Orientador: Daisy Maria Fávero Salvadori / Resumo: Atualmente, o procedimento mais utilizado para o tratamento das lesões coronarianas é a angioplastia com implante de stent. Embora existam vantagens com esse procedimento, a reestenose continua sendo um dos principais limitadores do sucesso terapêutico. Sabe-se que inflamação, com acúmulo de células mononucleares ativadas, pode contribuir para o desenvolvimento da reestenose. Assim, estratégias para a identificação de biomarcadores de risco e para a redução das taxas de reestenose representam desafios na área da cardiologia intervencionista. Desta forma, o presente estudo teve como objetivos a identificação de possíveis marcadores genéticos de risco (polimorfismo dos genes MMP-2, MMP-3, MMP-9 -1562, MMP-9 Arg 279 Gln, CYP2C19*2, NOS3 e IL-6), bem como a avaliação de eventos moleculares e bioquímicos (lesões oxidativas no DNA, perfil de expressão gênica e de citocinas) que possam estar envolvidos no desenvolvimento da reestenose. Foram avaliados 330 indivíduos, 220 pacientes coronarianos com e sem reestenose após implante de stent e 110 indivíduos controles (sem implante de stent e com obstrução coronariana menor que 20%). Os resultados mostraram aumento significativo de danos no DNA de células do sangue periférico nos pacientes com reestenose intra-stent, mas nenhuma alteração nos níveis plasmáticos de citocinas (IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, TNF-α). Com relação aos polimorfismos gênicos, os dados mostraram que o alelo G do gene MMP-9 (Arg279Gln) foi mais frequente nos pac... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

Venenos e outras secreções animais vêm sendo explorados como fonte de substâncias ativas na hemostasia em mamíferos. Esses princípios ativos, com funções primárias na alimentação e defesa, afetam elementos chave de quase todas as vias fisiológicas animais, tendo um enorme potencial como base para o desenvolvimento de novas drogas. No envenenamento ofídico, hemorragias locais e sistêmicas são causadas em grande parte pela ação de metaloproteinases hemorrágicas presentes nos venenos (SVMPs). Os estudos com metaloproteinases até então descritos baseiam-se principalmente em metodologias bioquímicas clássicas. Neste trabalho, as metaloproteinases e suas interações com outras proteínas são abordadas através de técnicas de dinâmica molecular, ressonância plasmônica de superfície e proteômica quantitativa. O perfil de inibição da atividade proteolítica de SVMPs por inibidores teciduais de metaloproteinases (TIMPs) foi avaliado. Experimentos de modelagem e dinâmica molecular mostraram similaridades nas bases moleculares da interação das TIMPs tanto com SVMPs quanto com metaloproteinases endógenas (MMPs e ADAMs), seus alvos fisiológicos. O domínio rico-em-cisteínas das SVMPs da classe PIII está envolvido na interação com proteínas de matriz extracelular. Os sítios de interação do domínio rico-em-cisteínas de jararragina com fator de von Willebrand (vWF) foram identificados por ressonância plasmônica de superfície. Um modelo de interação entre os domínios das duas proteínas foi proposto. Considerando a presença de domínios A de vWF em diversas proteínas de matriz extracelular, o domínio de rico-em-cisteínas funcionaria direcionando as metaloproteinases para substratos específicos, promovendo hemorragia. Além disso, através de uma metodologia de proteômica quantitativa, foi verificada pela primeira vez a ação proteolítica de metaloproteinases em proteínas de matriz extracelular íntegra de células em cultura. Já no envenenamento lonômico, um quadro clínico hemorrágico é observado apesar da ausência de metaloproteinases no veneno. O estudo de proteínas tóxicas da lagarta Lonomia obliqua baseia-se no isolamento e caracterização bioquímica dos princípios ativos relacionados com aspectos da patologia do envenenamento. Nos últimos anos, esses estudos se focaram em uma única secreção da lagarta, identificando o seu potencial pró-coagulante, fibrin(ogen)olítico, hemolítico, edematogênico e nociceptivo. Neste trabalho, foram identificadas diferenças quali-quantitativas em quatro secreções venenosas de L. obliqua. A diferente participação de cada uma dessas secreções durante o contato com as lagartas pode levar a grande variabilidade de sintomas e gravidade do acidente. Utilizando a metodologia de microarranjos de DNA, analisamos o efeito do veneno da lagarta no padrão de expressão gênica de células em cultura e identificamos a expressão aumentada de genes possivelmente relacionados ao quadro clínico do envenenamento. Proteínas potencialmente tóxicas de L. obliqua descritas em um estudo de transcriptoma, juntamente com os dados de expressão gênica aqui demonstrados possibilitam uma maior compreensão dos efeitos do veneno na hemostasia e sintomas do lonomismo. / Animal venoms and other secretions have been explored as source of active substances on the mammal hemostasis. These active principles, which have primary function in feeding and defense, act on key elements of almost all physiologic pathways and have an enormous potential in the development of new therapeutic drugs. In ophidic envenomations, local and systemic hemorrhages are caused mainly by the action of hemorrhagic metalloproteinases from the venom (SVMPs). Previous studies with metalloproteinases were based mostly in classical biochemical methodologies. Here, the metalloproteinases and their interactions with other proteins were examined by molecular dynamics, surface plasmon resonance and quantitative proteomics methodologies. The inhibition profile of the SVMPs proteolytic activity by tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs) was evaluated. Modeling and molecular dynamics procedures showed similarities in the molecular bases of the interaction of TIMPs both with SVMPS and endogenous metalloproteinases (MMPs and ADAMs). PIII SVMP cysteine-rich domain is involved in the interaction with extracellular matrix proteins. Using surface plasmon resonance, we identified the interaction sites between jararhagin cysteine-rich domain and von WIllebrand factor (vWF). An interaction model of these two proteins was proposed. Considering the presence of vWF A domains in several matrix proteins, the cysteine-rich domain probably works targeting the metalloproteinases to specific substrates, leading to hemorrhage. Moreover, using a quantitative proteomic approach, it was shown for the first time the metalloproteinases proteolytic action upon organized extracellular matrix proteins in culture cells. In lonomic envenomation, a hemorrhagic clinical profile is observed regardless the absence of metalloproteinases. The caterpillar's toxic proteins studies are based on isolation and biochemical characterization of active principles related to the patophisiology of the envenomation. In the last few years, these studies were focused on one caterpillar's secretion, containing pro-coagulant, fibrin(ogen)olytic, hemolytic, edematogenic and nociceptive activities. In this work, we identified quali-quantitative differences in four Lonomia obliqua venomous secretions. The different participation of each of these secretions during the accident could lead to the variability of symptoms and severity of the envenomation. Using a microarray methodology, we analyzed the effects of the caterpillar venom on the cultured cells gene expression profile and identified increased expression of genes possibly involved with the clinical manifestations. Potentially toxic proteins from L. obliqua identified in a transcriptome study, together with the gene expression data described here allow a better understanding of the venom effects in hemostasis during lonomism.

Venenos e outras secreções animais vêm sendo explorados como fonte de substâncias ativas na hemostasia em mamíferos. Esses princípios ativos, com funções primárias na alimentação e defesa, afetam elementos chave de quase todas as vias fisiológicas animais, tendo um enorme potencial como base para o desenvolvimento de novas drogas. No envenenamento ofídico, hemorragias locais e sistêmicas são causadas em grande parte pela ação de metaloproteinases hemorrágicas presentes nos venenos (SVMPs). Os estudos com metaloproteinases até então descritos baseiam-se principalmente em metodologias bioquímicas clássicas. Neste trabalho, as metaloproteinases e suas interações com outras proteínas são abordadas através de técnicas de dinâmica molecular, ressonância plasmônica de superfície e proteômica quantitativa. O perfil de inibição da atividade proteolítica de SVMPs por inibidores teciduais de metaloproteinases (TIMPs) foi avaliado. Experimentos de modelagem e dinâmica molecular mostraram similaridades nas bases moleculares da interação das TIMPs tanto com SVMPs quanto com metaloproteinases endógenas (MMPs e ADAMs), seus alvos fisiológicos. O domínio rico-em-cisteínas das SVMPs da classe PIII está envolvido na interação com proteínas de matriz extracelular. Os sítios de interação do domínio rico-em-cisteínas de jararragina com fator de von Willebrand (vWF) foram identificados por ressonância plasmônica de superfície. Um modelo de interação entre os domínios das duas proteínas foi proposto. Considerando a presença de domínios A de vWF em diversas proteínas de matriz extracelular, o domínio de rico-em-cisteínas funcionaria direcionando as metaloproteinases para substratos específicos, promovendo hemorragia. Além disso, através de uma metodologia de proteômica quantitativa, foi verificada pela primeira vez a ação proteolítica de metaloproteinases em proteínas de matriz extracelular íntegra de células em cultura. Já no envenenamento lonômico, um quadro clínico hemorrágico é observado apesar da ausência de metaloproteinases no veneno. O estudo de proteínas tóxicas da lagarta Lonomia obliqua baseia-se no isolamento e caracterização bioquímica dos princípios ativos relacionados com aspectos da patologia do envenenamento. Nos últimos anos, esses estudos se focaram em uma única secreção da lagarta, identificando o seu potencial pró-coagulante, fibrin(ogen)olítico, hemolítico, edematogênico e nociceptivo. Neste trabalho, foram identificadas diferenças quali-quantitativas em quatro secreções venenosas de L. obliqua. A diferente participação de cada uma dessas secreções durante o contato com as lagartas pode levar a grande variabilidade de sintomas e gravidade do acidente. Utilizando a metodologia de microarranjos de DNA, analisamos o efeito do veneno da lagarta no padrão de expressão gênica de células em cultura e identificamos a expressão aumentada de genes possivelmente relacionados ao quadro clínico do envenenamento. Proteínas potencialmente tóxicas de L. obliqua descritas em um estudo de transcriptoma, juntamente com os dados de expressão gênica aqui demonstrados possibilitam uma maior compreensão dos efeitos do veneno na hemostasia e sintomas do lonomismo. / Animal venoms and other secretions have been explored as source of active substances on the mammal hemostasis. These active principles, which have primary function in feeding and defense, act on key elements of almost all physiologic pathways and have an enormous potential in the development of new therapeutic drugs. In ophidic envenomations, local and systemic hemorrhages are caused mainly by the action of hemorrhagic metalloproteinases from the venom (SVMPs). Previous studies with metalloproteinases were based mostly in classical biochemical methodologies. Here, the metalloproteinases and their interactions with other proteins were examined by molecular dynamics, surface plasmon resonance and quantitative proteomics methodologies. The inhibition profile of the SVMPs proteolytic activity by tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs) was evaluated. Modeling and molecular dynamics procedures showed similarities in the molecular bases of the interaction of TIMPs both with SVMPS and endogenous metalloproteinases (MMPs and ADAMs). PIII SVMP cysteine-rich domain is involved in the interaction with extracellular matrix proteins. Using surface plasmon resonance, we identified the interaction sites between jararhagin cysteine-rich domain and von WIllebrand factor (vWF). An interaction model of these two proteins was proposed. Considering the presence of vWF A domains in several matrix proteins, the cysteine-rich domain probably works targeting the metalloproteinases to specific substrates, leading to hemorrhage. Moreover, using a quantitative proteomic approach, it was shown for the first time the metalloproteinases proteolytic action upon organized extracellular matrix proteins in culture cells. In lonomic envenomation, a hemorrhagic clinical profile is observed regardless the absence of metalloproteinases. The caterpillar's toxic proteins studies are based on isolation and biochemical characterization of active principles related to the patophisiology of the envenomation. In the last few years, these studies were focused on one caterpillar's secretion, containing pro-coagulant, fibrin(ogen)olytic, hemolytic, edematogenic and nociceptive activities. In this work, we identified quali-quantitative differences in four Lonomia obliqua venomous secretions. The different participation of each of these secretions during the accident could lead to the variability of symptoms and severity of the envenomation. Using a microarray methodology, we analyzed the effects of the caterpillar venom on the cultured cells gene expression profile and identified increased expression of genes possibly involved with the clinical manifestations. Potentially toxic proteins from L. obliqua identified in a transcriptome study, together with the gene expression data described here allow a better understanding of the venom effects in hemostasis during lonomism.

As metaloproteases (MPs) são proteínas que participam em diversos processos fisiológicos e patológicos. Neste trabalho, relatamos a identificação de MPs em três carrapatos de importância econômica: Ixodes persulcatus (Ip-MPs), Rhipicephalus sanguineus (Rs-MPs) e Rhipicephalus microplus (BrRm-MPs). O perfil transcricional em vários tecidos e fases de vida mostra que MPs são transcritas em glândula salivar durante a alimentação de fêmeas e não são transcritos no macho (com exceção de uma MP, BrRm-MP4) e ovos, o que sugere que esta família da proteínas são componentes funcionais necessários para interferir nas defesas do hospedeiro, apoiando o processo de hematofagia. A presença de um sítio de ligação de zinco, uma dobra“Met-turn” e um domínio rico em cisteína na região C-terminal indica que todas os transcritos obtidos codificam para a família de MPs reproplisina (metzincina). Uma das MPs de R. microplus (BrRm-MP4) foi selecionada para uma investigação mais aprofundada quanto ao potencial como um antígeno vacinal, devido ao seu padrão de transcrição ubíquos e devido àprevisão in silico de epítopos imunogênicos, em comparação com as demais MPs identificadas. BrRm-MP4 recombinante (rBrRm-MP4) foi expressa em Escherichia coli e testadas como um antígeno contra infestação de R. microplus. Imunoblot mostrou que o soro de bovinos imunizados com rBrRm-MP4 reconhece BrRm-MP4 da glândula salivar, ovário e larvas de R. microplus. Comparando com o controle, a vacinação com rBrRm-MP4 proporcionou uma redução de 43% no número de fêmeas adultas, redução de 14,80% na postura de ovos e redução de 17,53 % na capacidade de eclosão da larva, realizando um proteção total de 60% estatisticamente significativa. Os resultados indicam que rBrRm-MP4 é um potencial candidato a ser incluído como imunógeno em uma vacina anti-carrapato. / Metalloproteases (MPs) are proteins participating in several physiological and pathological processes. Here, we report the identification of MPs in three economically important ticks: Ixodes persulcatus (Ip-MPs), Rhipicephalus sanguineus (Rs-MPs) and Rhipicephalus microplus (BrRm-MPs). Transcriptional profile in various tissues and life stages revealed the presence of all MPs transcripts in salivary glands during feeding stages and absence in males (except one MP, BrRm-MP4) and eggs, suggesting this family proteins are functional components required to interfere with host defenses, supporting tick hematophagy. The presence of a zinc binding site, a “Met-turn” and C-terminal cysteine rich domain indicates all obtained transcripts encode for proteins belonging to the reproplysin (metzincin) family of MPs. A R. microplus MP (BrRm-MP4) was selected for further investigation concerning its potential as a vaccinal antigen due to its ubiquitous transcription pattern and in silico prediction of immunogenic epitopes, comparing to other obtained MPs. Recombinant BrRm-MP4 (rBrRm-MP4) was expressed in Escherichia coli and tested as an immune-protective antigen against R. microplus infestation. Immunoblot showed specific antibodies against rBrRm-MP4 in immunized calves sera. Sera from immunized calves recognized BrRm-MP4 in R. microplus salivary gland, ovary and larvae. Comparing to ticks reared non-vaccinated calves, rBrRm-MP4 provided 43% reduction in adult female number, 14.80% reduction in egg laying and 17.53% reduction in larva hatching capacity, performing an overall 60% statistically significant protection. We assume rBrRm-MP4 is a potential candidate to be included as immmunogen for further development in an anti-tick vaccine.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:13Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-11-22Bitstream added on 2014-06-13T19:21:38Z : No. of bitstreams: 1 magro_aj_dr_botib.pdf: 2025292 bytes, checksum: b5afa7c16b45283a5c3bb7bdf4d2a561 (MD5) / Neste trabalho foram realizados estudos estruturais experimentais e teóricos com a BthA-I e a BjussuMP-I, duas proteínas isoladas do veneno de Bothrops jararacussu. A proteína BthA-I é uma fosfolipase A2 (PLA2) ácida com elevada atividade catalítica e que possui a capacidade de inibir a agregação de plaquetas e reduzir a pressão arterial. Cristais da BthA-I nativa e de sua forma quimicamente modificada pelo pBPB (brometo de p-bromofenacila), um conhecido inibidor de a PLA2s que também é capaz de suprimir os mecanismos farmacológicos próprios desta proteína, foram obtidos e submetidos a experimentos de difração de raios-X. A estrutura cristalina da BthA-I foi elucidada a 1,9 Å de resolução e o processamento dos dados experimentais revelou a presença de dois monômeros na unidade assimétrica. A análise estrutural destes monômeros revelou que a BthA-I dimérica possui uma conformação oligomérica distinta das demais PLA2s, onde os sítios catalíticos da molécula encontram-se expostos ao solvente. Apesar das condições de cristalização da BthA-I nativa, é possível sugerir que a forma dimérica desta proteína seja aquela encontrada predominantemente in vivo. A determinação estrutural da BthA-I quimicamente modificada pelo pBPB a 1,85 Å de resolução revelou a presença inequívoca de moléculas de inibidor covalentemente ligadas aos resíduos His48, localizados nos sítios de ligação de substrato dos dois monômeros do complexo. Três regiões do complexo BthA-I/pBPB são estruturalmente alteradas pela ligação do inibidor: os loops de ligação de Ca++ e as regiões de β-wing C-terminais. Estas mudanças estruturais são provavelmente derivadas da conformação oligomérica apresentada pelo complexo, cuja disposição pode explicar a supressão das atividades farmacológicas da BthA-I... / In this work were performed experimental and theoretical structural studies with BthA-I and BjussuMP-I, two proteins from the venom of Bothrops jararacussu. BthA-I, a high catalytic acidic phospholipase A2 (PLA2) with platelet aggregation inhibition, anticoagulant and hypotensive properties, was crystallized in its native form and complexed to pBPB (p-bromophenacyl bromide), a well-known inhibitor of PLA2s which also abolishes the biochemical activities of this protein. The crystal structure of BthA-I native was solved at 1.9 Å and the data processing showed two monomers in the unit cell. A novel dimeric conformation of this native protein with the active sites of the monomers exposed to the solvent was observed. Despite of the conditions used in the crystallization experiments, it is possible to suggest that the dimeric form must be predominantly found in vivo. The structural determination of BthA-I chemically modified by pBPB at 1.85 Å revealed the unambiguous identification of inhibitor molecules covalently bound to residues His48 in the substrate-binding clefts of both monomers of the complex. Three regions of BthA-I/pBPB complex are structurally altered by the binding of the inhibitor: the Ca++ -binding loops, the β-wings and the C-terminal regions. These structural changes are probably derived from the oligomeric state presented by the complex, which could explain the abolition of pharmacological activities of the pBPB-chemically modified BthA-I. A residue present in the “pancreatic” loops (Lys69), which is usually related to the anticoagulant effect of the BthA-I, is in the dimeric interface of the complex, supporting this hypothesis regarding the abolition of this and other activities caused by pBPB. The theoretical BjussuMP-I catalytic domain, a P-III metalloprotease, was built through folding recognition... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissLTGS.pdf: 3281640 bytes, checksum: 5c9229f622076d2863caa1030e6ddbab (MD5) Previous issue date: 2004-04-23 / Financiadora de Estudos e Projetos / Metalloproteases are Zn++-dependent peptidase enzymes, richly found in Crotalidae and Viperidae snake venoms. Most snake venom metalloproteases (svMPs) are active on extracellular matrix components and this effect is thought to result in bleeding as a consequence of the basement membrane disruption in capillaries. Jararhagin is a hemorrhagic svMP from Bothrops jararaca venom. This enzyme has proteolytic activity on fibrinogen and fibronectin and inhibits collagen-induced platelet-aggregation in vitro. Its amino acid sequence corresponds to a N-terminal metalloprotease domain, a disintegrin-like and a C-terminal Cysteine-rich, being classified as a P-III snake venom metalloprotease (svMP). This work describes the expression, purification and successful refolding of the recombinant catalytic domain of jararhagin. The heterologous protein was produced in E.coli, an in vivo expression system that does not make post-translational modifications. The recombinant refolded protein did not show any hemorrhagic activity in mice skin, as well as, the native deglycosylated jararhagin. However, they preserved their proteolytic activity on fibrinogen and fibronectin. It seems that the hemorrhagic properties of these hemorrhagins are dependent on post-translational modifications, whereas their proteolytic activity is not completely dependent on such modifications. / As metaloproteases são enzimas peptidases dependentes de zinco. Estas proteínas são ricamente encontradas em venenos de serpentes Crotalidae e Viperidae. Muitas Metaloproteases de Venenos de Serpentes (svMPs) são ativas sobre componentes da Matriz Extracelular (MEC) e este efeito pode resultar em hemorragia como conseqüência da degradação da membrana basal nos capilares. A Jararagina é uma svMP hemorrágica proveniente do veneno da Bothrops jararaca. Esta enzima tem atividade proteolítica sobre fibrinogênio e fibronectina e inibe a agregação plaquetária induzida pelo colágeno in vitro. Sua seqüência de aminoácidos corresponde a um domínio metaloprotease N-terminal, um domínio tipo desintegrina e um domínio rico em cisteína C-terminal, sendo classificada como uma metaloprotease de veneno de serpente (svMP) de classe P-III. Este trabalho descreve a expressão, purificação e re-enovelamento do domínio catalítico da Jararagina. A proteína heteróloga foi produzida em E.coli, um sistema de expressão in vivo, que não faz modificações pós-traducionais. A proteína recombinante enovelada não mostrou atividade hemorrágica sobre pele de camundongo. O mesmo resultado foi obtido para a proteína nativa deglicosilada. Porém, tanto a proteína recombinante, quanto a proteína nativa, tinham sua atividade proteolítica preservada sobre fibrinogênio e fibronectina. Em conclusão, parece possível que a propriedade hemorrágica da Jararagina seja dependente de modificações pós-traducionais, enquanto que sua atividade proteolítica não dependa completamente de tais modificações.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:36:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3688.pdf: 6082954 bytes, checksum: f6fdd051724ed3aaef16251694cb2648 (MD5) Previous issue date: 2011-05-10 / Universidade Federal de Sao Carlos / Integrins are cell surface receptors that mediate cell adhesion and platelet aggregation, although they do part of important physiological processes in the organism, are also related pathologies such as tumorigenesis, metastasis and thrombosis. Thus integrins are important targets in development of drugs for the treatment of these diseases. Snake venoms metalloproteases (SVMPs) of PII and PIII class possessing a disintegrin domain, capable of binding to integrins inhibiting its activity, have been widely studied for this purpose. PII-SVMPs bind integrins via the RGD motif found in disintegrin domain. PIII-SVMPs have three domains: metalloprotease (M), disintegrin-like (D) with the ECD motif instead of RGD and 'Cysteine-rich' domain (C). PIII-SVMPs containing only DC domains are able to interact with integrins inhibiting cell adhesion and platelet aggregation. However it is not known which region of these molecules is involved in binding to integrins, and two regions are identified as likely responsible for integrin-ligand interactions: the motif ECD and a region called the hyper variable region (HVR) present in some PIII-SVMPs. The intention here was to assist the understanding of this interaction, assessing the importance of ECD motif present in disintegrin-like domain of Bothropasin, a PIIISVMP. For the three-dimensional structure of bothropasin, we have that in the ECD motif, aspartic residue (D) made a interaction with calcium ions, and cysteine (C) is involved in a disulfide bridge, but the glutamic acid (E) which is very reactive, is free to interact with other molecules. Thus, the proposal was to obtain a recombinant molecule consisting in the D and C domains of bothropasin (BDC) and a mutant molecule (BDC-ACD), where the glutamic residue of EDC motif present in disintegrin-like domain of BDC is replaced by a alanine residue. BDC-ACD, was obtained by PCR (Polymerase Chain Reaction) using the QuikChange@ Site-Directed Mutagenesis Kit, with the DNA template pGEX-4T-BDC and primers containing the desired mutation. The recombinant proteins were expressed in the soluble form in fusion with glutathione Stransferase protein. Purification of recombinants proteins was made in Glutathione Sepharose resin and the fusion proteins, immobilized on the resin were cleaved with enzyme thrombin. BDC and BDC-DCA were evaluated for their ability to inhibition of platelet aggregation which found that the mutation did not cause a significant change in protein activity, indicating that the glutamic residue of ECD motif is not involved in connection with integrins. Were also assayed for inhibition of adhesion of breast adenocarcinoma cells (MDA-MB- 231) to collagen and no inhibition was observed suggesting that, like the other PIII-SVMPs, BDC interact with α2 subunits of intergrins, which are not expressed in tested cells. / As integrinas são receptores de superfície celular capazes de mediar a adesão celular e a agregação plaquetária, que embora façam parte de importantes processos fisiológicos no organismo também estão relacionados a patologias como tumorogênese, metástase e trombose. Deste modo as integrinas constituem importantes alvos no desenvolvimento de drogas para o tratamento dessas doenças. Metaloproteases de venenos de serpentes (SVMPs) das classes PII e PIII por possuírem um domínio desintegrina, capazes de se ligar às integrinas inibindo sua atividade, têm sido amplamente estudadas com esse intuito. PIISVMPS se ligam as integrinas através do motivo RGD que se encontra no domínio desintegrina. PIII-SVMPs possuem três domínios: metaloprotease (M), tipo-desintegrina (D) que apresenta o motivo ECD invés de RGD, e rico em cisteína (C). PIII-SVMPs contendo apenas os domínios DC são capazes de interagir com integrinas inibindo adesão celular e agregação plaquetária. Contudo não se sabe qual região dessas moléculas está envolvida na ligação às integrinas, sendo que duas regiões são apontadas como prováveis responsáveis pela interação integrina-ligante: o motivo ECD e uma região denominada região hiper variável (HVR) presente em algumas PIII-SVMPs. Foi pretendido aqui colaborar para o entendimento dessa interação, avaliando a importância do motivo ECD do domínio tipo-desintegrina da Botropasina, uma PIII-SVMP. Pela estrutura tridimensional da botropasina, tem-se que no motivo ECD o resíduo aspártico (D) faz uma interação com íon cálcio, e a cisteína (C) está envolvida em uma ponte dissulfeto, porém o glutâmico (E) que é bastante reativo, encontra-se livre para interagir com outras moléculas. Assim, a proposta deste trabalho foi obter a molécula recombinante constituída pelos domínios D e C da botropasina (BDC), e também uma molécula mutante (BDC-ACD), onde o glutâmico do motivo EDC do domínio tipo-desintegrina da BDC foi substituído por um resíduo de alanina. BDC-ACD, foi obtida através de PCR (Reação da Polimerase em Cadeia) com a utilização do QuikChange@ Site-Directed Mutagenesis Kit, tendo como DNA molde pGEX-4T-BDC e primers contendo a mutação desejada. As proteínas recombinantes foram expressas na forma solúvel em fusão com a proteína glutationa S-transferase. A purificação das proteínas recombinantes foi feita em resina Glutathione Sepharose e as proteínas de fusão, imobilizadas na resina, foram clivadas com a enzima trombina. BDC e BDCACD foram avaliadas quanto a sua capacidade de inibição da agregação plaquetária onde foi verificado que a mutação realizada não alterou significativamente a atividade das proteínas, indicando que o glutâmico do Dissertação de Mestrado de Priscila Tomie Leme Ike vi motivo ECD não está envolvido na ligação com a integrina. Também foram realizados ensaios de inibição da adesão de células de adenocarcinoma da mama (MDA-MB-231) ao colágeno e não houve inibição da adesão celular sugerindo que, assim como outras PIII-SVMPs, a BDC possa interagir com subunidades α2 de intergrinas, que não estavam expressas nas células testadas.

Made available in DSpace on 2016-06-07T17:12:01Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-02-03. Added 1 bitstream(s) on 2016-06-07T17:16:33Z : No. of bitstreams: 1 000865423.pdf: 1848743 bytes, checksum: 5434932daa9880daa223b56bf1dbc009 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Os objetivos do presente estudo são: 1) Estudar o perfil inflamatório das lesões periapicais de dentes com infecções endodônticas primárias através dos níveis das citocinas inflamatórias: IL-1beta, IL-6, TNF-alfa; correlacionando com a presença de sintomatologia clínica; 2) Investigar os níveis das metaloproteinases [MMP-1, -2 e -9], inibidores de metaloproteinase [TIMP-1 e -2] e complexos MMP/TIMP [MMP1/TIMP1, MMP1/TIMP2, MMP2/TIMP1, MMP2/TIMP2, MMP9/TIMP1 e MMP9/TIMP2], presentes nos tecidos periapicais de dentes com infecções endodônticas primárias e lesão periapical; correlacionando com a presença de sintomatologia clínica e reabsorção óssea; 3) Correlacionar os níveis das citocinas inflamatórias [IL-1beta, IL-6 e TNF-alfa] e seus antagonistas [IL1-RA, IL6-RA, sTNF-R1], presentes nos tecidos periapicais; 4) Estudar a efetividade de diferentes medicações intracanal no controle do processo inflamatório periapical, através do monitoramento dos níveis de citocinas inflamatórias, [IL-1beta, IL-6, TNF-alfa], MMP's [MMP-1, -2 e -9], TIMP's [TIMP-1 e -2] e complexos [MMP1/TIMP1, MMP1/TIMP2, MMP2/TIMP1, MMP2/TIMP2 MMP9/TIMP1, MMP9/TIMP2] coletadas dos tecidos periapicais. Vinte dentes unirradiculares com necrose pulpar e lesão periapical foram selecionados. Após o preparo biomecânico (PBM) os dentes foram divididos aleatoriamente em 2 grupos de acordo com a medicação intracanal utilizada: Ca(OH)2+SSL [Ca(OH)2 + solução salina fisiológica]; e Ca(OH)2+CLX [Ca(OH)2 + clorexidina gel 2%]. Para a análise dos biomarcadores inflamatórios, foram realizadas coletas utilizando cones de papel estéril/apirogênico, ultrapassando 2 mm além ápice para obtenção do fluído intersticial. As coletas foram realizadas em dois momentos operatórios : coleta após PBM (Coleta inicial-CIF1) e coleta após 14 dias de medicação intracanal (Coleta final-CFF2). Citocinas... / The aim of this study was: 1) To investigate the inflammatory profile of apical periodontitis disease present in primarily infected root canals determined by the levels of inflammatory cytokines : IL-1beta, IL-6, TNF-alfa; and to correlate with the presence of clinical features; 2) To investigate the levels of metalloproteinases [MMP-1, -2, -9], metalloproteinase inhibitors [TIMP-1 e -2] ; complexes MMP/TIMP [MMP1/ TIMP1, MMP1/TIMP2, MMP2/TIMP1, MMP2/TIMP2, MMP9/TIMP1 e MMP9/TIMP2], present in apical peridontitis disease from teeth with primary endodontic infection; and to correlate with the presence of clinical features; 3) To correlate the levels of IL-1beta, IL-6, TNF-alfa with their respectively antagonists - IL1-RA, IL6-RA, s TNF-R1, all present in apical peridontitis; 4) To evaluate the effectiveness of different root canal medications in the inflammatory process by monitoring the levels of inflammatory cytokines [IL-1beta, IL-6, TNF-alfa], MMP's [MMP-1,-2,-9]; TIMP [TIMP-1 and -2] and complexes [MMP1/TIMP1, MMP1/TIMP2, MMP2/TIMP1, MMP2/TIMP2, MMP9/TIMP1 e MMP9/TIMP2] in apical periodontitis. Twenty patients with single-rooted teeth that had necrotic pulp and periapical periodontitis will be selected. After BMP teeth will be randonly devided into 2 groups according to the root canal medication selection: Ca(OH)2+SSL [Ca(OH)2 + Saline Solution]; e Ca(OH)2+CHX [Ca(OH)2 + chlorhexidine gel 2%]. Samples will be collected from intersticial fluid by using sterile/ apyrogenic paper points. Samples will performed at two diferente times: After chemomechaical preparation (S1) and after 14 of root canal medication (S2). Inflammatory cytokines, metalloproteinases and their antagonists will be dosage by ELISA-assay. The levels of inflammatory cytokines, metalloproteinases and their antagonists will be typed on a spreadsheet and statiscally analyzed by SPSS for Windows and Statistic packpage 9.0. ...

Made available in DSpace on 2016-07-01T13:10:29Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-09-12. Added 1 bitstream(s) on 2016-07-01T13:14:12Z : No. of bitstreams: 1 000866809.pdf: 1747343 bytes, checksum: 1bd62536c1ab61130611dd2e937d842f (MD5) / Os mecanismos envolvidos na remodelação cardíaca por sobrecarga de volume e o momento que a hipertrofia excêntrica apresenta prejuízo da função cardíaca são pouco conhecidos. Objetivos: a) Comparar alterações morfofuncionais, celulares (hipertrofia) e intersticiais (fibrose) em diferentes momentos da evolução da insuficiência aórtica; b) Verificar quais dos seguintes mecanismos estão envolvidos na remodelação cardíaca induzida pela IAo e em qual momento esta alteração acontece: alteração na metaloprotease 2 (MMP2) e do inibidor tecidual de metaloprotease 1 (TIMP1), alterações dos RNAs mensageiros específicos para a codificação das proteínas envolvidas na homeostase do cálcio (Fosfolambam, Ryr e Serca2a), alterações da expressão de proteínas fosfolambam e Serca2a do trânsito de cálcio. Casuística e Métodos: Estudo experimental com 64 ratos Wistar machos, 32 animais submetidos à insuficiência aórtica aguda (grupo IAo) e 32 animais a procedimento simulado (grupo Controle). Todos os animais foram seguidos com 1, 4, 8 e 12 semanas através de ecocardiogramas seriados e, após eutanásia, foram analisada morfometria do tecido cardíaco, atividade da MMP2 e TIMP-1, expressão gênica por Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real das proteínas do trânsito de cálcio, expressão das proteínas Serca2a e fosfolambam pela técnica Western Blot. A análise estatística foi efetuada pela ANOVA de dois fatores; o pós teste de Holm Sidak; teste t grupo a grupo; Anova de 1 via, complementada por Tukey; correção por Bonferroni; teste de correlação de Spearman e teste de correlação de Pearson. Em todos os casos, o nível de significância adotado foi p<0,05. Resultados: Observou-se, na primeira semana, que o peso do VE e a pressão diastólica foi maior no grupo IAo. Na quarta semana, MMP2, TIMP-1, iMVE e fração de colágeno foram maiores no grupo IAo. A área do miócito e DDVE foram maiores... / The mechanisms that are involved in cardiac remodeling by volume overload and the moment the eccentric hypertrophy has impaired cardiac function are largely unknown. Objectives: a) to compare morphological, cell (hypertrophy) and interstitial (fibrosis) changes at different times of the evolution of aortic regurgitation (AR); b) to analyze which of the following mechanisms are involved in cardiac remodeling induced by aortic failure and at what moment this change takes place: change in the metalloprotease 2 (MMP 2) and tissue inhibitor of metalloproteinase 1 (TIMP1); changes of messenger RNAs to code proteins involved in calcium homeostasis (phospholamban, Ryr and SERCA2a), changes in expression of phospholamban and SERCA2a in the calcium transit. Methods: Experimental study with 64 male Wistar rats, 32 animals submitted to acute aortic regurgitation (AR group) and 32 animals sham procedure (Sham group). All animals were followed with 1, 4, 8 and 12 weeks by serial echocardiography and after euthanasia, were analyzed morphometry of cardiac tissue, the activity of MMP2 and TIMP-1, gene expression by RT-PCR of calcium homeostasis protein, SERCA2a and phospholamban expression by Western Blotting. Statistical analysis was performed by two-way ANOVA; the Holm Sidak post test; t test group to group; Anova one way, complemented by Tukey; Bonferroni correction; Spearman correlation test and Pearson's correlation test. In all cases, the significance level was set at p <0.05. Results: In the first week it was observed that weight of the LV and diastolic blood pressure were higher in the AR group. In the fourth week, MMP 2, TIMP-1, and collagen fraction were higher in the AR group. The myocyte area and left ventricle diastolic diameter (LVDD) were higher in the AR group compared to the sham group, from the eighth week. At weeks 8 and 12, the wall thickness (WT) was higher in the AR group than the...

Orientadora: Sandra Helena Penha de Oliveira / Banca: Letícia Helena Theodoro / Banca: Ana Paula Campanelli / Resumo: A doença periodontal (DP) e o diabetes mellitus (DM) são doenças inflamatórias crônicas, e quando associadas aumentam a destruição da região periodontal. Por esta razão, o objetivo do nosso trabalho foi avaliar o papel do diabetes sobre o processo inflamatório, reabsorção óssea alveolar, produção de metaloproteinase de matriz (MMP), colágeno e TGF-β1 em camundongos com DP experimental. Foram utilizados 40 camundongos Balb/c machos de 18 - 22 g, distribuídos igualmente em 4 grupos, sendo estes, normal (N), normal com doença periodontal (N+DP), diabético (DM) e diabético com doença periodontal (DM+DP). O diabetes foi induzido por tratamento com estreptozotocina 200 mg/kg por via intraperitoneal. Passados 7 dias os índices glicêmicos foram verificados, e os animais foram considerados diabéticos quando a glicemia apresentava-se igual ou superior a 250 mg/dL. Posteriormente, os camundongos do grupo com DP foram submetidos a uma ligadura em torno dos primeiros molares inferiores, e no 15º dia, estes animais foram eutanasiados e as amostras foram coletadas para as análises seguintes. O tecido gengival marginal foi coletado para as análises de marcadores inflamatórios, tais como, níveis de CXCL2, CCL3 e TGF-β1 por ELISA, expressão gênica de MMP-2, MMP-9, TGF-β1 e col1a2 por RT-PCR em tempo real, e atividade enzimática de MMP-2 e MMP-9 por zimografia. Os parâmetros de reabsorção de osso alveolar, recrutamento de neutrófilos e quantificação de colágeno também foram avaliados, pelo ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Periodontal disease (DP) and diabetes mellitus (DM) are chronic inflammatory diseases that when associated increase destruction in the periodontal region. Then, the aim of our study was to evaluate the role of DM in inflammatory process, bone resorption, matrix metalloproteinase (MMP), collagen and TGF-β1 production during periodontal disease experimental in mice. Forty Balb/c mice 18-22 g were used, divided equally into 4 groups, normal (N), normal with periodontal disease (N+DP), diabetic (DM), diabetic with periodontal disease (DM+DP). The diabetes was induced by 200 mg/kg streptozotocin via intraperitoneal. After of 7 days the glycemic indices was evaluated, and animals were considered diabetics than blood glucose has become equal to or greater than 250 mg/dL. Mice of the DP group had a ligature around the first molars, and 15th day, the animals were euthanized and samples were collected for the following analyzes. The gingival tissue was collected to analysis inflammatory markers, such as CXCL2, CCL3 and TGF-β1 levels by ELISA; gene expression of MMP-2, MMP-9, TGF-β1 and col1a2 by real time RT-PCR; and MMP-2 and MMP-9 enzyme activity by zymography. The parameters of alveolar bone resorption, neutrophil recruitment and collagen quantification also were evaluated by histological processing of the hemimandibles, which showed significant difference in DM+DP group. Periodontal disease was able to increase CXCL2, CCL3 and TGF-β1 production, however only CXCL2 and CCL3 producti... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre