01200df793cf0e60ef5 (MD5) Previous issue date: 2009-07-10 / The aim of this study was to synthesize and to investigate the influence of the 2,3-epithiopropyl methacrylate (ETMA) in a dental adhesive. Synthesis of the ETMA was performed using glycidyl methacrylate as starting reagent, catalyzed by cerium ammonium nitrate in presence of NH4SCN. After purification, ETMA was characterized by 1H NMR and FTIR spectroscopy. ETMA monomer was used as an additive agent in a commercial available dental adhesive (Scotchbond Multipurpose, 3M ESPE) at three different concentrations (0.1, 1 and 10 wt %). Adhesive without ETMA was used as control group. Degree of conversion of the polymerized adhesives was accomplished by FTIR analysis. Blend copolymerization was investigated by 1H NMR spectroscopy analysis. To investigate immediate and long-term properties of the adhesives, microtensile bond strength to human dentin and SEM fractographic analysis were performed. ETMA was synthesized through the conversion of GMA with NH4SCN and high yield was obtained (90%). One-step s synthetic route and a simple manner of purification were described. ETMA presence didn t affect the degree of conversion of the adhesive resins. The monomer that composed the adhesive resins presented copolymerization among them, not presenting ETMA release in 0.1 and 1% groups. Experimental adhesives had statistically higher microtensile bond strength values than the no ETMA adhesive (p<0.05), independently of the water storage. All groups were stable over time / O objetivo deste estudo foi sintetizar e avaliar a influência do 2,3-epitiopropil metacrilato (ETMA) utilizado como monômero funcionalizado sobre a resistência de união imediata e longitudinal de um adesivo comercial. O ETMA foi sintetizado através da transformação do glicidil metacrilato na presença de tiocianato de amônio catalisado por nitrato de cérico de amônio. O produto obtido, após destilação, foi confirmado e caracterizado por ressonância magnética nuclear de prótons e por espectroscopia no infravermelho. ETMA foi utilizado como aditivo na quantidade de 0,1, 1 e 10% em massa a um adesivo comercial (Scotchbond Multiuso - SBMU, 3MESPE). Como controle SBMU sem ETMA foi testado. Foi avaliada a capacidade de copolimerização do ETMA com os outros monômeros do adesivo comercial assim como a sua influência no grau de conversão e na resistência de união à microtração em dentina. A resistência de união a microtração em dentina foi avaliada após 24h, 6 meses e 12 meses de armazenagem em água destilada. As amostras fraturadas do ensaio de microtração foram avaliadas por microscopia eletrônica de varredura e microscopia ótica para a análise do modo de fratura. Foi possível a síntese do ETMA através da conversão de GMA utilizando NH4SCN como reagente. Um rendimento global de 90% foi atingido utilizando-se um método simples de purificação. A adição de ETMA não influenciou os valores de grau de conversão e estes sistemas monoméricos demonstraram capacidade de copolimerização ente si, não apresentando traços de liberação de ETMA nos grupos de 0,1 e 1%. Os adesivos contendo ETMA apresentaram valores de resistência de união significativamente maiores que o grupo controle sem ETMA (p<0.05). Os valores de resistência de união do grupo controle e dos grupos experimentais permaneceram estáveis mesmo após 12 meses de armazenagem, sendo que os grupos experimentais apresentaram valores mais elevados de resistência de união em comparação ao controle independentemente do período de avaliação

Photorhabdus é um gênero de enterobactérias simbiontes de Heterorhabditis, um gênero de nematoides entomopatogênicos. Dentre as enzimas secretadas por P. luminescens TTO1, destaca-se PrtA, uma metaloprotease que pertence a subfamília das serralisinas. PrtS, uma protease capaz de induzir uma forte resposta de melanização no inseto, foi identificada em P. temperata Az29 mas não em P. luminescens TTO1. Neste trabalho foram detectadas e caracterizadas bioquimicamente algumas proteases secretadas pelo isolado MN7 de P. luminescens luminescens. Foram detectadas duas atividades mais proeminentes: uma de 50 kDa, e outra de 38 kDa. Com o sequenciamento do genoma desta bactéria, pudemos confirmar a presença no genoma de genes codificando proteínas de alta identidade com as descritas PrtA e PrtS, de massas similares às detectadas nas nossas zimografias. As proteases são inibidas por inibidores específicos de metaloproteases. P. luminescens MN7 apresenta secreção, portanto, de uma protease já descrita algumas vezes, e de outra presente apenas em P. temperata Az29. / Photorhabdus is a genus of Enterobacteriaceae, symbionts of Heterorhabditis, a genus of entomopathogenic nematodes. Among the enzymes secreted by P. luminescens TTO1 stands out PrtA, a metalloprotease that belongs to the subfamily of serralysins. PrtS, a protease capable of inducing a strong melanotic response from the insect, was identified in P. temperata Az29 but not in P. luminescens TTO1. In this work were detected and characterized biochemically few isolated proteases secreted by P. luminescens luminescens MN7. Two most prominent activities were detected: one with 50 kDa and one with 38 kDa. With the sequencing of the genome of MN7, we could confirm the presence in the genome of genes encoding proteins with high identity to PrtA and PrtS already described, with similar masses to those detected in our zimographies. These proteases are inhibited by specific inhibitors of metalloproteases. P. luminescens MN7 secretes a protease already described a few times, and other present only in P. temperata Az29.

Lesão hepática é uma das complicações decorrentes de pancreatite aguda (PA) e mostra uma correlação positiva com a gravidade da doença. Recentemente foi demonstrado que tratamento com solução hipertônica (SH) reduz inflamação e mortalidade na PA. O presente trabalho investigou os efeitos de SH na modulação do estresse oxidativo, apoptose e remodelamento tecidual no fígado durante a PA. Ratos machos foram divididos em quatro grupos: C animais que não foram submetidos à PA ou tratamento; past animais submetidos à indução de PA e que não receberam tratamento; pas animais submetidos à PA e tratados com solução fisiológica (NaCl 0.9%); pah animais submetidos à indução de PA e que receberam SH (NaCl 7.5%). PA foi induzida pela injeção retrógrada de ácido taurocólico (2.5%) no ducto bilo-pancreático. Após 4, 12 e 24 horas os animais foram sacrificados para coleta das amostras de interesse (fígado e plasma) submetidas a ensaios para análise de expressão (western blot e PCR) de Óxido Nítrico Sintase induzível (iNOS), metaloproteinases (MMP) -2 e -9, Heat Schock Protein (HSP) 47, 60, 70 e 90, colágenos tipos I e III, caspases 2 e 9, APAF-1 e AIF, formação de nitrotirosina (imunohistoquímica), peroxidação lipídica (TBARs), atividade de alaninoaminotransferase (ALT), produção de nitrito/nitrato (Reação de Griess) e das citocinas TNF-, IL-1, IL-6 e IL-10 (ELISA). O tratamento com SH reduziu significantemente o estresse oxidativo hepático com a redução da expressão gênica de iNOS (p<0,01 vs. pas), dos níveis de nitrito/nitrato (P<0,01 vs. pas), liberação de ALT (p<0,01 vs. pas) e inibição da formação de peroxinitrito após 12 horas da indução de PA. Conseqüentemente, a expressão de HSP70 não foi ativada devido à proteção hepática causada pela administração de SH. A expressão e atividade de MMP-9 aumentaram significativamente nos grupos pas e past, entretanto o tratamento com SH manteve os níveis basais (p<0,05 vs. past, pas). Aumento da expressão de HSP47 e alterações na expressão de colágeno indicaram intenso remodelamento de matriz extracelular nos grupos não tratados ou tratados com solução fisiológica, permanecendo semelhante ao controle no grupo pah. Não ocorreram mudanças significativas na expressão das proteínas envolvidas no processo apoptótico. A SH diminui o estresse oxidativo no período crítico da PA, resultando na diminuição da lesão hepática e do remodelamento tecidual, mantendo dessa forma a integridade de matriz extracelular / It has been shown an hepatic injury following pancreatitis and a positive correlation with severity of the disease. Hypertonic Solution (HS) reduced morbidity and mortality in experimental pancreatitis. We hypothesize that hypertonic solution resuscitation of acute pancreatitis (AP) may exert antiinflammatory effects by modulating hepatic oxidative stress, apoptosis and matrix extracellular remodeling in liver. Wistar rats were divided in four groups: C- control animals not subjected to insult or treatment; NT- subjected to pancreatitis induction and receiving no treatment; NS- subjected to pancreatitis induction and receiving normal saline (0.9% NaCl); HSsubjected to pancreatitis induction and receiving hypertonic saline (7.5% NaCl). AP was induced by retrograde infusion of 2,5% sodium taurocholate into the pancreatic duct transduodenally. At 4, 12 and 24 h following pancreatitis induction, liver tissue samples were assayed in order to analyse expression of metalloproteinases (MMPs) -2 and -9, iNOS, collagens (type I and III), Heat Shock Proteins (HSPs) 47, 60, 70 and 90, caspases -2 and -7, APAF-1 and AIF, production of the cytokines TNF-, IL-1, IL-6 and IL-10, Nitrite/nitrate and ALT, Lipid peroxidation and formation of Nytrotirosine. Hypertonic solution resuscitation significantly modulates the oxidative stress in liver by reduction of iNOS gene expression (p<0,01 vs. NS), nitrite and nitrate levels (p<0,01 vs. NS), lipid peroxidation (p<0,05 vs. NT), ALT release (p<0,01 vs. NS) and peroxinitrite inhibition after 12 hours of pancreatitis induction. Consequently, the HSP70 production has not been activated due to the hypertonic solution effect in hepatic protection. At 4 h and 12 h, MMP-9 expression and activity increased in the NS and NT groups, although remaining at basal levels in the HS group (p<0.05 vs. past, pas). At 12 h, MMP-2 expression increased in the NS group (p<0.05 vs. c) but not in the HS group. At 4 h after pancreatitis induction, HSP47 expression increased in the NS and NT groups. Greater extracellular matrix remodelling occurred in the NS and NT groups than in the HS group, probably as a result of the hepatic wound-healing response to repeated injury. However, the collagen content in hepatic tissue remained at basal levels in the HS group. The proteins involved in apoptosis remained unchanged in all groups. Hypertonic saline is hepatoprotective, since it decreases oxidative stress in the critical time resulting in diminished liver damage, reducing hepatic remodelling, maintaining the integrity of the hepatic extracellular matrix during pancreatitis. Hypertonic saline-mediated regulation of MMP expression might have clinical relevance in pancreatitis-associated liver injury

Orientador: Paula Schmidt Azevedo Gaiolla / Abstract: Introduction: Rheumatoid arthritis (RA) is a chronic inflammatory disease that affects not only joints, but also other organs, such as the heart. Systemic inflammation plays a fundamental role in the development of joint and extraarticular involvement. Thus, there is an increased risk for coronary disease in patients with RA. Direct heart involvement can be triggered by the process of cardiac remodeling, such as hypertrophy and changes in cardiac geometry, which can go years without causing symptoms. Another particular feature of AR and also related to chronic inflammation is the fact that they present a body composition with a phenotype more focused on being overweight, but with the possibility of having reduced muscle mass. Obesity, by itself, already raises the risk for cardiac involvement, however, little is known about the participation of body composition variables and some inflammatory markers in the cardiac remodeling of RA patients. Objectives: To evaluate whether body composition and inflammation variables, evaluated by metalloptreteaases (MMP-2 and MMP-9), are associated with remodeling and cardiac function. Methodology: A total of 71 patients with RA underwent clinical, anthropometric evaluation of the body composition by bioimpedance and dual emission X-ray densitometry, cardiac evaluation by transthoracic echocardiography, evaluation of inflammatory activity by DAS-28 and dosage of metalloprotease activity. Logistic and linear regression were performed to evalua... (Complete abstract click electronic access below) / Resumo: Introdução: A artrite reumatoide (AR) é uma doença inflamatória crônica que acomete não apenas articulações, mas também outros órgãos, como por exemplo, o coração. A inflamação sistêmica exerce papel fundamental no desenvolvimento do acometimento articular e extra-articular. Dessa forma, existe risco aumentado para doença coronariana em pacientes com AR. É possível acometimento direto do coração desencadeando o processo de remodelação cardíaca, como a hipertrofia e alterações de geometria cardíaca, que podem passar anos sem causar sintomas. Outra característica particular da AR e também relacionada com a inflamação crônica é o fato de apresentarem composição corporal com fenótipo mais voltado para o sobrepeso, mas com a possibilidade de terem massa muscular reduzida. A obesidade, por si, já eleva o risco para acometimento cardíaco, entretanto, pouco se sabe sobre a participação de variáveis da composição corporal e de alguns marcadores inflamatórios na remodelação cardíaca de pacientes com AR. Objetivos: Avaliar se variáveis da composição corporal e inflamação, avaliada por metalopreteaases (MMP-2 e MMP-9), associam-se à remodelação e função cardíaca. Metodologia: Foram estudados 71 pacientes com AR, submetidos a avaliação clínica, antropométrica, da composição corporal por bioimpedância e densitometria de dupla emissão de radiação X, avaliação cardiológica por ecocardiografia transtorácica, avaliação da atividade inflamatória por DAS-28 e dosagem da atividade das metaloprote... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

Introdução: a incidência dos melanomas permanece em ascensão em diversos países. Os nevos melanocíticos podem ser seus precursores ou marcadores de risco. A radiação ultravioleta é o principal fator de risco ambiental para o seu desenvolvimento. Estudos com nevos irradiados mostram que a radiação ultravioleta B (UVB) pode causar alterações morfológicas e bioquímicas semelhantes às de um melanoma in situ. As metaloproteinases da matriz (MMP) são enzimas proteolíticas e, particularmente, as MMP-2 e –9 (gelatinases A e B) parecem estar associadas à invasão tumoral, à formação de metástases e de neoangiogênese em melanomas. O objetivo do presente estudo é avaliar os efeitos da UVB nas expressões imunoistoquímicas de MMP-2 e –9 nas diferentes linhagens celulares de nevos melanocíticos. Métodos: quarenta e dois nevos melanocíticos tiveram suas metades irradiadas com dose de 2 DEM (dose eritematosa mínima) de UVB e foram excisados uma semana após. As expressões imunoistoquímicas das MMP-2 e -9 foram comparadas, quanto à sua intensidade, por três avaliadores diferentes entre os lados irradiados e não irradiados em queratinócitos, melanócitos de epiderme e derme superior, células endoteliais e fibroblastos. Os dados foram analisados pelo teste t pareado para as diferenças de expressão e pelo ICC para avaliação da homogeneidade entre as respostas dos observadores. Resultados: com relação à expressão imunoistoquímica de MMP-2, todas as linhagens celulares mostraram aumento no lado irradiado, especialmente os melanócitos epidérmicos. Quanto à MMP-9, somente nos queratinócitos, não se observou aumento de expressão do lado irradiado, ficando essa evidente nas demais linhagens celulares avaliadas. Conclusões: A UVB na dose de 2 DEM aumenta a expressão imunoistoquímica das MMP-2 e –9 em quase todas as linhagens celulares dos nevos melanocíticos avaliados até uma semana após a irradiação, com exceção feita queratinócitos, com a MMP-9. / Background: the incidence of melanoma continues to increase in several countries. Melanocytic nevi may represent precursors or risk indicators of cutaneous melanoma. Ultraviolet radiation is the main environmental risk factor in their development. Studies with irradiated nevi show that ultraviolet B (UVB) radiation can cause morphological and biological alterations similar to those of a melanoma in situ. Matrix metalloproteinases (MMP) are proteolytic enzymes, and MMP-2 and -9 (gelatinase A and B) in particular, appear to be involved with tumour invasion, the formation of metastases and neoangiogenesis in melanomas. This study aims to evaluate the effects of UVB radiation on the immunohistochemical expression of MMP–2 and –9 in different cell lines from melanocytic nevi. Methods: one half of each of the forty-two melanocytic nevi used in the study was irradiated with 2 MEDs (Minimal Erythema Dosis) of UVB radiation and excised one week later. Three different observers were given the task of comparing the intensity of the immunohistochemical expression of the MMP –2 and –9 on the irradiated and nonirradiated sides of keratinocytes, melanocytes from the epidermis and upper dermis, endothelial cells and fibroblasts. The collected data were analysed using the paired t test for differences in expression and ICC in order to assess the homogeneity of the evaluations made by the observers. Results: in relation to the expression of MMP–2, all the cell lines showed an increase on the irradiated sides, especially the epidermal melanocytes. Regarding MMP-9, while no significant increase in its expression in keratinocytes was noted on the irradiated side, significant increases were observed in the remaining lines. Conclusions: UVB radiation at 2 MEDs increases the immunohistochemical expression of MMP –2 and –9 in almost all evaluated cell lines up to one week after irradiation, with the exception of MMP-9 in keratinocytes.

Introdução: a incidência dos melanomas permanece em ascensão em diversos países. Os nevos melanocíticos podem ser seus precursores ou marcadores de risco. A radiação ultravioleta é o principal fator de risco ambiental para o seu desenvolvimento. Estudos com nevos irradiados mostram que a radiação ultravioleta B (UVB) pode causar alterações morfológicas e bioquímicas semelhantes às de um melanoma in situ. As metaloproteinases da matriz (MMP) são enzimas proteolíticas e, particularmente, as MMP-2 e –9 (gelatinases A e B) parecem estar associadas à invasão tumoral, à formação de metástases e de neoangiogênese em melanomas. O objetivo do presente estudo é avaliar os efeitos da UVB nas expressões imunoistoquímicas de MMP-2 e –9 nas diferentes linhagens celulares de nevos melanocíticos. Métodos: quarenta e dois nevos melanocíticos tiveram suas metades irradiadas com dose de 2 DEM (dose eritematosa mínima) de UVB e foram excisados uma semana após. As expressões imunoistoquímicas das MMP-2 e -9 foram comparadas, quanto à sua intensidade, por três avaliadores diferentes entre os lados irradiados e não irradiados em queratinócitos, melanócitos de epiderme e derme superior, células endoteliais e fibroblastos. Os dados foram analisados pelo teste t pareado para as diferenças de expressão e pelo ICC para avaliação da homogeneidade entre as respostas dos observadores. Resultados: com relação à expressão imunoistoquímica de MMP-2, todas as linhagens celulares mostraram aumento no lado irradiado, especialmente os melanócitos epidérmicos. Quanto à MMP-9, somente nos queratinócitos, não se observou aumento de expressão do lado irradiado, ficando essa evidente nas demais linhagens celulares avaliadas. Conclusões: A UVB na dose de 2 DEM aumenta a expressão imunoistoquímica das MMP-2 e –9 em quase todas as linhagens celulares dos nevos melanocíticos avaliados até uma semana após a irradiação, com exceção feita queratinócitos, com a MMP-9. / Background: the incidence of melanoma continues to increase in several countries. Melanocytic nevi may represent precursors or risk indicators of cutaneous melanoma. Ultraviolet radiation is the main environmental risk factor in their development. Studies with irradiated nevi show that ultraviolet B (UVB) radiation can cause morphological and biological alterations similar to those of a melanoma in situ. Matrix metalloproteinases (MMP) are proteolytic enzymes, and MMP-2 and -9 (gelatinase A and B) in particular, appear to be involved with tumour invasion, the formation of metastases and neoangiogenesis in melanomas. This study aims to evaluate the effects of UVB radiation on the immunohistochemical expression of MMP–2 and –9 in different cell lines from melanocytic nevi. Methods: one half of each of the forty-two melanocytic nevi used in the study was irradiated with 2 MEDs (Minimal Erythema Dosis) of UVB radiation and excised one week later. Three different observers were given the task of comparing the intensity of the immunohistochemical expression of the MMP –2 and –9 on the irradiated and nonirradiated sides of keratinocytes, melanocytes from the epidermis and upper dermis, endothelial cells and fibroblasts. The collected data were analysed using the paired t test for differences in expression and ICC in order to assess the homogeneity of the evaluations made by the observers. Results: in relation to the expression of MMP–2, all the cell lines showed an increase on the irradiated sides, especially the epidermal melanocytes. Regarding MMP-9, while no significant increase in its expression in keratinocytes was noted on the irradiated side, significant increases were observed in the remaining lines. Conclusions: UVB radiation at 2 MEDs increases the immunohistochemical expression of MMP –2 and –9 in almost all evaluated cell lines up to one week after irradiation, with the exception of MMP-9 in keratinocytes.

Photorhabdus é um gênero de enterobactérias simbiontes de Heterorhabditis, um gênero de nematoides entomopatogênicos. Dentre as enzimas secretadas por P. luminescens TTO1, destaca-se PrtA, uma metaloprotease que pertence a subfamília das serralisinas. PrtS, uma protease capaz de induzir uma forte resposta de melanização no inseto, foi identificada em P. temperata Az29 mas não em P. luminescens TTO1. Neste trabalho foram detectadas e caracterizadas bioquimicamente algumas proteases secretadas pelo isolado MN7 de P. luminescens luminescens. Foram detectadas duas atividades mais proeminentes: uma de 50 kDa, e outra de 38 kDa. Com o sequenciamento do genoma desta bactéria, pudemos confirmar a presença no genoma de genes codificando proteínas de alta identidade com as descritas PrtA e PrtS, de massas similares às detectadas nas nossas zimografias. As proteases são inibidas por inibidores específicos de metaloproteases. P. luminescens MN7 apresenta secreção, portanto, de uma protease já descrita algumas vezes, e de outra presente apenas em P. temperata Az29. / Photorhabdus is a genus of Enterobacteriaceae, symbionts of Heterorhabditis, a genus of entomopathogenic nematodes. Among the enzymes secreted by P. luminescens TTO1 stands out PrtA, a metalloprotease that belongs to the subfamily of serralysins. PrtS, a protease capable of inducing a strong melanotic response from the insect, was identified in P. temperata Az29 but not in P. luminescens TTO1. In this work were detected and characterized biochemically few isolated proteases secreted by P. luminescens luminescens MN7. Two most prominent activities were detected: one with 50 kDa and one with 38 kDa. With the sequencing of the genome of MN7, we could confirm the presence in the genome of genes encoding proteins with high identity to PrtA and PrtS already described, with similar masses to those detected in our zimographies. These proteases are inhibited by specific inhibitors of metalloproteases. P. luminescens MN7 secretes a protease already described a few times, and other present only in P. temperata Az29.

Submitted by ANTONIO BACCARO null (antbaccaro@bol.com.br) on 2017-10-18T15:24:30Z No. of bitstreams: 1 Versão final Tese Doutorado 3 agosto 2017 Final - Antonio Baccaro Resumo ok.pdf: 1139639 bytes, checksum: 4b20e04d1939d61e79ee5c360ae47acc (MD5) / Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-10-23T18:59:29Z (GMT) No. of bitstreams: 1 baccaro_a_dr_bot.pdf: 1139639 bytes, checksum: 4b20e04d1939d61e79ee5c360ae47acc (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-23T18:59:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 baccaro_a_dr_bot.pdf: 1139639 bytes, checksum: 4b20e04d1939d61e79ee5c360ae47acc (MD5) Previous issue date: 2017-08-28 / Introdução: A artrite reumatoide (AR) é uma doença inflamatória crônica que acomete não apenas articulações, mas também outros órgãos, como por exemplo, o coração. A inflamação sistêmica exerce papel fundamental no desenvolvimento do acometimento articular e extra-articular. Dessa forma, existe risco aumentado para doença coronariana em pacientes com AR. É possível acometimento direto do coração desencadeando o processo de remodelação cardíaca, como a hipertrofia e alterações de geometria cardíaca, que podem passar anos sem causar sintomas. Outra característica particular da AR e também relacionada com a inflamação crônica é o fato de apresentarem composição corporal com fenótipo mais voltado para o sobrepeso, mas com a possibilidade de terem massa muscular reduzida. A obesidade, por si, já eleva o risco para acometimento cardíaco, entretanto, pouco se sabe sobre a participação de variáveis da composição corporal e de alguns marcadores inflamatórios na remodelação cardíaca de pacientes com AR. Objetivos: Avaliar se variáveis da composição corporal e inflamação, avaliada por metalopreteaases (MMP-2 e MMP-9), associam-se à remodelação e função cardíaca. Metodologia: Foram estudados 71 pacientes com AR, submetidos a avaliação clínica, antropométrica, da composição corporal por bioimpedância e densitometria de dupla emissão de radiação X, avaliação cardiológica por ecocardiografia transtorácica, avaliação da atividade inflamatória por DAS-28 e dosagem da atividade das metaloproteases. A regressão logística e linear foi realizada para avaliar a associação das variáveis com remodelação ventricular. Essas equações foram ajustadas por fatores que sabidamente influenciam na remodelação cardíaca, como hipertensão, DAS-28, idade, sexo. Resultados: A maioria dos pacientes são do sexo feminino, em média apresentam atividade leve da doença, sobrepeso e alta frequência de hipertensão. Em relação aos diagnósticos nutricionais, 90% apresentam porcentagem de gordura acima do normal, 20% apresentam porcentagem de gordura acima do normal e massa magra menor que P25%, e 14,6% apresentam sarcopenia, a razão entre água intracelular e extracelular sugerem hipervolemia. Ao avaliarmos os pacientes de acordo com a atividade da doença, observa-se que a MMP-9 está mais elevada em Abstract 3 paciente com atividade moderada e os pacientes com doença em atividade leve apresentam maior massa de gordura. O IMC, sarcopenia, porcentagem de gordura acima do normal e massa magra abaixo do P25% não explicaram a remodelação ventricular. A massa magra avaliada pelo DEXA associou-se com maior espessura relativa da parede e massa ventricular, mas a gordura não se associou a esses desfechos. A MMP-9 aumentou em 3,4 vezes o risco para aumento da ERP. Conclusão: A provável associação entre massa magra corporal e massa cardíaca provavelmente se deve a maior massa de água desses pacientes. Os métodos disponíveis não permitem a avaliação da água isolada da massa muscular. A MMP- 9 é um dos marcadores mais estudados nas articulações, mas percebe-se que sua concentração sérica também poderia associar-se a desfechos extracardíacos. / Introduction: Rheumatoid arthritis (RA) is a chronic inflammatory disease that affects not only joints, but also other organs, such as the heart. Systemic inflammation plays a fundamental role in the development of joint and extraarticular involvement. Thus, there is an increased risk for coronary disease in patients with RA. Direct heart involvement can be triggered by the process of cardiac remodeling, such as hypertrophy and changes in cardiac geometry, which can go years without causing symptoms. Another particular feature of AR and also related to chronic inflammation is the fact that they present a body composition with a phenotype more focused on being overweight, but with the possibility of having reduced muscle mass. Obesity, by itself, already raises the risk for cardiac involvement, however, little is known about the participation of body composition variables and some inflammatory markers in the cardiac remodeling of RA patients. Objectives: To evaluate whether body composition and inflammation variables, evaluated by metalloptreteaases (MMP-2 and MMP-9), are associated with remodeling and cardiac function. Methodology: A total of 71 patients with RA underwent clinical, anthropometric evaluation of the body composition by bioimpedance and dual emission X-ray densitometry, cardiac evaluation by transthoracic echocardiography, evaluation of inflammatory activity by DAS-28 and dosage of metalloprotease activity. Logistic and linear regression were performed to evaluate the association of variables with ventricular remodeling. These equations were adjusted by factors known to influence cardiac remodeling, such as hypertension, DAS-28, age, sex. Results: Most of the patients are female, on average they have mild disease activity and are overweight, with a high frequency of hypertension. In relation to nutritional diagnoses, 90% had a percentage of fat above normal, 20% had fat percentage above normal and lean mass lower than P25%, and 14.6% presented sarcopenia, the ratio between intracellular and extracellular water suggest hypervolemia. When evaluating the patients according to the activity of the disease, it is observed that MMP-9 is higher in patients with moderate activity and patients with disease in mild activity have higher fat mass. BMI, sarcopenia, percentage of fat above normal and lean mass below P25% did not explain ventricular remodeling. The lean mass assessed by DEXA was associated with a greater relative thickness of the wall and ventricular mass, but fat was not associated with these outcomes. MMP-9 increased by 3.4 times the risk for increased PRS. Conclusion: The probable association between lean body mass and heart mass is probably due to the greater body mass of these patients. The available methods do not allow the evaluation of water isolated from muscle mass. MMP-9 is one of the most studied markers in the joints, but it is perceived that its serum concentration could also be associated with extracardiac outcomes.

Lesão hepática é uma das complicações decorrentes de pancreatite aguda (PA) e mostra uma correlação positiva com a gravidade da doença. Recentemente foi demonstrado que tratamento com solução hipertônica (SH) reduz inflamação e mortalidade na PA. O presente trabalho investigou os efeitos de SH na modulação do estresse oxidativo, apoptose e remodelamento tecidual no fígado durante a PA. Ratos machos foram divididos em quatro grupos: C animais que não foram submetidos à PA ou tratamento; past animais submetidos à indução de PA e que não receberam tratamento; pas animais submetidos à PA e tratados com solução fisiológica (NaCl 0.9%); pah animais submetidos à indução de PA e que receberam SH (NaCl 7.5%). PA foi induzida pela injeção retrógrada de ácido taurocólico (2.5%) no ducto bilo-pancreático. Após 4, 12 e 24 horas os animais foram sacrificados para coleta das amostras de interesse (fígado e plasma) submetidas a ensaios para análise de expressão (western blot e PCR) de Óxido Nítrico Sintase induzível (iNOS), metaloproteinases (MMP) -2 e -9, Heat Schock Protein (HSP) 47, 60, 70 e 90, colágenos tipos I e III, caspases 2 e 9, APAF-1 e AIF, formação de nitrotirosina (imunohistoquímica), peroxidação lipídica (TBARs), atividade de alaninoaminotransferase (ALT), produção de nitrito/nitrato (Reação de Griess) e das citocinas TNF-, IL-1, IL-6 e IL-10 (ELISA). O tratamento com SH reduziu significantemente o estresse oxidativo hepático com a redução da expressão gênica de iNOS (p<0,01 vs. pas), dos níveis de nitrito/nitrato (P<0,01 vs. pas), liberação de ALT (p<0,01 vs. pas) e inibição da formação de peroxinitrito após 12 horas da indução de PA. Conseqüentemente, a expressão de HSP70 não foi ativada devido à proteção hepática causada pela administração de SH. A expressão e atividade de MMP-9 aumentaram significativamente nos grupos pas e past, entretanto o tratamento com SH manteve os níveis basais (p<0,05 vs. past, pas). Aumento da expressão de HSP47 e alterações na expressão de colágeno indicaram intenso remodelamento de matriz extracelular nos grupos não tratados ou tratados com solução fisiológica, permanecendo semelhante ao controle no grupo pah. Não ocorreram mudanças significativas na expressão das proteínas envolvidas no processo apoptótico. A SH diminui o estresse oxidativo no período crítico da PA, resultando na diminuição da lesão hepática e do remodelamento tecidual, mantendo dessa forma a integridade de matriz extracelular / It has been shown an hepatic injury following pancreatitis and a positive correlation with severity of the disease. Hypertonic Solution (HS) reduced morbidity and mortality in experimental pancreatitis. We hypothesize that hypertonic solution resuscitation of acute pancreatitis (AP) may exert antiinflammatory effects by modulating hepatic oxidative stress, apoptosis and matrix extracellular remodeling in liver. Wistar rats were divided in four groups: C- control animals not subjected to insult or treatment; NT- subjected to pancreatitis induction and receiving no treatment; NS- subjected to pancreatitis induction and receiving normal saline (0.9% NaCl); HSsubjected to pancreatitis induction and receiving hypertonic saline (7.5% NaCl). AP was induced by retrograde infusion of 2,5% sodium taurocholate into the pancreatic duct transduodenally. At 4, 12 and 24 h following pancreatitis induction, liver tissue samples were assayed in order to analyse expression of metalloproteinases (MMPs) -2 and -9, iNOS, collagens (type I and III), Heat Shock Proteins (HSPs) 47, 60, 70 and 90, caspases -2 and -7, APAF-1 and AIF, production of the cytokines TNF-, IL-1, IL-6 and IL-10, Nitrite/nitrate and ALT, Lipid peroxidation and formation of Nytrotirosine. Hypertonic solution resuscitation significantly modulates the oxidative stress in liver by reduction of iNOS gene expression (p<0,01 vs. NS), nitrite and nitrate levels (p<0,01 vs. NS), lipid peroxidation (p<0,05 vs. NT), ALT release (p<0,01 vs. NS) and peroxinitrite inhibition after 12 hours of pancreatitis induction. Consequently, the HSP70 production has not been activated due to the hypertonic solution effect in hepatic protection. At 4 h and 12 h, MMP-9 expression and activity increased in the NS and NT groups, although remaining at basal levels in the HS group (p<0.05 vs. past, pas). At 12 h, MMP-2 expression increased in the NS group (p<0.05 vs. c) but not in the HS group. At 4 h after pancreatitis induction, HSP47 expression increased in the NS and NT groups. Greater extracellular matrix remodelling occurred in the NS and NT groups than in the HS group, probably as a result of the hepatic wound-healing response to repeated injury. However, the collagen content in hepatic tissue remained at basal levels in the HS group. The proteins involved in apoptosis remained unchanged in all groups. Hypertonic saline is hepatoprotective, since it decreases oxidative stress in the critical time resulting in diminished liver damage, reducing hepatic remodelling, maintaining the integrity of the hepatic extracellular matrix during pancreatitis. Hypertonic saline-mediated regulation of MMP expression might have clinical relevance in pancreatitis-associated liver injury